吳 宙， 周麗青， 遲長鳳， 吳 彪， 孫秀俊，劉志鴻， 趙 丹， 于 濤， 鄭言鑫

(1. 浙江海洋大學，國家海洋設施養(yǎng)殖工程技術研究中心，海洋生物種質發(fā)掘與利用國家地方聯(lián)合實驗室，浙江 舟山 316022；2. 中國水產科學研究院黃海水產研究所，農業(yè)農村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室，山東 青島 266071；3. 中國水產科學研究院長島增殖實驗站，山東 煙臺 265800)

皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai)屬腹足綱(Gastropoda)前鰓亞綱(Prosobranchia)原始腹足目(Archaeogastropoda)鮑科(Haliotidae)鮑屬(Haliotis)，自然分布于朝鮮半島、日本北部以及我國山東半島、遼東半島沿海[1-2]，屬于北方冷水物種。皺紋盤鮑具有很高的經(jīng)濟價值與營養(yǎng)價值，有“海洋軟黃金”之稱，是我國一種重要的水產養(yǎng)殖貝類。

在20世紀50年代，我國皺紋盤鮑的捕撈量超100 t，捕撈量過大使得自然資源遭受嚴重破壞，至70年代捕撈量僅有20～30 t。為恢復皺紋盤鮑資源，其人工繁殖、育苗、增殖放流試驗也隨之展開[3-4]，并取得突破性進展，至20世紀90年代，我國開展了皺紋盤鮑“南北接力”的養(yǎng)殖試驗，將北方培育的皺紋盤鮑苗種于11月運輸至福建海區(qū)養(yǎng)殖，到次年5月再運回北方養(yǎng)殖，成功避免了皺紋盤鮑稚鮑在北方寒冷的冬季因水溫過低生長緩慢、死亡率高和在南方水域夏季溫度過高導致大量死亡的風險。20世紀90年代后期到2010年，皺紋盤鮑種群雜交技術的突破及應用推動了我國皺紋盤鮑養(yǎng)殖產業(yè)重心南移至福建省，“北鮑南養(yǎng)”使得皺紋盤鮑人工養(yǎng)殖產業(yè)得到迅速發(fā)展[3]，也成為我國鮑魚養(yǎng)殖的主要品種。

人工養(yǎng)殖與選育的進程會在一定程度上影響物種遺傳多樣性水平，或改變其原有的遺傳結構，甚至使群體發(fā)生顯著的遺傳分化。張國范等[5]利用皺紋盤鮑中國群體和日本野生群體進行單自交與單正反雜交獲得了4個F1家系，通過RAPD分析發(fā)現(xiàn)兩個雜交組合家系的雜合度均高于自交組合，推測雜交產生雜種優(yōu)勢，使其遺傳多樣性水平有所提高。高祥剛等[6]采用AFLP標記技術對國內雌性皺紋盤鮑與日本野生雄性皺紋盤鮑雜交的F1群體遺傳結構進行了研究，發(fā)現(xiàn)其遺傳多樣性水平顯著高于日本野生群體，認為群體間的雜交可以有效提高遺傳多樣性。李莉等[7]通過微衛(wèi)星標記分析發(fā)現(xiàn)，皺紋盤鮑養(yǎng)殖群體遺傳多樣性低于野生群體，但仍處于較高水平，認為選用野生皺紋盤鮑個體與遺傳距離較大的個體作為親本，可避免因近親交配而導致的遺傳多樣性下降。Li等[8]利用7個微衛(wèi)星標記，同樣發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性顯著低于野生群體，且各群體之間發(fā)生顯著的遺傳分化，認為親鮑數(shù)量少且雄雌性別比例低是造成養(yǎng)殖群體遺傳變異顯著減少的原因。

