王印庚， 于永翔， 蔡欣欣， 張 正， 王春元， 廖梅杰，李 彬， 榮小軍， 朱洪洋， 戴 巖

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室，海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室，山東 青島 266071；2. 連云港海洋源水產(chǎn)開發(fā)有限公司，江蘇 連云港 222199)

凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)生長速率快、耐高溫、抗病力強，是我國對蝦養(yǎng)殖的優(yōu)良品種，同時也是世界養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的3種優(yōu)良蝦種之一[1]。隨著對蝦養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展和不規(guī)范運作，在對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中細菌病、病毒病、寄生蟲病等病害問題日趨嚴重，其中細菌性病害發(fā)生區(qū)域廣、發(fā)病問題復(fù)雜、病原種類繁多，嚴重制約著對蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展[2-4]。對蝦白便綜合征(white feces syndrome，WFS)在對蝦養(yǎng)殖區(qū)頻發(fā)，發(fā)病率高、傳染性強，給世界范圍內(nèi)對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失[5-6]。WFS的典型癥狀主要包括蝦塘表面漂浮有細長、白色略帶黃色、有黏性、易腐敗且有惡臭散發(fā)的棉線狀蝦便，患病對蝦表現(xiàn)出肝胰臟萎縮變小、后腸變白、腸內(nèi)充滿白色至金棕色物質(zhì)以及甲殼松散等癥狀。

目前，國內(nèi)外關(guān)于對蝦WFS發(fā)病癥狀、流行特點、病原病理、預(yù)防治療以及對蝦腸道微生物群落相關(guān)變化已有諸多報道[7-10]。但目前對于WFS的病因仍存在認知不統(tǒng)一的問題，當前研究主要集中在兩種觀點：一種認為WFS是由病原菌感染引起的細菌性疾病，并與天氣突變、水質(zhì)惡化、餌料霉變、藍藻暴發(fā)、消化機能受損等外界因素相關(guān)，現(xiàn)已報道的病原菌有霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、溶藻弧菌(V. alginolyticus)、河流弧菌(V. fzuvialis)和大腸桿菌(Escherichia coli)等[11-12]。另一種認為WFS是由蝦肝腸胞蟲(Enterocytozoon hepatopenaei，EHP)感染引起[13-14]。同時，水生生物疾病的發(fā)生是由環(huán)境因子、病原微生物和宿主自身免疫能力綜合作用的結(jié)果[15]。養(yǎng)殖環(huán)境變化往往是疾病發(fā)生的誘因，環(huán)境因子的變化影響病原體生存代謝及宿主的免疫力，是病害發(fā)生發(fā)展的重要調(diào)控因素，同時環(huán)境因子和生物因素的變化也會影響微生物群落結(jié)構(gòu)組成變化[16]。目前，對于綜合分析對蝦WFS病原、宿主自身免疫力、水體環(huán)境菌群結(jié)構(gòu)變化的研究還鮮有報道，而在對蝦養(yǎng)殖實踐中，整個養(yǎng)殖系統(tǒng)中的各種因子復(fù)雜多變，所以從生產(chǎn)實踐中進行WFS發(fā)生相關(guān)病因的研究更具有重要意義[17]。

本研究以池塘養(yǎng)殖凡納濱對蝦為對象，通過持續(xù)采集典型池塘養(yǎng)殖模式下的水質(zhì)指標、可培養(yǎng)細菌、對蝦機體免疫指標，并結(jié)合宏基因組測序技術(shù)等分析方法，綜合解析對蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)實踐中WFS發(fā)生前后的水體環(huán)境、微生物、蝦體自身免疫能力和養(yǎng)殖水體菌群結(jié)構(gòu)的變化情況，深入分析WFS發(fā)生與各類因子的相互關(guān)系及其關(guān)聯(lián)特性。相關(guān)研究結(jié)果為解析WFS的發(fā)生機制提供數(shù)據(jù)支撐和參考，并為WFS的臨床防控奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本實驗選取河北黃驊某池塘養(yǎng)殖的患有典型WFS的凡納濱對蝦進行持續(xù)性跟蹤研究，同步采集同批次放苗且養(yǎng)殖管理條件相同的同場區(qū)內(nèi)健康養(yǎng)殖池塘為對照。池塘面積均為3.33 hm2，水深1.3～1.5 m，放苗密度為30 尾/m2。實驗池塘對蝦為75日齡左右，體長(10±2) cm，體重(10.0±1.5) g，每日早晚各投喂1次顆粒飼料，投喂量為對蝦體重的3%；患病池塘和健康池塘均未添加外源投入品；采樣頻率為隔日1次，健康組樣品編號為C1、C2、C3、C4和C5，患病組樣品編號為D1、D2、D3、D4和D5。實驗過程中操作人員嚴格遵守實驗動物福利倫理和動物實驗安全規(guī)范，并按照中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所動物實驗倫理委員會制定的規(guī)章制度執(zhí)行。

