李亞男， 陸霖青， 張 鵬， 張 博， 林 蠡*， 秦真東*

(1. 仲愷農(nóng)業(yè)工程學院動物科技學院，廣東省水環(huán)境與水產(chǎn)品安全工程技術(shù)研究中心，廣州市水產(chǎn)病害與水禽養(yǎng)殖重點實驗室，廣東 廣州 510225；2. 中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所，廣東 廣州 510300)

羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)隸屬于節(jié)肢動物門(Arthropoda)軟甲綱(Malacostraca)沼蝦屬(Macrobrachium)，原產(chǎn)于東南亞，自20世紀60年代從日本引進中國，現(xiàn)已成功實現(xiàn)人工繁育，目前在國內(nèi)多省市均有養(yǎng)殖。羅氏沼蝦因其生長快、肉質(zhì)鮮美，經(jīng)濟效益明顯，已成為我國重要的水產(chǎn)經(jīng)濟蝦類之一[1]。然而近年來，隨著養(yǎng)殖密度的加大，細菌性疾病、真菌性疾病、病毒性疾病和寄生蟲病等不斷暴發(fā)，嚴重危害沼蝦養(yǎng)殖業(yè)，給該行業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失[2-3]。

羅氏沼蝦缺乏比較完善的獲得性免疫系統(tǒng)，主要依靠凝血、凝集、吞噬、酚氧化酶原激活系統(tǒng)、抗菌肽以及呼吸爆發(fā)產(chǎn)生活性氧分子(ROS)等先天性免疫方式抵御病原入侵[4-6]。其中，持續(xù)高水平的ROS在發(fā)揮殺菌功能的同時，會增加機體氧化應(yīng)激水平，引發(fā)氧化損傷，細胞凋亡等，降低機體防御能力[7-10]，因此，合理的ROS水平對于維持機體穩(wěn)態(tài)、提高抵抗力至關(guān)重要。研究表明，超氧化物歧化酶(SODs)是消除生物體內(nèi)過量ROS的第一道防線，可特異性地將超氧陰離子自由基(O2?·)歧化為過氧化氫(H2O2)，進一步由過氧化氫酶(CAT)轉(zhuǎn)化為無毒的水分子[11]，蛋白質(zhì)[8-10]是無脊椎動物先天性免疫非常重要的組成部分[12-13]。但是，SODs在水產(chǎn)甲殼動物中的研究還處于初級階段，詳細了解其分子生物學特性和免疫功能對于良種培育和病害防控都有積極的意義。因此，本研究克隆了羅氏沼蝦胞質(zhì)MnSOD基因(MrcMnSOD)，制備了多克隆抗體，對其在不同組織中的表達模式進行了轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平的分析，此外，初步探討了該蛋白質(zhì)的免疫功能，旨在為深入研究羅氏沼蝦SOD的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用羅氏沼蝦購自廣東金洋水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司，平均體長(10±2) cm，暫養(yǎng)于實驗室28 °C充氣循環(huán)水中，適應(yīng)1周后開始實驗，經(jīng)麻醉后取樣，樣品置于?80 °C冰箱用于后續(xù)提取RNA。實驗所用嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)，使用前先于37 °C無抗LB培養(yǎng)基中過夜活化，后用無菌磷酸鹽緩沖溶液(PBS)清洗菌體3次，使用無菌PBS重懸菌液至濃度為1×106CFU/mL[14]時進行腹部注射。本研究獲得了仲愷農(nóng)業(yè)工程學院動物科技學院實驗動物管理和使用倫理委員會批準，實驗過程中操作人員嚴格遵守相關(guān)規(guī)范，并按照倫理委員會制定的規(guī)章制度執(zhí)行實驗操作。

1.2 實驗試劑

TRIzol Reagent、PCR Mix、大腸桿菌(Escherichia coli) DH5α、大腸桿菌 BL21 (DE3)感受態(tài)細胞、EcoRⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶、His標簽特異性層析柱購于寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司(TaKaRa)。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒GoldenstarTMRT6 cDNA Synthesis Kit購自北京擎科生物科技有限公司。一步克隆試劑盒(ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit)、凝膠回收試劑盒購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司。實時熒光定量PCR (qRT-PCR)采用quantinova-SYBR-Green PCR試劑盒。Bradford蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。小鼠(Mus musculus)抗His-tag抗體，HRP標記山羊抗小鼠Ig G購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。引物以及其他無特殊說明的試劑均購于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 總RNA提取和基因克隆