微衛(wèi)星標記技術具有特異性PCR擴增、多態(tài)性豐富、突變量高、遵循孟德爾共顯性遺傳等特點[9]，因此近年來我國研究人員主要采用微衛(wèi)星標記的方法來研究皺紋盤鮑群體遺傳多樣性[10-12]，但開發(fā)新的微衛(wèi)星標記存在工作繁瑣、費時、成本高等缺點[9]。而目前國內尚未見有基于線粒體DNA標記手段研究皺紋盤鮑群體遺傳結構和遺傳多樣性比較詳盡的相關報道。線粒體DNA (mtDNA)具有母系遺傳、進化速率快、分子簡單、幾乎不發(fā)生重組等特點，已被廣泛應用于群體遺傳學、生物系統(tǒng)發(fā)育研究[9,13-14]。其中mtDNA細胞色素C氧化酶亞基(COⅠ)基因和細胞色素b (Cytb)基因進化速率適中，適合種群水平基因差異檢測，是研究群體遺傳結構、遺傳多樣性的理想標記[15-18]。本研究采集了我國南北沿海6個皺紋盤鮑群體樣本，基于COⅠ、Cytb基因序列分析了各群體皺紋盤鮑的遺傳結構與遺傳多樣性，為評估我國皺紋盤鮑遺傳資源以及研究養(yǎng)殖模式對遺傳結構的影響提供了科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

6個群體的皺紋盤鮑分別于2020年8月—2021年3月取自福建漳州(ZZ)、遼寧大連(DL)、山東榮成(RC)及長山列島的南隍城島(NH)、砣磯島(TJ)、大欽島(DQ)。其中ZZ群體為洋下群體，長期定殖于漳州，屬累代養(yǎng)殖群體；DL群體為大連繁育至蓬萊越冬群體，屬非累代養(yǎng)殖群體；RC群體為養(yǎng)殖公司繁育群體，屬累代養(yǎng)殖群體；NH群體為累代養(yǎng)殖群體；TJ群體養(yǎng)殖方式為吊籠養(yǎng)殖，成長到一定規(guī)格后即全部售出，屬非累代養(yǎng)殖群體；DQ群體為野生群體，6個皺紋盤鮑群體采樣信息見表1?；铙w鮑采集至實驗室解剖，取肌肉組織液氮速凍后置于?80 °C超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。本實驗嚴格按照中國水產科學研究院實驗動物的護理和使用指南開展。

表1 皺紋盤鮑采樣信息Tab. 1 Sampling information of H. discus hannai

1.2 DNA提取、PCR擴增與測序

取皺紋盤鮑肌肉組織，采用酚-氯仿抽提法進行DNA提取。提取完畢后以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測、Gene finder染色，成像系統(tǒng)觀察與拍照，并利用NanoDrop Lite超微量分光光度計測量DNA的濃度與純度。取質量較好的DNA部分稀釋至50 ng/μL，置于?80 °C超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)皺紋盤鮑線粒體基因序列(登錄號：EU595789.1)，利用Primer 3軟件進行COⅠ、Cytb基因引物設計并交由北京擎科生物科技股份有限公司青島分公司進行測序分析。引物序列分別為COⅠ-F：(5′-TTCTGACTCCTCCCACCATC-3′)；COⅠ-R:(5′-GCGAATACGGCTCCTATTGA-3′)；Cytb-F：(5′-CGTGAATTATGGGTGGCTCT-3′)；Cytb-R：(5′-AGTAAACACACGCCCAATCC-3′)。PCR反應體系：2×TaqPlus Master Mix Ⅱ 25 μL，正反引物各2 μL，DNA模板濃度50 ng/μL，取1 μL，補充ddH2O至總體積為50 μL。PCR反應程序：95 °C預變性3 min，30個循環(huán)，每個循環(huán)包括95 °C變性15 s、58 °C退火20 s、72 °C延伸1 min，最后徹底延伸5 min。擴增產物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，成像系統(tǒng)觀察、拍照，選擇具有單一明亮條帶的PCR產物原液，交由北京擎科生物科技股份有限公司青島分公司純化、測通。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有序列均用Chromas 2.33軟件觀察峰圖、校對數(shù)據(jù)，將有雜峰、雙峰的樣品重新測序。利用Bioedit 7.0.5軟件對所有序列進行序列比對、剪切。利用DNAsp 5.10軟件[19]計算核苷酸變異位點、單倍型數(shù)、各群體單倍型多樣性(haplotype diversity，Hd)、核苷酸多樣性(nucleotide diversity，π)、平均核苷酸差異指數(shù)k (mean pairwise difference)等遺傳多樣性參數(shù)。利用MEGA 6.06[20]以紅鮑(H. rufescens)、新西蘭鮑(H. iris)為外類群，通過鄰接法(Neighbor-joining，NJ)構建皺紋盤鮑各單倍型的系統(tǒng)發(fā)育樹。利用Arlequin 3.5軟件[21]進行AMOVA[22]方差分析，分析皺紋盤鮑群體間遺傳變異情況，采用分化固定指數(shù)(Fst)以1 000次重抽樣檢驗方法來評估兩兩群體間的遺傳分化程度。利用Popart 1.7軟件[23]構建單倍型網(wǎng)絡圖。