1.2 樣品采集

環(huán)境氣候因子 每日上午7:00利用YSI水質(zhì)檢測儀對實驗和健康蝦池內(nèi)3個位點的溫度、鹽度、pH、溶解氧等參數(shù)進行采集，并對餌料投喂、進排水、外源投入品等信息加以調(diào)查記錄，同時依據(jù)中國氣象網(wǎng)(http://www.cma.gov.cn/)公布的信息，對實驗區(qū)域內(nèi)的天氣、溫度等信息進行觀察記錄。

水樣采集 使用采水器分別取患病和健康對蝦養(yǎng)殖池塘內(nèi)3個不同位點的水樣2 L，其中1 L水樣使用無菌紗絹過濾，去除水中較大顆粒性雜質(zhì)，并經(jīng)0.22 μm無菌纖維素濾膜抽濾后，將濾膜凍存于?80 °C冰箱用于高通量測序分析，剩余水樣用于可培養(yǎng)細菌檢測。

蝦樣采集 在患病和健康養(yǎng)殖池塘內(nèi)的3個不同位點通過撒網(wǎng)隨機捕撈對蝦30尾，測定對蝦總重量，并觀察患病對蝦比例。每個池塘隨機選取10尾對蝦置于塑料桶內(nèi)，充氧運輸至實驗室進行樣品處理與分析。

1.3 蝦體和水體中可培養(yǎng)細菌檢測

隨機選取5尾鮮活凡納濱對蝦，剪取約0.2 g對蝦肝胰腺組織，混勻后加入500 μL無菌1.5%NaCl溶液進行研磨，向研磨均勻的肝胰腺組織勻漿內(nèi)繼續(xù)加入4.5 mL無菌1.5% NaCl溶液，并通過10倍梯度稀釋至10?2和10?3，吸取100 μL稀釋液分別涂布于TSB和TCBS固體培養(yǎng)基內(nèi)，28 °C培養(yǎng)24 h后觀察記錄并計算肝胰腺內(nèi)可培養(yǎng)細菌和弧菌總量，每個樣品3組平行。吸取100 μL池水原液和10倍稀釋液涂布于TSB和TCBS固體培養(yǎng)基內(nèi)，28 °C培養(yǎng)24 h后觀察記錄并推算水體中可培養(yǎng)細菌和弧菌總量，每個樣品3組平行。

1.4 免疫酶活性檢測

隨機選取5尾鮮活凡納濱對蝦，剪取0.1 g對蝦肌肉組織，混勻后加入0.9 mL無菌0.9% NaCl溶液進行冰水浴研磨，將研磨均勻的組織勻漿置于4 °C、4 000 r/min條件下離心10 min后取上清液。參照商品免疫酶活試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司)測定方法對患病和健康養(yǎng)殖池塘對蝦肌肉中的堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、溶菌酶(LZM)、超氧化物歧化酶(SOD)和酚氧化酶(PO)活性進行檢測，每個樣品3組平行。

1.5 高通量測序分析

采用環(huán)境樣本DNA提取純化試劑盒(FastDNA?Spin Kit for Soil, MP Biomedicals)對10份水樣濾膜總DNA進行提取，以16SrDNA基因V3～V4可變區(qū)特異性引物進行擴增，每份樣品設(shè)立3個生物學(xué)重復(fù)，PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，檢測合格后純化回收產(chǎn)物，委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，使用Miseq PE300/NovaSeq PE250平臺對檢測合格的純化回收產(chǎn)物進行建庫測序分析。