使用TRIzol法進行總RNA提取后，使用超微量分光光度計NP80 (IMPLEN，德國)檢測RNA的純度，當A260/A280達到1.8～2.0后進行下一步操作。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明，逆轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA。根據(jù)GenBank中MrcMnSOD開放閱讀框序列(ABU55005.1，編碼286個氨基酸)，設(shè)計該基因一步克隆引物MrcMnSOD-32a S和MrcMnSOD-32a A(表1)，以cDNA為擴增模板，擴增MrcMnSOD序列，擴增得到的基因序列需經(jīng)膠回收純化。

表1 引物序列Tab. 1 Primers used in this study

1.4 重組蛋白質(zhì)表達與純化

根據(jù)一步克隆試劑盒操作說明，將純化后的基因擴增產(chǎn)物與線性化的PET-32a載體進行同源重組反應(yīng)，構(gòu)建重組質(zhì)粒PET-32a-MrcMnSOD。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細胞，進行陽性克隆子篩選。陽性克隆子經(jīng)測序檢驗正確后，進一步提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21 (DE3)表達菌株進行重組蛋白質(zhì)表達。37 °C、200 r/min的條件下，表達菌在含有氨芐的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600達到0.6后，添加0.1 mmol/L 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷在37 °C下繼續(xù)振蕩培養(yǎng)5～6 h，誘導重組蛋白質(zhì)大量表達。離心收集菌體，PBS清洗菌體3次后，重懸菌體并在低溫下進行超聲波破碎，使用12%的變性聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)蛋白質(zhì)檢測融合蛋白質(zhì)的表達情況。使用寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司His標簽特異性層析柱對上清蛋白質(zhì)進行純化回收，操作詳見使用手冊。

1.5 抗體制備與檢測

收集純化后的重組蛋白質(zhì)送至武漢福因德公司免疫新西蘭大白兔(Oryctolagus cuniculus)，獲得兔源性MrcMnSOD多克隆抗體?？贵w制備完成后，采用酶聯(lián)免疫吸附檢測法(ELISA)檢測抗體效價。為檢測抗體特異性，采集羅氏沼蝦新鮮組織樣品0.5 mg制備組織蛋白質(zhì)樣品：加入1 mL RIPA裂解液，冰上研磨至組織充分裂解，4 °C下12 000 r/min 離心5 min，取上清液與蛋白質(zhì)上樣緩沖液混合煮沸10 min進行12% SDS-PAGE凝膠電泳。電泳后進行半干轉(zhuǎn)膜，室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST清洗3次，每次5 min。5%脫脂奶粉稀釋小鼠抗His-tag抗體至1∶1 000 (體積比)，4 °C過夜孵育，TBST清洗3次，每次5 min。再用HRP標記山羊抗小鼠二抗Ig G (1∶10 000)孵育1 h后，TBST緩沖液洗滌3次，每次5 min。其中，脫脂奶粉溶于TBST中。最后ECL顯色1 min，使用化學發(fā)光及熒光成像系統(tǒng)Chemi Scope 6 000拍照。

1.6 組織表達模式分析

將羅氏沼蝦隨機分為實驗組和對照組。實驗組每尾蝦腹肌注射活化后的100 μL 1×106CFU/mL嗜水氣單胞菌，對照組每尾注射等量無菌PBS。注射后0、3、6、12和24 h，采集肝胰腺和腸組織進行總RNA提取、cDNA逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR，以18SrRNA為內(nèi)參基因(表1)，分析基因轉(zhuǎn)錄水平表達模式。每個時間點取3尾蝦進行混樣，平均取3次。20 μL qRT-PCR反應(yīng)體系：2×SYBR Green PCR Master Mix QN 10 μL，RNase-free water 7 μL，cDNA模板(5倍稀釋) 2 μL，引物MrcMnSOD S1/MrcMnSOD A1各0.5 μL。反應(yīng)條件：95 °C 2 min；95 °C 5 s，60 °C 30 s，72 °C 40 s，40個循環(huán)。采用2?ΔΔCt法計算mRNA水平相對表達量。蛋白質(zhì)水平表達模式分析取攻毒后12和24 h的肝胰腺、腸組織保存于4%的多聚甲醛中，后送至武漢賽維爾生物科技有限公司進行組織蠟片制備和組織免疫熒光分析。

1.7 抑菌實驗

抑菌實驗參照Zheng等[15]的方法進行，略作修改。選取3種革蘭氏陰性菌[嗜水氣單胞菌、大腸桿菌、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)]以及2種革蘭氏陽性菌[無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)]，與MrcMnSOD進行共培養(yǎng)，檢測重組蛋白質(zhì)的抑菌效果。實驗開始前，先將菌株過夜活化，使用無菌PBS清洗菌體3次后，重懸菌液調(diào)整濃度至2×107CFU/mL。培養(yǎng)實驗在37°C下、96孔酶標板中進行，蛋白質(zhì)終濃度分別設(shè)置為50和100 μg/mL，PBS作為空白對照，每組設(shè)置3個重復，每小時用酶標儀讀取A630值。

