胡 賽，孫 成，劉素梅，賈付康，滿 云

(蚌埠學(xué)院，安徽 蚌埠 233030)

枯草芽孢桿菌生長迅速，營養(yǎng)需求簡單且在生長發(fā)育后期形成含水率低、抗逆性強的休眠體芽孢，是制備微生物菌制劑的理想形式?？莶菅挎邨U菌在添加到飼料時不僅不消耗飼料的營養(yǎng)，還能保持飼料的質(zhì)量，提高飼料利用率；進入畜禽腸道可迅速恢復(fù)活性發(fā)揮益生菌作用；能夠產(chǎn)生許多不同活性的酶類和多種氨基酸[1-3]。目前，響應(yīng)面分析法被廣泛應(yīng)用于食品、輕工、醫(yī)藥衛(wèi)生等多方面研究領(lǐng)域。本課題通過單因素和響應(yīng)面優(yōu)化實驗對飼用枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)條件進行，提高枯草芽孢桿菌發(fā)酵液菌密度及活菌數(shù)量[4-7]，為低成本生產(chǎn)飼用枯草芽孢桿菌提供數(shù)據(jù)支撐[8]。

1 實 驗

1.1 實驗材料

1.1.1 主要儀器

AB323電子天平，上海?？惦娮觾x器廠；YX-24HDD手提式壓力蒸汽滅菌器，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；PWT-P42B電熱恒溫培養(yǎng)箱，合肥華德利科學(xué)器材有限公司；SW-CJ-2FD潔凈工作臺，上海力辰邦西儀器科技有限公司；SW-CJ-2FO紫外可見分光光度計，上海博迅；DHZ-DA全溫振蕩培養(yǎng)箱，上海五相儀器儀表有限公司；DHG-9023A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海東麓儀器設(shè)備有限公司。

1.1.2 主要試劑與材料

葡萄糖，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨，上海盛思生化科技有限公司；酵母浸膏粉、牛肉浸膏粉，天津市光復(fù)精細化工研究所；瓊脂粉，上海展云化工有限公司。

供試菌種：蚌埠學(xué)院食品與生物工程學(xué)院實驗室提供。

固體培養(yǎng)基[9-10]：每1 L的蒸餾水加入牛肉浸膏0.5 g、蛋白胨15 g、氯化鈉5 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g。

液體培養(yǎng)基：每1 L的蒸餾水加入牛肉浸膏0.5 g、大豆蛋白胨15 g、氯化鈉5 g、葡萄糖20 g。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種分離純化

(1)菌液準(zhǔn)備：稱取0.1 g固體菌粉溶于100 mL無菌水中，備用。

(2)平板劃線：固體培養(yǎng)基，經(jīng)過121 ℃，20 min高壓滅菌鍋高壓滅菌后冷至不燙手后，在無菌操作臺內(nèi)進行倒平板，將(2)準(zhǔn)備好的菌液，用接種環(huán)蘸取菌液進行平板劃線，放入恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃)培養(yǎng)24 h。

1.2.2 制備種子液[11]

取平板劃線獲得的單一菌落接種于高壓滅菌121 ℃、20 min后液體培養(yǎng)基中進行搖床培養(yǎng)，搖床培養(yǎng)條件為35 ℃、180 r/min、24 h。取上述菌液1 mL加入9 mL無菌水，重復(fù)上述步驟獲得三個不同濃度梯度菌液，本實驗選擇的三個不同的稀釋倍數(shù)分別為103倍、104倍、105倍。

1.2.3 活菌計數(shù)

取不同培養(yǎng)條件下?lián)u床培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌菌液，進行梯度稀釋，分別取106、107、108三個不同梯度稀釋進行平板涂布，將涂布完成的平板用保鮮膜包裹防止染上雜菌，然后放入恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h，通過直接讀數(shù)法確定菌落數(shù)。

1.2.4 OD600值的測定

OD600值測定采用600 nm波長下的吸光度。菌液搖床培養(yǎng)24 h，每隔3 h測一次OD600，根據(jù)培養(yǎng)時間和OD600值的對應(yīng)關(guān)系，繪制菌株的生長曲線，便于后續(xù)實驗數(shù)據(jù)分析。