1.6 數(shù)據(jù)分析

用Mothus結(jié)合Excel軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析，并通過SPSS 13.0軟件通過單因素方差分析(One-Way ANOVA)對數(shù)據(jù)進行分析，使用Duncan氏檢驗進行多重比較，P＜0.05表示差異顯著。使用QIIME計算每個樣本物種的α多樣性指數(shù)和門屬水平的相對豐度圖，基于Bray-Curtis非相似性進行主坐標分析(principal coordinates analysis，PCoA)，使用R語言vegan包中冗余分析(RDA分析)和作圖。

2 結(jié)果

2.1 養(yǎng)殖池塘環(huán)境理化因子變化分析

患病組和健康組池塘環(huán)境理化因子波動趨勢相似，健康組氣溫、水溫、DO、pH和鹽度波動范圍分別為23.0～27.0 °C、26.4～29.0 °C、4.26～5.56 mg/L、8.39～8.73、40～43。患病組氣溫、水溫、DO、pH和鹽度波動范圍分別為23.0～27.0 °C、26.1～28.7 °C、5.1～6.08 mg/L、8.41～8.67、44～49。其中患病組DO和鹽度比健康組高，水溫和pH差異不大(表1)。

表1 健康組和患WFS組池塘環(huán)境理化因子檢測信息表Tab. 1 Physical and chemical environment information of WFS pond and control pond

2.2 蝦體和水體中可培養(yǎng)細菌變化分析

通過對蝦體和水體中可培養(yǎng)細菌含量進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)健康組對蝦肝胰腺內(nèi)可培養(yǎng)細菌和弧菌含量分別為1.19×105～7.70×105和8.80×103～1.96×104CFU/g，弧菌占比2%～16%，弧菌占比處于較低水平。水體可培養(yǎng)細菌和弧菌含量為5.00×104～5.50×104CFU/mL和1.70～4.10×103CFU/mL，弧菌占比5%～34% (表2)。

表2 水體和蝦體肝胰腺組織中可培養(yǎng)微生物檢測信息表Tab. 2 Culturable bacteria information in pond water and shrimp hepatopancreas

與健康組相比，患病組池塘凡納濱對蝦肝胰腺內(nèi)可培養(yǎng)細菌、弧菌含量及占比普遍較高，數(shù)量分別為3.80×105～2.51×106CFU/g和2.02×105～1.49×106CFU/g，弧菌占比55%～70%，患病組蝦體肝胰腺內(nèi)弧菌數(shù)量比健康組高出1～2個數(shù)量級(15～113倍)；水體可培養(yǎng)細菌和弧菌含量分別為3.40×103～6.7×104CFU/mL和1.00×103～5.00×103CFU/mL，弧菌占比為2%～67%，在可培養(yǎng)細菌含量和弧菌占比方面與健康組間未形成數(shù)量級別差異。

2.3 免疫酶活性變化分析

凡納濱對蝦免疫酶活性分析表明，AKP、ACP、LZM、SOD和PO等5種免疫酶活性的變化范圍在健康組分別為1.21～5.64、9.17～15.25、3.56～7.43、4.83～6.70及3.10～4.55 U/mg。在患病組分別為2.12～5.39、19.22～26.96、19.73～26.85、3.00～4.14及7.76～9.21 U/mg。兩組之間的ACP、LZM和PO等3種酶活性差異較大，同一天采樣測試結(jié)果對比，患病組比健康組高出1～5倍；AKP、SOD等2種酶活性差異不大，波動幅度較小。結(jié)合凡納濱對蝦健康狀況分析表明，凡納濱對蝦機體ACP、LZM、PO與WFS發(fā)生的相關(guān)性較強(表3)。

表3 凡納濱對蝦肌肉組織免疫酶活性檢測信息表Tab. 3 Immune enzyme activity in muscle of L. vannamei U/mg

2.4 高通量測序結(jié)果

通過對實驗周期內(nèi)健康組(C1、C2、C3、C4、C5)，患病組(D1、D2、D3、D4、D5)共10組樣品進行高通量測序，獲得的樣本原始序列總數(shù)為1 695 662，為避免由于測序深度不同造成的偏差，每個樣品隨機選取，均一化至34 423條有效序列進行后續(xù)分析，經(jīng)質(zhì)控和優(yōu)化后共得到1 032 690條有效序列。將一致性在97%以上的序列聚類成一個分類操作單位(OTU)，共獲得1 877個OTUs。10組樣品的OTU數(shù)量范圍為684～810個，其中健康組和實驗組共有OTU 254個，特有OTU為41、34、43、41、62和82、54、38、90、56個。