1.8 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 21.0軟件中單因素方差分析(ANOVA)進行數(shù)據(jù)處理，分析差異性。所有數(shù)據(jù)均以平均值±標準差(mean±SD) (n=3)表示。P＜0.05和P＜0.01分別被認為有顯著差異和極顯著差異。使用Graphpad prism 7.0軟件進行作圖。

2 結(jié)果

2.1 重組蛋白質(zhì)表達與純化

經(jīng)0.1 mmol/L IPTG 37 °C誘導5～6 h后，重組蛋白質(zhì)可在上清液中大量表達(圖1)。MrcMnSOD蛋白質(zhì)開放閱讀框由286個氨基酸組成，分子質(zhì)量約為31 ku，PET-32a載體標簽蛋白質(zhì)約為18 ku，因此推測表達的融合蛋白質(zhì)約為49 ku，與SDSPAGE檢測結(jié)果一致。純化后的上清液重組蛋白質(zhì)純度可達95 %以上，濃度達到1 mg/mL，滿足后續(xù)抗體制備送樣要求。用制備的MrcMnSOD多克隆抗體作為一抗進行免疫印跡實驗，檢測羅氏沼蝦組織樣品中的MrcMnSOD (圖1，第1泳道)，在約31 ku 處檢測到1條特異性蛋白質(zhì)條帶，大小和預(yù)測的MrcMnSOD蛋白質(zhì)一致，說明制備的多克隆抗體特異性好。

圖1 MrcMnSOD的SDS-PAGE檢測圖M. 蛋白質(zhì)marker，1. MrcMnSOD多克隆抗體鑒定，2. IPTG誘導前菌體總蛋白質(zhì)，3. IPTG誘導后菌體總蛋白質(zhì)，4. 誘導后上清液總蛋白質(zhì)，5. 純化后的重組蛋白質(zhì)。Fig. 1 SDS-PAGE detection of MrcMnSODM. protein marker, 1. detection of polyclonal antibody of MrcMnSOD,2. total protein from E. coli BL21 (DE3) before IPTG induction, 3. total protein from E. coli BL21 (DE3) after IPTG induction, 4. total supernatant protein, 5. the purified recombinant protein.

2.2 抗體效價檢測

ELISA效價檢測結(jié)果顯示，制備的MrcMnSOD多克隆抗體效價可達6 250 000倍(圖2)。

2.3 轉(zhuǎn)錄水平表達模式分析

為了評估MrcMnSOD是否參與羅氏沼蝦對嗜水氣單胞菌的免疫反應(yīng)，采用qRT-PCR分析了嗜水氣單胞菌感染羅氏沼蝦后肝胰腺和腸組織中的基因表達變化。結(jié)果顯示，MrcMnSOD在肝胰腺中的表達量在感染后3 h達到峰值，隨后逐漸恢復(圖3-a)。腸組織中，MrcMnSOD表達量隨著感染時間的延長不斷增大，感染后6 h達到峰值，之后表達量雖有所降低，但依然顯著高于對照組(圖3-b)。該結(jié)果表明，嗜水氣單胞菌感染可顯著激活MrcMnSOD的基因表達水平。

圖3 嗜水氣單胞菌感染后MrcMnSOD表達變化(a) 肝胰腺；(b) 腸。*. P＜0.05，**. P＜0.01。Fig. 3 Expression of MrcMnSOD after A. hydrophila infection(a) hepatopancreas；(b) intestine. *. P＜0.05, **. P＜0.01.

2.4 蛋白質(zhì)水平表達模式分析

嗜水氣單胞菌感染后，采用組織免疫熒光法檢測羅氏沼蝦肝胰腺和腸組織中MrcMnSOD表達變化。結(jié)果顯示，肝胰腺中MrcMnSOD隨著感染時間的延長表達水平持續(xù)增高，感染后24 h達到峰值(圖版Ⅰ)。腸中MrcMnSOD表達水平在感染后12 h達到峰值，之后表達水平下降(圖版Ⅱ)。結(jié)果表明，嗜水氣單胞菌感染可顯著激活MrcMnSOD的蛋白質(zhì)表達水平。

2.5 抑菌實驗

為了初步探究MrcMnSOD參與免疫反應(yīng)的機制，本研究選取5種常見細菌與重組蛋白質(zhì)進行共培養(yǎng)實驗。結(jié)果顯示，相比于對照組，MrcMnSOD可顯著抑制3種革蘭氏陰性菌和2種革蘭氏陽性菌的生長。對于嗜水氣單胞菌而言，100 μg/mL重組蛋白質(zhì)的抑菌效果高于50 μg/mL，而在其他幾種細菌的培養(yǎng)實驗中，MrcMnSOD抑菌效果與蛋白質(zhì)濃度的依賴關(guān)系不顯著(圖4)。