2 結果

2.1 COⅠ基因序列結果分析與遺傳多樣性

PCR產物經(jīng)純化、測序、序列比對、剪切后得到730 bpCOⅠ基因部分序列?；谘芯康?個群體259個個體的COⅠ基因序列中，發(fā)現(xiàn)堿基A、T、C、G比例為28.56%、31.05%、23.60%、16.79%。A+T堿基含量為59.61%，C+G堿基含量40.39%，具有明顯的A+T堿基偏倚性。此外，共發(fā)現(xiàn)48個變異位點，堿基變異比例為6.6%。其中單一信息位點13個，簡約信息位點35個。變異類型均為轉換，無堿基的顛換、插入與缺失。

在259個個體中，共定義了30種單倍型，其中優(yōu)勢單倍型為Hap2、Hap3，分別占個體總數(shù)的17.4%、33.2%。Hap2、Hap3、Hap6為6個群體共有單倍型，Hap8、Hap11為DL群體特有單倍型，Hap15為ZZ群體特有單倍型，Hap17～19為NH特有單倍型，Hap20、Hap21為DQ特有單倍型，Hap25～30為TJ群體特有單倍型。TJ群體的單倍型種類最多(18個)，RC群體的單倍型種類最少(6個)。以紅鮑、新西蘭鮑為外類群和所有檢測的單倍型構建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1，結果顯示，兩外群的基因分布在NJ樹的最末端，30個單倍型廣泛分散在NJ樹的各個分支，僅砣磯島群體的單倍型Hap25獨立為一支，可以明顯看出單倍型與地理群體間不存在明確的對應關系。構建的單倍型網(wǎng)絡圖見圖2，其與NJ發(fā)育樹呈現(xiàn)了相同的結果，但在圖中可以明顯看出，不同單倍型之間具有顯著的堿基差異。

圖1 皺紋盤鮑COⅠ基因序列構建的NJ進化樹及在6個群體中的分布Fig. 1 Neighbor-joining phylogenetic tree of COⅠ haplotypes and their distribution in 6 populations of H. discus hannai

圖2 皺紋盤鮑線粒體COⅠ基因單倍型網(wǎng)絡圖Fig. 2 Network diagram of COⅠ haplotypes in H. discus hannai

皺紋盤鮑6個群體COⅠ基因的遺傳多樣性參數(shù)見表2，6個群體總體的Hd(0.586～0.897)、π(0.005 6～0.008 1)處于較高水平，其中TJ群體的Hd(0.897±0.028)與π(0.008 1±0.000 8)均為最高，NH群體的Hd(0.586±0.093)最低，DL群體π(0.005 6±0.000 6)最低，總體呈現(xiàn)高單倍型多樣性與高核苷酸多樣性的特征。

