呂曉潔,王偉偉*,郝瑞榮,劉少貞,陳 越,楊 瓊,李欣欣,謝宇浩,孫 睿

(1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院,山西 太谷 030801;2. 沁水縣現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展中心,山西 沁水 048200)

大鱗副泥鰍(Paramisgurnusdabryanus),俗名大泥鰍,為鰍科副泥鰍屬的魚類,是中國的特有物種。與多數(shù)魚類相同,大鱗副泥鰍具有較明顯的性別二態(tài)性,同日齡的雌魚體重明顯大于雄性[1],因此生產(chǎn)中全雌魚養(yǎng)殖能帶來更大的經(jīng)濟(jì)效益。

miR-140-3p在miRBase數(shù)據(jù)庫中有大約23個物種208條相關(guān)序列注釋,是一種在性腺中廣泛表達(dá)的miRNA[2-4]。對小鼠睪丸和卵巢miRNA高通量測序發(fā)現(xiàn),在發(fā)育中的XY小鼠性腺中miR-140-3p表達(dá)量顯著增加,而miR-140-3p敲除后的小鼠表型與阻斷控制睪丸間質(zhì)細(xì)胞分化的Notch信號通路的表型十分相似,提示miR-140-3p可以靶向調(diào)控Notch信號通路中的基因以控制小鼠的睪丸間質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量,從而影響睪丸分化過程[5]。SOX9基因作為性別決定的重要調(diào)控基因,在睪丸索周圍間質(zhì)Leydig細(xì)胞中的高表達(dá)[6]可以啟動睪丸的分化[7],而SOX9位于miR-140的上游[8],調(diào)節(jié)pri-miR-140的表達(dá),從而激活其功能[9]。miR-140在高效氯氰菊酯暴露后的大鼠(Rattusnorvegicus)睪丸組織中過表達(dá),研究顯示miR-140通過靶向SF-1從而抑制STAR、P450SCC和3β-HSD等類固醇基因的表達(dá)[10],一定程度說明了miR-140對類固醇激素的影響。虹鱒魚(Oncorhynchusmykiss)性腺組織的小RNA測序結(jié)果顯示miR-140在成熟精巢組織中顯著上調(diào)[11]?？梢妋iR-140-3p參與性腺分化和性腺功能的發(fā)育調(diào)控,同時其表達(dá)會受到激素的調(diào)節(jié)。然而迄今為止關(guān)于miR-140-3p在魚類性腺中的表達(dá)水平及相關(guān)功能的研究甚少。本研究運用qRT-PCR方法分析miR-140-3p在大鱗副泥鰍性腺中的表達(dá)特征,并對miR-140-3p靶基因進(jìn)行預(yù)測和相關(guān)生物學(xué)分析。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試大鱗副泥鰍取自山西省太原市魚種場,均為性征發(fā)育成熟2～3齡的成魚,雌魚體重25 g左右,雄魚體重20 g左右,雌雄魚各選6尾,麻醉后置于冰上解剖,取出卵巢和精巢組織,迅速放入液氮中速凍,然后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.2 cDNA合成 取適量總RNA,按照北京聚合美生物科技有限公司M5 MiRNA cDNA Synthesis Kit試劑盒的說明先進(jìn)行加尾,再合成對應(yīng)的cDNA,置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.3 miR-140-3p引物合成及熒光定量 miR-140-3p和內(nèi)參(U6)[12]引物序列見表1,miR-140-3p序列來源于課題組對大鱗副泥鰍性腺的MiRNA測序數(shù)據(jù)庫,使用miR-140-3p原序列未做堿基刪減,交由上海生工公司合成引物;使用加尾法得到的cDNA為模版,按照M5 MiRNA qPCR Assay Kit(MF307-01)說明書的程序進(jìn)行熒光定量反應(yīng),每個樣本進(jìn)行3次重復(fù),其Cq值導(dǎo)出到Excel,使用2-ΔΔCt法計算樣品中miR-140-3p的相對表達(dá)量。

表1 miR-140-3p及內(nèi)參U6的引物序列Table 1 Primer sequences of miR-140-3p and reference gene U6