對10組樣品的OTU進行物種注釋，構(gòu)建α多樣性指數(shù)的稀釋曲線圖和指數(shù)圖(圖1)，分析可知，隨著測序序列的增加，序列所對應(yīng)樣本的Shannon多樣性指數(shù)曲線逐漸趨于平緩。樣本測序覆蓋率均在99.3%上，表明樣品中序列未被檢測的概率極低，測序數(shù)據(jù)合理充分，有效測序數(shù)量已經(jīng)能夠較好地覆蓋菌群多樣性(表4)。

圖1 水體微生物在OTU水平的Shannon稀釋曲線(a)和Coverage指數(shù)圖(b)Fig. 1 Shannon dilution curve (a) and Coverage dilution index (b) at OTU level

表4 水體微生物的α多樣性指數(shù)分析Tab. 4 α - diversity index of microorganisms in pond water

2.5 白便綜合征發(fā)生與水體微生物群落α多樣性變化分析

α多樣性指數(shù)分析表明，Ace、Chao、Shannon和Simpson指數(shù)在健康組分別為811.05～913.72、727.32～881.81、3.98～4.08和0.036～0.046；在患病組分別為752.37～1 066.23、723.14～893.59、3.71～4.88和0.034～0.064 (表4)。健康組池塘水體中微生物群落豐富度指數(shù)Ace和Chao隨時間變化整體呈升高的趨勢(P＜0.05)；患病組池塘水體中群落豐富度指數(shù)Ace和Chao指數(shù)波動幅度較大，整體呈下降趨勢(P＜0.05)，且數(shù)值多高于健康組。

健康組池塘水體中有關(guān)微生物群落多樣性指數(shù)Shannon隨時間呈現(xiàn)一定升高趨勢，Simpson指數(shù)無顯著差異(P＞0.05)；患病組中Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)波動幅度較明顯，均表現(xiàn)差異顯著(P＜0.05)，且Shannon指數(shù)數(shù)值多低于健康組，Simpson指數(shù)多高于健康組。

基于Bray Curtis法在OTU水平上對10組樣品間的群落差異進行主成分分析(PCoA)。結(jié)果顯示，所有細菌群落主要沿第一軸分布，健康組和患病組的細菌群落結(jié)構(gòu)差異明顯，按照健康狀況聚類，2個主坐標分別解釋43.21%和21.4%的群落差異。健康組內(nèi)樣品(C1～C5)之間距離均相距較近，但和患病組間相距較遠，表明組內(nèi)樣品之間群落組成較相似，組間群落組成差異性較大；患病組間樣品(D1～D5)菌群結(jié)構(gòu)離散程度隨著疾病的發(fā)生逐漸拉大。此外，每個樣本的3個平行之間距離相近，群落結(jié)構(gòu)相似，表明每個樣品的重復(fù)性足夠好，能夠充分支撐樣品中微生物群落的相關(guān)分析結(jié)果(圖2)。

圖2 水體微生物群落結(jié)構(gòu)的主坐標分析(PCoA，基于Bray-Curtis距離)Fig. 2 Principal coordinate analysis of microbial community structure (PCoA, based on Bray Curtis distance)

2.6 白便綜合征發(fā)生與水體微生物群落結(jié)構(gòu)組成變化分析

通過對Miseq PE300/NovaSeq PE250平臺所得有效序列在不同分類水平上進行物種注釋和統(tǒng)計分析，所得有效數(shù)據(jù)共注釋到35門609個屬(圖3)。在門水平上(相對豐度＞0.2%)，健康和患病水體中主要菌群為放線菌門(Actinomycetota)、擬桿菌門(Bacteroidota)、藍藻門(Cyanobacteria)和變形菌門(Proteobacteria)，其相對豐度在健康組分別為32.59%～40.42%、17.28%～29.25%、17.13%～26.71%和11.87%～14.49%；在患病組分別為25.97%～50.33%、14.75%～32.38%、7.50%～32.03%和13.55%～20.28%。隨著患病周期延長，患病組中放線菌門、變形菌門相對豐度顯著降低(P＜0.05)，擬桿菌門、藍藻門相對豐度顯著升高(P＜0.05)，γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)無顯著變化。健康組中菌群結(jié)構(gòu)整體在門水平相對豐度均未有顯著差異(P＞0.05)，其中α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)含量顯著高于患病組(表5)。