表2 基于COⅠ基因序列皺紋盤鮑6個群體的遺傳多樣性指數(shù)Tab. 2 Genetic diversity indices of six populations in H. discus hannai based on COⅠ gene sequence

群體間分化指數(shù)Fst值見表3，大部分群體間的分化指數(shù)達到了顯著性水平(P＜0.05)，僅DL與TJ群體、DQ與NH群體之間的Fst未達到顯著性水平(P＞0.05)，表明絕大多數(shù)群體間均存在遺傳分化。RC群體與其余5個群體的分化指數(shù)范圍為0.166 5～0.316 7；均達到高程度遺傳分化，ZZ與TJ之外的4群體為中等程度及以上遺傳分化(Fst：0.055 6～0.203 9)，其余群體兩兩間的遺傳分化均為低度分化(Fst＜0.05)。

表3 基于COⅠ基因皺紋盤鮑6個群體間的分化指數(shù)FstTab. 3 The Fst value in six populations of H. discus hannai based on COⅠ gene sequence

由AMOVA分析可知，將6個群體均歸為一個組群進行分析時，群體間的遺傳變異占總變異的12.05%，群體內的遺傳變異占總變異的87.95%，表明遺傳變異主要來源于群體內，并且群體間遺傳分化達到極顯著水平(Fst=0.120 5，P＜0.01) (表4)。

表4 基于COⅠ基因序列皺紋盤鮑6個群體分子變異分析(AMOVA)Tab. 4 Analysis of molecular variance (AMOVA) of all 6 populations of H. discus hannai based on COⅠ gene sequence

2.2 Cytb基因序列結果分析與遺傳多樣性

經(jīng)序列比對、剪切后同樣得到730 bp的Cytb基因部分序列。6個群體皺紋盤鮑的A、T、C、G組成比例分別為20.27%、40.2%、16.95%、22.58%。A+T出現(xiàn)頻率為60.47%，C+G的出現(xiàn)頻率為39.53%。同COⅠ基因類似，表現(xiàn)出明顯的A+T堿基偏向性。共發(fā)現(xiàn)59個變異位點，其中單一信息位點21個，簡約信息化位點38個。變異類型均為轉換，無堿基的顛換、插入與缺失。

皺紋盤鮑259個個體中，共檢測到了32個單倍型。其中優(yōu)勢單倍型為Hap2、Hap3，并為6個群體共有，出現(xiàn)頻率分別為16.21%、33.20%，單倍型Hap9、Hap12僅在DL群體出現(xiàn)過1次，Hap17～22僅在NH群體出現(xiàn)過1次，Hap23僅在DQ群體出現(xiàn)過1次，Hap27～32僅在TJ群體出現(xiàn)了1次。其中TJ群體擁有最多的單倍型(19個)，RC群體擁有最少的單倍型(7個)?；贑ytb基因以紅鮑、新西蘭鮑為外類群和所有檢測的單倍型構建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3，構建的單倍型網(wǎng)絡圖見圖4，結果與基于COⅠ基因構建的NJ樹、單倍型網(wǎng)絡圖基本一致。

圖3 皺紋盤鮑Cytb基因序列構建的NJ系統(tǒng)樹及在6個群體中的分布Fig. 3 Neighbor-joining phylogenetic tree of Cytb haplotypes and their distribution in 6 populations of H. discus hannai

圖4 皺紋盤鮑線粒體Cytb基因單倍型網(wǎng)絡圖Fig. 4 Network diagram of Cytb haplotypes in H. discus hannai