1.2.4 對miR-140-3p的預(yù)測靶基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析 由于魚類miRNA靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫DIANA TOOLS (http:// diana. imis. Athena -innovation.gr/)和TargetScan (http://www. targetscan. org/)中未收錄大鱗副泥鰍相關(guān)信息,只收錄了斑馬魚(Daniorerio)的靶基因信息。在進(jìn)行靶基因預(yù)測前,先在NCBI中下載到斑馬魚的miR-140-3p的序列,經(jīng)比對,大鱗副泥鰍的miR-140-3p與斑馬魚的該miRNA序列完全一致,根據(jù)miRNA 不同物種間功能的保守性,利用DIANA TOOLS 和TargetScan等軟件進(jìn)行靶基因預(yù)測,將預(yù)測得出的結(jié)果進(jìn)行Venny (https:// bioinfogp. cnb. csic.es/)比對,與利用miRanda[13]算法預(yù)測出的大鱗副泥鰍miRNA靶基因進(jìn)行比較分析,得到交集的靶基因,再輸入DAVID數(shù)據(jù)庫(https:// david. ncifcrf. gov/ tools.jsp)進(jìn)行GO和KEGG pathway分析,篩選出與魚類性別分化和繁殖相關(guān)的靶基因。將DAVID處理后的GO和KEGG pathway相關(guān)的Category、Term、Genes count和P-Value等富集信息輸入Hiplot(https:// hiplot.com.cn /basic/ bubble)網(wǎng)站,進(jìn)行富集通路的作圖。最后結(jié)合大鱗副泥鰍性腺高通量測序得到的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行聯(lián)合分析,篩選出目的靶基因。

1.2.5 miR-140-3p靶基因的引物設(shè)計和熒光定量利用NCBI的在線軟件primer-BLAST(https://www. ncbi.nlm.nih. gov/tools/ primer -blast/),使用課題組對大鱗副泥鰍轉(zhuǎn)錄組測序得到的基因序列,對miR-140-3p的靶基因進(jìn)行引物設(shè)計。查閱文獻(xiàn)選擇2個內(nèi)參基因并進(jìn)行進(jìn)一步篩選[14],選擇表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因進(jìn)行熒光定量的數(shù)據(jù)分析,引物序列見表2。引物的合成由上海生工生物技術(shù)有限公司完成。

表2 用于qRT-PCR分析的靶基因及內(nèi)參基因引物序列 Table 2 Primers of target genes and reference genes for qRT-PCR analysis

使用M5 Super qPCR RT Kit with gDNA remover 試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,合成的cDNA置于-20 ℃保存。靶基因熒光定量使用2×Realtime PCR Super mix(SYBRgreen,with anti-Taq, MF013-05)試劑盒,按照說明書程序進(jìn)行qRT-PCR檢測。

1.2.6 miR-140-3p及潛在靶基因相對表達(dá)水平相關(guān)性分析 采用獨立樣本t檢驗法(Independent-samplettest),分析雌雄大鱗副泥鰍性腺miR-140-3p及潛在靶基因的相對表達(dá)水平,計算其差異顯著性,P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。使用SPSS 26軟件對miR-140-3p和潛在靶基因的表達(dá)水平進(jìn)行皮爾遜相關(guān)系數(shù)分析。使用Graphpad Prism 8.3.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鱗副泥鰍性腺中miR-140-3p相對表達(dá)量分析

miR-140-3p在大鱗副泥鰍的雌雄性腺中均表達(dá), 精巢中的表達(dá)量顯著高于卵巢(P<0.01)(圖1)。

圖1 miR-140-3p在大鱗副泥鰍雌雄性腺中的表達(dá)** 表示差異極顯著(P<0.01)。下同F(xiàn)ig. 1 Expression of miR-140-3p in the gonads of Paramisgurnus dabryanus** indicate highly significant difference (P<0.01). The same below

2.2 miR-140-3p靶基因的預(yù)測及功能性分析

通過DIANA TOOLS 和TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測的靶基因分別有137和3 316個,使用Venny軟件找到25個交集靶基因(見圖2)。這25個交集靶基因包含在利用miRanda算法預(yù)測出的大鱗副泥鰍miRNA靶基因中。