1.2.5 單因素試驗

(1)裝液量對枯草芽孢桿菌生長的影響

通過改變裝液量來探究溶氧量對枯草芽孢桿菌菌體生長和芽孢生成的影響。本實驗采用250 mL錐形瓶，研究表明搖瓶不同裝液量對枯草芽孢桿菌生長有明顯的影響，實驗采用30 mL、50 mL、70 mL、90 mL四種不同裝液量，35 ℃、180 r/min、pH 7、接種量6%進行搖床培養(yǎng)18 h，測定不同裝液量對搖床培養(yǎng)活菌數(shù)和OD值的影響，篩選出最佳裝液量。每個處理設(shè)置3次重復(fù)。

(2)起始pH值對枯草芽孢桿菌生長的影響[12]

根據(jù)OD600值確定枯草芽孢桿菌生長最佳起始pH值采用pH 5、pH 6、pH 7、pH 8四種不同起始pH值，35 ℃、180 r/min、裝液量50 mL、接種量6%進行搖床培養(yǎng)18 h，測定不同起始pH值對搖床培養(yǎng)活菌數(shù)和OD值的影響，篩選出最佳起始pH值。每個處理設(shè)置3次重復(fù)。

(3)接種量對枯草芽孢桿菌生長的影響[13]

接種量是影響發(fā)酵菌種生長繁殖速度的重要因子，過多或過少都不利于發(fā)酵進程的繼續(xù)。采用2%、4%、6%、8%四種不同接種量，35 ℃、180 r/min、裝液量50 mL、起始pH 7進行搖床培養(yǎng)18 h，測定不同接種量對搖床培養(yǎng)活菌數(shù)和OD值的影響，篩選出最佳接種量。每個處理設(shè)置3次重復(fù)。

(4)培養(yǎng)時間對枯草芽孢桿菌生長的影響

采用12 h、16 h、20 h、24 h四種不同培養(yǎng)時間35 ℃、180 r/min、裝液量50 mL、起始pH 7、接種量6%進行搖床培養(yǎng)，每隔一定時間測一次OD值同時進行一次稀釋平板涂布，測定不同培養(yǎng)時間對搖床培養(yǎng)活菌數(shù)和OD值的影響，篩選出最佳培養(yǎng)時間。每個處理設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.6 響應(yīng)面優(yōu)化培養(yǎng)條件試驗設(shè)計[14]

通過前期飼用枯草芽孢桿菌菌株菌體搖床培養(yǎng)條件優(yōu)化的單因素試驗，來篩選出對菌液生長相對明顯的因素作為 Plackett-Burman試驗的研究因子，采用design-expert-10軟件進行試驗設(shè)計及結(jié)果處理。實驗設(shè)計如表1所示。

表1 響應(yīng)面設(shè)計試驗因素水平表

2 結(jié)果與討論

2.1 分離純化結(jié)果

經(jīng)分離純化獲得的菌株如圖1所示，經(jīng)過多次實驗得出稀釋平板涂布最佳梯度稀釋倍數(shù)為106倍。

圖1 分離純化平板圖

2.2 裝液量對飼用枯草芽孢桿菌OD600值的影響

不同搖瓶裝液量對飼用枯草芽孢桿菌OD600值的影響試驗結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同裝液量與OD600值的對應(yīng)關(guān)系

由圖2可見，隨著裝液量的增加，發(fā)酵液菌體數(shù)量先上升后下降。當(dāng)250 mL搖瓶的裝液量為50 mL時，發(fā)酵液菌體OD600值最大，達到1.912。原因是液體含量越小，溶解氧系數(shù)越大。但當(dāng)液體的填充量太小，發(fā)酵過程中伴隨著水分的蒸發(fā)，活菌數(shù)量相應(yīng)減少。因此，選擇的裝液量為30 mL、50 mL、70 mL裝于250 mL錐形瓶中作為響應(yīng)面設(shè)計的三個水平。

2.3 起始pH值對飼用枯草芽孢桿菌OD600值的影響

不同起始pH值對飼用枯草芽孢桿菌OD600值的影響試驗結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同起始pH值與OD600值的關(guān)系

圖3可見，不同起始pH值情況下，飼用枯草芽孢桿菌OD600值變化呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢，當(dāng)初始pH值為7時，發(fā)酵液菌體OD600值達到最大，OD600值為1.912。初始pH值是發(fā)酵條件優(yōu)化的重要環(huán)節(jié)，適當(dāng)?shù)膒H值可以顯著提高發(fā)酵產(chǎn)量，pH值偏高或偏低都會導(dǎo)致細胞膜通透性的改變，從而會影響枯草芽孢桿菌對環(huán)境中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用。不同菌種的最適起始pH值不同，因此，選擇的起始pH值為6、7、8作為響應(yīng)面設(shè)計的三個水平。