基于6個皺紋盤鮑Cytb基因序列分析得到的遺傳多樣性參數(shù)見表5，6個群體總體的Hd(0.605～0.909)和π(0.007 7～0.012 0)均處于較高水平。其中TJ群體Hd、π參數(shù)為6個群體中最高，分別為0.909±0.028、0.012 0±0.001 0，RC群體的Hd最低(0.605±0.084)，DL群體的π最低(0.007 7±0.000 9)。與COⅠ基因序列分析結果一致，總體呈現(xiàn)出高單倍型多樣性與高核苷酸多樣性的特征。

表5 基于Cytb基因序列皺紋盤鮑6個群體的遺傳多樣性指數(shù)Tab. 5 Genetic diversity indices in six populations of H. discus hannai based on Cytb gene sequence

由群體間的分化指數(shù)Fst值可知，除了DL與NH、DQ，DQ與NH、TJ群體間的遺傳分化未達到顯著水平之外(P＞0.05)，其余群體間的遺傳分化均達到了顯著水平(P＜0.05) (表6)。RC與其他群體(除TJ群體外)間的分化指數(shù)范圍為0.303 0～0.382 5，均達到了極高程度遺傳分化。ZZ與NH群體、 RC與TJ群體的分化指數(shù)分別為0.178 4、0.171 6，達到了高程度遺傳分化。ZZ與DL、NH，TJ與NH群體的分化指數(shù)范圍為0.063 1～0.132 3，達到中等的遺傳分化程度，其余各群體間均為低程度遺傳分化。

表6 基于Cytb基因序列皺紋盤鮑6個群體間的分化指數(shù)FstTab. 6 The Fst value of six populations in H. discus hannai based on Cytb gene sequence

AMOVA分析結果見表7，同COⅠ基因分析，將6個群體的皺紋盤鮑列為同一組群進行分析時，群體間遺傳變異占總變異的14.89%，群體內的遺傳變異占總變異的85.11%。結果表明主要的遺傳變異來自于群體內，群體間的遺傳分化達到極顯著水平(Fst=0.148 9，P＜0.01)。

表7 基于Cytb基因序列皺紋盤鮑6個群體分子變異分析(AMOVA)Tab. 7 Analysis of molecular variance (AMOVA) of all the 6 populations of H. discus hannai based on Cytb gene sequence

3 討論

3.1 6個皺紋盤鮑群體遺傳多樣性

物種的遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，是物種生存和發(fā)展的前提，豐富的遺傳多樣性有助于提升其適應環(huán)境變化的能力與進化潛力[24]。單倍型多樣性指數(shù)與核苷酸多樣性指數(shù)越高，代表物種的遺傳多樣性越豐富。本研究基于Cytb基因序列分析得到的遺傳多樣性參數(shù)較COⅠ基因高，認為這是由于Cytb進化速率較快所導致，這與柔魚(Ommastrephes bartramii)[15]、波紋唇魚(Cheilinus undulatus)[25]、北方磷蝦(Meganyctiphanes norvegica)[26]等研究的結果一致。6個群體皺紋盤鮑具有高單倍型多樣性與高核苷酸多樣性的特征，Grant等[27]認為這是因為群體由大而穩(wěn)定的種群構成，并擁有較長進化歷史或者是不同遺傳背景的種群二次接觸造成的，本研究認為主要由以下2個原因導致：①皺紋盤鮑喜生活在水質清澈、水流暢通、富含海藻的幾米至幾十米深的巖礁上，其活動能力較弱，難以憑自身的移動能力與其他地域較遠的種群進行基因交流。而近三十年來的皺紋盤鮑養(yǎng)殖模式已經(jīng)發(fā)生巨大改變，從早期的“南北接力養(yǎng)殖”到現(xiàn)在的“北鮑南養(yǎng)”，皺紋盤鮑人工養(yǎng)殖的重心已經(jīng)移至南方，這些養(yǎng)殖模式都加強了皺紋盤鮑不同群體間的基因交流，使各群體的遺傳多樣性指數(shù)都處于較高水平。②皺紋盤鮑北鮑南移養(yǎng)殖的成功，進一步提升了其環(huán)境適應能力，另外皺紋盤鮑性成熟年齡相對較短(3年)，這些特性可能對群體的快速生長、新變異的保存、維持自身的高單倍型多樣性具有一定作用[28]。因此，大規(guī)模的北鮑南養(yǎng)對我國皺紋盤鮑的遺傳結構起到優(yōu)化調整的作用，使該物種遺傳多樣性指數(shù)提高，相應的適應能力也得到充分鍛煉，這對種質資源的開發(fā)利用具有積極的意義。