圖2 DIANA TOOLS和TargetScan預(yù)測的miR-140-3p靶基因交集Fig. 2 Intersection of miR-140-3p target genes predicted by DIANA TOOLS and TargetScan

利用DAVID數(shù)據(jù)庫,對交集靶基因進(jìn)行GO富集分析,發(fā)現(xiàn)它們富集在細(xì)胞過程、交流和信號等條目中(圖3)。

圖3 miR-140-3p靶基因GO富集注釋條目Fig. 3 GO enrichment annotations of miR-140-3p target genes

進(jìn)行KEGG分析發(fā)現(xiàn)部分靶基因富集在繁殖相關(guān)通路中,如:CPEB4基因富集于孕激素介導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟(progesterone-mediated oocyte maturation)和卵母細(xì)胞減數(shù)分裂(oocyte meiosis)通路,GDF9基因富集于卵巢類固醇通路(ovarian steroidogenesis),它們參與卵母細(xì)胞成熟分化過程;HSD17b和CYP19a1b基因富集于甾類激素生物合成通路(steroid hormone biosynthesis)(圖4),它們是調(diào)控雌激素生成相關(guān)基因;而SOX9基因富集于cAMP通路(cAMP signaling pathway)參與雄性睪丸分化調(diào)控。將這5個與性別相關(guān)的靶基因與大鱗副泥鰍性腺轉(zhuǎn)錄組高通量測序結(jié)果進(jìn)行聯(lián)合分析,篩選出在雌雄魚性腺之間表達(dá)量差距較大,且表達(dá)量趨勢與miR-140-3p結(jié)果相反的2個基因CPEB4和GDF9基因進(jìn)行下一步驗證。

圖4 miR-140-3p靶基因的KEGG信號通路分析Fig. 4 miR-140-3p KEGG signal pathway analysis of target genes

2.3 miR-140-3p與CPEB4、GDF9基因的關(guān)系

篩選出富集于孕激素介導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟和卵母細(xì)胞減數(shù)分裂通路上的靶基因CPEB4,與卵巢類固醇通路上的靶基因GDF9進(jìn)行下一步分析。在大鱗副泥鰍miR-140-3p預(yù)測的靶基因數(shù)據(jù)集里進(jìn)一步分析miR-140-3p與靶基因CPEB4、GDF9的靶標(biāo)關(guān)系,發(fā)現(xiàn)miR-140-3p種子區(qū)域與2個靶基因的結(jié)合類型均為6mer,靶標(biāo)關(guān)系位點見表3。

表3 CPEB4和GDF9與miR-140-3p的靶標(biāo)關(guān)系位點Table 3 Target relationship sites of CPEB4 and GDF9 with miR-140-3p

2.4 CPEB4和GDF9在大鱗副泥鰍雌雄性腺組織中的表達(dá)

β-actin引物特異性良好,但是在雌雄大鱗副泥鰍性腺中的穩(wěn)定性較差,樣本間的Cq值差距較大,不宜作為大鱗副泥鰍性腺組織的內(nèi)參基因使用。18S RNA引物特異性和雌雄大鱗副泥鰍樣本Cq值較為平均,18S RNA基因更適合作為大鱗副泥鰍性腺組織的內(nèi)參基因。所以選擇18S RNA作為內(nèi)參進(jìn)行熒光定量數(shù)據(jù)的分析。qRT-PCR結(jié)果顯示,CPEB4和GDF9基因在大鱗副泥鰍卵巢和精巢組織中都有表達(dá),且都表現(xiàn)出卵巢的表達(dá)量顯著高于精巢(P<0.01)(圖5)。

圖5 CPEB4和GDF9在大鱗副泥鰍性腺中的表達(dá)Fig. 5 Expression of CPEB4 and GDF9 in the gonads of Paramisgurnus dabryanus

2.5 miR-140-3p與CPEB4、GDF9基因的相關(guān)性

miR-140-3p與靶基因CPEB4和GDF9的皮爾遜相關(guān)系數(shù)分別為-0.446和-0.515,存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系,進(jìn)一步說明miR-140-3p與靶基因CPEB4和GDF9存在潛在的靶標(biāo)關(guān)系,見表4。