圖3 水體微生物群落結(jié)構(gòu)組成在門(a)和屬(b)分類水平上的Circos圖小半圓(左半圈)表示樣本中物種組成情況，外層彩帶的顏色代表的是來自某一分組，內(nèi)層彩帶的顏色代表物種，長度代表該物種在對應(yīng)樣本中的相對豐度；大半圓(右半圈)表示該分類學(xué)水平下物種在不同樣本中的分布比例情況，外層彩帶代表物種，內(nèi)層彩帶顏色代表不同分組，長度代表該樣本在某一物種中的分布比例。Fig. 3 Circos diagram of microbial community structure at phylum and genus levelsThe small semicircle (left semicircle) represents the species composition, the outer ribbon represents the grouping, the inner ribbon represents the species,the length represents the relative abundance of the species in the corresponding sample; the large semicircle (right semicircle) represents the distribution proportion of species in different samples at the taxonomic level, and the outer ribbon represents the species, the inner ribbon represents different groups,and the length represents the distribution proportion of the sample in a species.

表5 池塘水體微生物群落在門和科、屬水平上的相對豐度信息Tab. 5 Relative abundance information of microbial community at phylum, family and genus level in ponds%

在屬、科水平上，10組中排名較高的優(yōu)勢菌群為聚球藻菌屬(Synechococcus)、腈基降解菌科(Nitriliruptoraceae)、PeM15、腐敗螺旋菌科(Saprospiraceae)、DS001、巴紐爾斯菌科(Balneolaceae)、Llumatobacteraceae、藍藻屬(Cyanobium)、微桿菌科(Microbacteriaceae)。其中患病組中聚球藻屬、PeM15、腐螺菌科(Saprospiraceae)、巴紐爾斯菌科、藍藻屬顯著降低，DS001、Llumatobacteraceae和微桿菌科(Microbacteriaceae)相對豐度顯著升高，腈基降解菌科無顯著變化；健康組中腈基降解菌科、DS001、微桿菌科相對豐度顯著降低，其他菌群無顯著變化(表5)。

2.7 水體微生物菌群組成與環(huán)境因子和生物因子的RDA分析

為了探究水體微生物群落組成與生物因子及非生物因子之間的關(guān)系，對微生物群落組成進行降趨對應(yīng)分析(DCA)，發(fā)現(xiàn)第1軸長度梯度為1.380 1，小于3，特征值為0.179 2，因此選用線性模型冗余分析(RDA分析)。采用Monte Carlo置換檢驗，即用permutest函數(shù)對T、DO、pH、鹽度(Sat)、蝦體細菌(SB)、蝦體弧菌(SV)、水體細菌(WB)、水體弧菌(WV)等8個因子進行分析，共篩選出DO、Sat、SB、SV、WB等5個具有顯著解釋性的環(huán)境因子(P＜0.05)。

RDA分析結(jié)果顯示，軸1和軸2的解釋貢獻率分別為43.00%和15.95%，共累計解釋了樣本微生物群落空間分異的58.95%。與軸1相關(guān)性較強的因子主要有WB、Sat，其相關(guān)系數(shù)分別為–0.999 6和0.761 0，而與軸2相關(guān)性較強的因子為SV、SB、DO，相關(guān)系數(shù)分別為0.972 8、0.855 1和0.716 8。患病組D1、D2、D3水體樣本群落分布與DO、Sat呈顯著正相關(guān)，主要是OTU1213和OTU336豐度分布受到影響；患病組D4、D5與SV、SB、WB呈顯著正相關(guān)，主要是OTU630豐度分布受到影響。健康組水體樣本主要是OTU59豐度分布受WB顯著影響，進而影響水體微生物群落分布(圖4)。RDA分析結(jié)果顯示，軸1和軸2共累計解釋了微生物門類群落空間分異的61.03%。放線菌門和變形菌門類群與DO、Sat呈顯著正相關(guān)，擬桿菌門和藍藻門類群與SV、SB、WB呈顯著正相關(guān)(圖4)。