2.4 接種量對飼用枯草芽孢桿菌OD600值的影響

不同接種量對飼用枯草芽孢桿菌OD600值的影響試驗結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同接種量與OD600值的對應(yīng)關(guān)系

圖4可見，接種量由2%增加到6%時；搖瓶培養(yǎng)18 h，發(fā)酵液菌體OD600值逐漸增大，6%時達到1.912；但當(dāng)接種量為8%時，發(fā)酵液菌體數(shù)量下降，原因可能是高接種量引起溶解氧的不足，從而影響菌體的生長代謝。接種量過多時，會引起溶解氧的不足，從而會抑制菌體的生長，菌株代謝產(chǎn)物的合成與積累也將受到抑制；接種量過少時，會使菌體的培養(yǎng)時間增長，降低發(fā)酵生產(chǎn)效率。因此，選擇的接種量為4%、6%、8%接種于250 mL錐形瓶中作為響應(yīng)面設(shè)計的三個水平。

2.5 響應(yīng)面優(yōu)化法在培養(yǎng)條件優(yōu)化中的應(yīng)用

根據(jù) Plackett-Burman 試驗篩選出顯著影響因素：裝液量(mL/mL，A)、接種量(%，B)、起始pH值(C)，以最陡爬坡試驗結(jié)果中最大響應(yīng)值所對應(yīng)的各因素水平為基準(zhǔn)，確定響應(yīng)面的中心點[15]。實驗設(shè)計如表2所示。實驗分析數(shù)據(jù)見表2在確定了最佳條件后，在此條件下進行三次平行驗證實驗，并結(jié)合實際條件確定了實際的最佳條件。響應(yīng)面試驗是基于最陡爬升試驗所選擇的中心點。響應(yīng)面試驗結(jié)果見表3。二次模型方差分析結(jié)果表明，R-Squared的值為0.963 0>0.9，并且Adj. R2的數(shù)值與R2接近，說明擬合分析值準(zhǔn)確可靠，采用中心組合設(shè)計進行優(yōu)化是可行的。PRESS小于0.05，說明組合模型具有差異顯著性。響應(yīng)面和等高線圖如圖6～圖11所示，自變量裝液量與起始pH值對OD值的交互影響對枯草芽孢桿菌活菌數(shù)和OD600的影響是顯著的。根據(jù)design-expert-10 軟件分析得出起始pH值為7、裝液量為50 mL/250 mL、接種量為6%，180 r/min搖床培養(yǎng)20 h可獲得最大活菌數(shù)2.89×109個。

表2 Box-Behnken 設(shè)計

表3 Box-Behnken設(shè)計回歸分析

2.5.1 裝液量與接種量對OD600值的交互影響

圖5可以看出不同裝液量和搖瓶接種量的之間有顯著影響。當(dāng)起始pH值不變時，隨著裝液量和搖瓶接種量的逐漸增加，枯草芽孢桿菌OD600(Y1)先上升后下降；在裝液量為50 mL左右時，搖瓶接種量為6%左右時，此時枯草芽孢桿菌OD600為最高。根據(jù)等高線可以分析得出，當(dāng)裝液量不變時，從搖瓶接種量的變化趨勢看時，可觀察到裝液量的等高線比較密集。表明裝液量相對于搖瓶接種量對OD600的影響較顯著。

圖5 裝液量與接種量相互影響的曲面圖及等高線圖

2.5.2 裝液量與起始pH值對OD600值的交互影響

圖6可以看出不同裝液量和起始pH值的之間有顯著影響。當(dāng)起始搖瓶裝液量不變時，隨著裝液量和起始pH值的逐漸增加，枯草芽孢桿菌OD600(Y1)先上升后下降；在裝液量為50 mL左右時，起始pH值為7左右時，此時枯草芽孢桿菌OD600為最高。根據(jù)等高線可以分析得出，當(dāng)裝液量不變時，從起始pH值的變化趨勢看時，可觀察到裝液量的等高線比較密集。同時起始pH值不變時，從裝液量的變化趨勢可以看出起始pH值的等高線比較密集，表明裝液量和起始pH值對OD600的影響都比較顯著。