通常情況下，野生群體的群體遺傳多樣性指數(shù)會高于養(yǎng)殖群體，而DQ作為野生群體，其遺傳多樣性指數(shù)比個別養(yǎng)殖群體低。前人在利用RAPD、AFLP標記技術進行相關研究時，也出現(xiàn)了養(yǎng)殖群體遺傳多樣性高于野生群體的情況，推測是由于兩個在遺傳上有一定隔離的群體經(jīng)過雜交之后獲得了雜種優(yōu)勢，使其后代群體的遺傳多樣性升高[5-6]。在同屬于累代養(yǎng)殖的群體中，NH、RC群體的單倍型多樣性與核苷酸多樣性都相對較低，推測這兩個累代養(yǎng)殖群體均發(fā)生了近交衰退，使遺傳多樣性呈下降趨勢，但是ZZ群體卻仍保持著相對較高的遺傳多樣性，對于這種現(xiàn)象，后續(xù)還需以現(xiàn)有的群體樣本通過其他標記方法獲得更多的遺傳數(shù)據(jù)，以作進一步的遺傳分析。

3.2 群體遺傳結構與遺傳分化

由COⅠ、Cytb基因的群體間Fst值、AMOVA分析結果，發(fā)現(xiàn)大部分群體間存在顯著遺傳分化現(xiàn)象。由單倍型網(wǎng)絡圖可知，單倍型之間存在較大的堿基差異，是使得Fst和AMOVA計算出較高遺傳分化的原因。存在較大差異的單倍型可能代表皺紋盤鮑養(yǎng)殖重心南移前的各個野生群體。由于鮑的幼體和成體隨海流遷移的能力有限，群體間基因交流少，經(jīng)過長時間的種群繁衍，群體中的優(yōu)勢單倍型與其他群體間的堿基差異逐漸增大，最終形成了群體間差異顯著的單倍型。而皺紋盤鮑的大規(guī)模北鮑南移養(yǎng)殖人為地將差異較大的單倍型帶入不同群體中，進而形成了本研究中的實驗結果。

RC與其他所有群體間存在較高程度的遺傳分化，除TJ之外，ZZ與其他所有群體均存在中度以上遺傳分化。由于RC群體每年都會選育性狀優(yōu)良的皺紋盤鮑作為親本繼續(xù)繁育后代，而ZZ群體為洋下群體，長期定殖于漳州，其遺傳背景較為復雜且也經(jīng)過長期的選育，可能RC、ZZ群體與其他養(yǎng)殖群體的選育條件不同，導致群體發(fā)生了顯著的遺傳分化，也從側面說明了人工選育對皺紋盤鮑不同群體的遺傳分化有重要影響，這與張儀方[29]的研究結果一致。Li等[8]也證實了除人工選育外，養(yǎng)殖環(huán)境中的人工選擇和自然選擇也可能改變了養(yǎng)殖群體的總體等位基因組成；另外在育苗過程中采用的親本數(shù)量過少，群體容易產生遺傳漂變，使群體發(fā)生不同程度遺傳分化[30-32]。DL、NH與DQ群體兩兩間為低度分化或者無分化，推測這3個群體的皺紋盤鮑均位于渤海灣內，地理位置接近，不同群體間的基因交流相對比較密切，從而降低了群體間的遺傳分化。

（作者聲明本文無實際或潛在的利益沖突）