圖4 基于不同水平的水體微生物群落組成與環(huán)境因子的RDA分析(a) OTU水平的RDA分析，(b) 門水平的RDA分析；紅色箭頭表示影響因子，藍色箭頭表示優(yōu)勢OTU或門類群。Fig. 4 RDA analysis of microbial community composition and environmental factors(a) RDA on OTU level, (b) RDA on phylum level; the red arrows indicate the influencing factors, and the green arrow indicates the dominant OTU group or phylum group.

3 討論

水體中的pH、DO、溫度、鹽度等環(huán)境因子對蝦類生長、發(fā)育、繁殖有著重要的調(diào)控作用[18]。研究表明，WFS的發(fā)生與天氣突變、養(yǎng)殖水質(zhì)和底質(zhì)惡化有較大的關(guān)系[19]。但本研究發(fā)現(xiàn)，凡納濱對蝦池塘養(yǎng)殖模式下患病組與健康組池塘內(nèi)pH、DO、溫度、鹽度波動趨勢相似，水溫和pH區(qū)別不大，只有DO和鹽度比健康組高。自然環(huán)境中pH、DO、溫度、鹽度受環(huán)境氣候和水源情況的影響較大，由WFS發(fā)生導(dǎo)致的環(huán)境因子的變化可能被弱化，進而未檢測出明顯的環(huán)境理化因子差異。對蝦體內(nèi)和養(yǎng)殖水體的細菌變化特別是弧菌豐度的增加是導(dǎo)致對蝦病害暴發(fā)的主要原因之一?；【罅繑U增及環(huán)境惡化是導(dǎo)致WFS發(fā)生的重要原因[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，患病組對蝦肝胰腺內(nèi)可培養(yǎng)細菌和弧菌總量普遍比健康組高，其中弧菌數(shù)量比健康組高15～113倍，符合對蝦WFS的病原為弧菌的特征。AKP、LZM、ACP、SOD、PO等非特異性免疫酶活性常被用作衡量凡納濱對蝦免疫能力的重要指標[20]。多項研究表明，對蝦機體免疫酶活性會在外界環(huán)境因子、病原因子的作用下發(fā)生變化[21-23]。本研究表明，患病組對蝦肌肉的ACP、LZM、PO等3種酶活性明顯高于健康組，而AKP、SOD等2種酶活性在兩組間差異性不大，波動幅度也較小。說明病原等外界刺激可能會調(diào)動機體自身的免疫酶活性而產(chǎn)生一定的免疫保護反應(yīng)。

菌群結(jié)構(gòu)組成與多樣性很大程度上影響著養(yǎng)殖動物健康，已有研究發(fā)現(xiàn)，Ace、Chao和Shannon指數(shù)越高，Simpson指數(shù)越低，菌群豐度和多樣性越高[24-25]。疾病發(fā)生后，穩(wěn)定的微生物群落結(jié)構(gòu)被改變，多樣性降低[26]。吳金鳳等[27]通過對凡納濱腸道及其水體微生物多樣性研究表明，患病對蝦腸道多樣性均低于健康組，且差異顯著。本研究結(jié)果表明，患病組Shannon指數(shù)數(shù)值多低于健康組，Simpson指數(shù)多高于健康組，但差異不明顯，這和郁維娜等[28]關(guān)于患病對蝦腸道多樣性均低于健康組但差異不顯著的研究結(jié)果一致。健康組池塘水體中Ace、Chao、Shannon指數(shù)隨時間變化整體呈升高的趨勢(P＜0.05)，患病組中則呈降低趨勢，且患病組池塘水體中Ace、Chao指數(shù)在患病初期的數(shù)值多高于健康組，分析原因可能是患病池塘初始的水體微生物群落多樣性高于健康組，但隨著WFS的持續(xù)，整體呈下降趨勢。物種注釋和統(tǒng)計分析結(jié)果表明，水體菌群組成在健康組和患病組池塘水體中優(yōu)勢種類相同，但組成比例變化存在顯著差異。與健康組池塘水體細菌組成相比，患病組中放線菌門、變形菌門相對豐度降低，擬桿菌門、藍藻門相對豐度顯著升高(P＜0.05)。健康組中菌群結(jié)構(gòu)整體在門水平的相對豐度均未有顯著差異(P＞0.05)。Xue等[29]通過研究凡納濱對蝦育苗期水體菌群結(jié)構(gòu)特征發(fā)現(xiàn)，苗池水體菌群主要以變形菌門和擬桿菌門、放線菌門為主。黃雪敏等[30]通過對健康與發(fā)病對蝦池水中菌群結(jié)構(gòu)比較發(fā)現(xiàn)，發(fā)病池水中放線菌門豐度顯著低于健康池水。李盧國等[31]和吳越等[32]通過對水體微生物菌群分析發(fā)現(xiàn)，關(guān)于養(yǎng)殖水體的好壞與變形菌門菌群豐度存在正相關(guān)，表明水體菌群結(jié)構(gòu)組成變化特征對對蝦WFS發(fā)生具有一定的指示作用。