圖6 裝液量與起始pH值相互影響的曲面圖及等高線圖

2.5.3 接種量與起始pH值對OD600值的交互影響

圖7可以看出不同搖瓶接種量和起始pH值的之間有顯著影響。當(dāng)起始搖瓶裝液量不變時，隨著裝液量和起始pH值的逐漸增加，枯草芽孢桿菌OD600(Y1)先上升后下降；在接種量為6%左右時，起始pH值為7左右時，此時枯草芽孢桿菌OD600為最高。根據(jù)等高線可以分析得出，當(dāng)起始pH值不變時，從搖瓶接種量的變化趨勢可以看出起始pH值的等高線比較密集，表明起始pH值相對于搖瓶裝液量對OD600的影響較顯著。

圖7 接種量與起始pH值相互影響的曲面圖及等高線圖

2.5.4 裝液量與接種量對活菌數(shù)交互影響

圖8可以看出不同裝液量和搖瓶接種量的之間有顯著影響。當(dāng)起始pH值不變時，隨著裝液量和搖瓶接種量的逐漸增加，枯草芽孢桿菌活菌數(shù)(Y2)先上升后下降；在裝液量為50 mL左右時，搖瓶接種量為6%左右時，此時枯草芽孢桿菌活菌數(shù)為最高。根據(jù)等高線可以分析得出，當(dāng)裝液量不變時，從搖瓶接種量的變化趨勢看時，可觀察到裝液量的等高線比較密集。表明裝液量相對于搖瓶接種量對活菌數(shù)的影響較顯著。

圖8 裝液量與接種量相互影響的曲面圖及等高線圖

2.5.5 裝液量與起始pH值對活菌數(shù)交互影響

圖9可以看出不同裝液量和起始pH值的之間有顯著影響。當(dāng)起始搖瓶裝液量不變時，隨著裝液量和起始pH值的逐漸增加，枯草芽孢桿菌活菌數(shù)(Y2)先上升后下降；在裝液量為50 mL左右時，起始pH值為7左右時，此時枯草芽孢桿菌活菌數(shù)為最高。根據(jù)等高線可以分析得出，當(dāng)裝液量不變時，從起始pH值的變化趨勢看時，可觀察到裝液量的等高線比較密集。同時起始pH值不變時，從裝液量的變化趨勢可以看出起始pH值的等高線比較密集，表明裝液量和起始pH值對活菌數(shù)的影響都比較顯著。

圖9 裝液量與起始pH值相互影響的曲面圖及等高線圖

2.5.6 接種量與起始pH值對活菌數(shù)交互影響

圖10可以看出不同搖瓶接種量和起始pH值的之間有顯著影響。當(dāng)起始搖瓶裝液量不變時，隨著裝液量和起始pH值的逐漸增加，枯草芽孢桿菌活菌數(shù)(Y2)先上升后下降；在接種量為6%左右時，起始pH值為7左右時，此時枯草芽孢桿菌活菌數(shù)為最高。根據(jù)等高線可以分析得出，當(dāng)起始pH值不變時，從搖瓶接種量的變化趨勢可以看出起始pH值的等高線比較密集，表明起始pH值相對于搖瓶裝液量對活菌數(shù)的影響較顯著。

圖10 接種量與起始pH值相互影響的曲面圖及等高線圖

3 結(jié) 論

本研究采用單因素優(yōu)化確定幾種不同影響因素最佳值，然后采用Box-Benhnken 設(shè)計的方法，并且利用design-expert-10 軟件進行設(shè)計分析，是分析優(yōu)化飼用枯草芽孢桿菌培養(yǎng)條件的有效途徑[17]。結(jié)合搖瓶裝液量、接種量和初始pH值三個主要因素，利用響應(yīng)面法建立了芽孢桿菌液體發(fā)酵產(chǎn)孢的擬合數(shù)學(xué)模型，方程如下：

以O(shè)D值為響應(yīng)值的二次方程：

以活菌數(shù)為響應(yīng)值的二次方程：

優(yōu)化后得到搖床培養(yǎng)最佳條件為：接種量6%、裝液量50 mL/250 mL、起始pH值為7、溫度35 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min。此條件下獲得活菌數(shù)和OD600值為最高，活菌數(shù)達2.89×109；OD600值達1.936。本實驗研究的飼用枯草芽孢桿菌搖床培養(yǎng)條件優(yōu)化，對后續(xù)菌種保藏上架都有一定的參考價值。因此，發(fā)酵工藝參數(shù)的優(yōu)化和改進的研究還有待于進一步開展。