圖4 MrcMnSOD抑菌效果檢測(a) 嗜水氣單胞菌；(b) 副溶血性弧菌；(c) 大腸桿菌；(d) 無乳鏈球菌；(e) 金黃色葡萄球菌。Fig. 4 Antibacterial effect detection of MrcMnSOD(a) A. hydrophila; (b) V. parahemolyticus; (c) E. coli; (d) S. agalactiae; (e) S. aureus.

3 討論

羅氏沼蝦口味鮮美，富含豐富的微量元素和氨基酸，受到消費者的喜愛。據(jù)統(tǒng)計，2020年中國羅氏沼蝦的養(yǎng)殖產(chǎn)量接近14萬t[16-17]，是中國重要的經(jīng)濟水產(chǎn)養(yǎng)殖動物之一。但是，近年來隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大以及集約型養(yǎng)殖模式的推廣，羅氏沼蝦養(yǎng)殖業(yè)病害頻發(fā)，嚴重危害該產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[18-19]。嗜水氣單胞菌是養(yǎng)殖水體中一類重要的條件致病菌，可感染羅氏沼蝦肝胰腺，引起孵化期和生長期的較高死亡率[20-21]。研究發(fā)現(xiàn)，對蝦黑斑壞死病與嗜水氣單胞菌屬和其他病原菌，如弧菌和假單胞菌的聯(lián)合感染有關(guān)。因此，嗜水氣單胞菌侵染過程中的免疫機制近年來也備受關(guān)注[14]。

SODs是無脊椎動物先天性免疫的重要組成部分[7,22]。在哺乳動物中，MnSOD被認為是一種應(yīng)激因子，其表達水平可能受環(huán)境和生物刺激的影響[23]。本研究中，嗜水氣單胞菌感染期間，羅氏沼蝦MrcMnSOD在基因表達水平和蛋白質(zhì)表達水平都被顯著激活，表明該基因參與了細菌感染期間機體氧化還原穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)與抗菌免疫，這與前人的研究報道相一致。如Lin等[24]克隆了日本囊對蝦(Marsupenaeus japonicus)的cMnSOD，并發(fā)現(xiàn)在溶藻弧菌(V. alginolyticus)的刺激下，該基因能在血淋巴中異常高表達。有學者報導cMnSOD可在凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei) 感染白斑綜合征病毒免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用[25]。Cheng等[26]雖克隆了MrcMnSOD，證實該基因參與格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)的免疫應(yīng)答，但并未對其免疫機制做進一步解釋，硬骨魚類、甲殼類和軟體動物中也報道了類似的發(fā)現(xiàn)[7,27-30]。然而，以上研究主要集中在病原體入侵后該基因表達水平的變化，少有研究其蛋白水平的表達變化，對其抗菌免疫機制也未做進一步研究。

本研究通過抑菌實驗，初步探究了MrcMnSOD參與免疫反應(yīng)的可能機制。與對照組相比，實驗組添加MrcMnSOD后，5種細菌生長明顯受到抑制，提示MrcMnSOD可能作為一種免疫相關(guān)因子參與免疫應(yīng)答。但對于不同細菌而言，抑菌效果不盡相同，如嗜水氣單胞菌抑菌實驗中，抑菌效果隨著蛋白質(zhì)濃度的增大而增強，這種現(xiàn)象在其他幾種細菌中并不顯著，推測這可能與不同細菌表面組成差異相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，鮻 (Liza haematocheila)的MnSOD可顯著抑制格氏乳球菌、藤黃微球菌(Micrococcus luteus)和大腸桿菌的生長[31]。Zheng等[15]對魁蚶(Scapharca broughtonii) MnSOD抗菌功能研究表明，魁蚶MnSOD可抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌的生長，且抑制作用與蛋白質(zhì)濃度關(guān)系不顯著，與當前實驗結(jié)果一致。另有報道稱，羅氏沼蝦CuZnSOD可通過凝集效應(yīng)發(fā)揮抑菌效果[32]，但MrcMnSOD是否具有和CuZnSOD同樣的抑菌機制尚不清楚，有待進一步研究證實?？傊?，本研究闡釋了MrcMnSOD可能作為免疫相關(guān)分子參與抗菌應(yīng)答的依據(jù)，為今后羅氏沼蝦病害防控相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

（作者聲明本文無實際或潛在的利益沖突）