水體微生物的群落結(jié)構(gòu)組成與水質(zhì)環(huán)境因子和生物因素的變化密不可分[33]。閆蘇蘇等[34]通過對長壽湖浮游植物功能群季節(jié)變化與環(huán)境因子的關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)，透明度、水溫、電導(dǎo)率、光照強度、溶解氧和總氮是影響長壽湖浮游植物功能群變化的主要環(huán)境因子，鄭誠等[35]通過對四明湖浮游植物群落結(jié)構(gòu)的季節(jié)演替規(guī)律研究發(fā)現(xiàn)，水溫、透明度、硝態(tài)氮、浮游植物生物量是影響浮游植物群落結(jié)構(gòu)動態(tài)變化的主要因子，Yang等[36]通過探討營養(yǎng)富集對浮游細菌群落組成和穩(wěn)定性的影響研究表明，對蝦養(yǎng)殖過程中營養(yǎng)物質(zhì)的富集改變可以破壞群落的穩(wěn)定性。為探討水體微生物群落組成與生物因子及非生物因子之間的關(guān)系，本研究通過對微生物群落組成和環(huán)境因子進行RDA關(guān)聯(lián)分析并采用蒙特卡洛置換進行顯著性檢驗，結(jié)果顯示，溶解氧、鹽度、蝦體細菌、蝦體弧菌、水體細菌是影響患病對蝦池塘水體中菌群結(jié)構(gòu)組成的顯著因子，溶解氧、鹽度的變化影響放線菌門和變形菌門類群數(shù)量，蝦體細菌、蝦體弧菌和水體細菌的變化影響擬桿菌門和藍藻門類群數(shù)量，且隨著病害的持續(xù)，水體和蝦體中的病原菌因子會超越環(huán)境因子成為水體微生物菌群結(jié)構(gòu)組成的主導(dǎo)影響因子。

綜上所述，本研究通過系統(tǒng)解析對蝦WFS發(fā)生后水質(zhì)理化因子、蝦體和水體中可培養(yǎng)微生物、蝦體自身免疫力及水體菌群結(jié)構(gòu)變化情況，首次從環(huán)境因子、微生物和宿主免疫反應(yīng)的角度結(jié)合宏基因組測序手段對池塘養(yǎng)殖環(huán)境下對蝦WFS的發(fā)生進行系統(tǒng)性分析。研究表明，弧菌大量擴增是導(dǎo)致此次對蝦WFS發(fā)生的主要致病因素，同時病害的發(fā)生會調(diào)動機體自身ACP、LZM、PO等免疫酶活性升高，進而產(chǎn)生免疫保護效應(yīng)，高通量測序分析表明，水體微生物群落結(jié)構(gòu)組成與多樣性存在顯著差異，且與溶解氧、鹽度、水體和蝦體中病原菌的相關(guān)性較強。相關(guān)研究結(jié)果對深入了解池塘養(yǎng)殖模式下對蝦WFS的發(fā)生與環(huán)境、病原和機體免疫間的相互關(guān)系，建立疾病綜合診療技術(shù)提供理論支撐。

（作者聲明本文無實際或潛在的利益沖突）