表4 miR-140-3p與CPEB4、GDF9的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of CPEB4 and GDF9 targeted by miR-140-3p

3 討 論

miRNA是細(xì)胞代謝、癌癥發(fā)展等眾多生物學(xué)過程中的主要調(diào)節(jié)因子,對于生物生殖相關(guān)器官發(fā)育和性別分化等方面在轉(zhuǎn)錄后水平的基因調(diào)控中發(fā)揮重要作用[15]。miR-140在小鼠雌雄性腺組織中的表達(dá)具有明顯的性別二態(tài)性,其在睪丸組織中顯著高表達(dá),可以調(diào)節(jié)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量,從而調(diào)節(jié)睪丸的早期發(fā)育。在虹鱒中也發(fā)現(xiàn)miR-140在成熟的精巢組織中高表達(dá)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-140-3p在大鱗副泥鰍的雌雄性腺組織中均有表達(dá),且精巢中的表達(dá)量顯著高于卵巢,與前面的研究結(jié)果一致,說明miR-140-3p可能參與魚類的性腺發(fā)育和繁殖相關(guān)的過程。

對大鱗副泥鰍miR-140-3p的交集靶基因進(jìn)行KEGG Pathway分析,可以發(fā)現(xiàn)部分基因富集在繁殖功能和性腺發(fā)育相關(guān)通路上。CPEB4富集在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂和孕激素介導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟相關(guān)通路中,在卵子的發(fā)生和早期胚胎的發(fā)育過程中,蛋白質(zhì)的產(chǎn)生完全依賴于儲存在母體卵母細(xì)胞中的mRNA翻譯,其過程與細(xì)胞質(zhì)多聚腺苷酸化元件結(jié)合蛋白(cytoplasmic polyadenylation element (CPE)-binding proteins, CPEBs)介導(dǎo)的多聚磷酸化反應(yīng)共同起作用的[16]。如向非洲爪蟾(Xenopuslaevis)注射抗CPEB抗體,非洲爪蟾卵細(xì)胞中CPEB耗竭,從而會阻止多聚腺苷酸化和減數(shù)分裂成熟,證明了CPEB對卵母細(xì)胞成熟的重要性[17]。CPEB4是在卵子發(fā)生中起重要作用的蛋白,可以控制卵子的成熟[18-19]。CPEB敲除(knockout, KO)小鼠(Musmusculus)中,雌性小鼠的生殖細(xì)胞分裂進(jìn)程不會超過第一次減數(shù)分裂前期,卵母細(xì)胞KO小鼠不會發(fā)生多聚腺苷酸化和mRNA的翻譯,生殖細(xì)胞的發(fā)育受到抑制,說明小鼠的卵子發(fā)生受到CPEB的控制[20]。本研究中CPEB4在大鱗副泥鰍雌雄性腺中均有表達(dá),且在卵巢中顯著高表達(dá),qRT-PCR試驗結(jié)果與高通量測序結(jié)果一致,說明在大鱗副泥鰍中,CPEB4基因在卵巢發(fā)育和卵細(xì)胞成熟過程中發(fā)揮著重要的作用。

miR-140-3p靶基因GDF9富集到卵巢類固醇生成相關(guān)通路中,GDF9是生長轉(zhuǎn)化因子β(TGFB)超家族的成員。自1993年首次被鑒定以來[21],GDF9因其獨特的卵母細(xì)胞特異性表達(dá)而日益受到關(guān)注,在多種脊椎動物的卵母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了GDF9基因和蛋白的表達(dá)[22-27]。如:GDF9基因僅在斑馬魚的性腺中表達(dá),在初級生長卵泡中表達(dá)最高,在卵泡發(fā)育過程中逐漸降低,在成熟卵泡中表達(dá)最低[28]。在齊口裂腹魚(Schizothoraxprenanti)中,發(fā)現(xiàn)GDF9在皮質(zhì)腺泡期卵巢和生精后期精巢中高表達(dá)[29]。在稀有鮈鯽(Gobiocyprisrarus)性腺研究中,發(fā)現(xiàn)GDF9在卵巢中高表達(dá),在長時間的雙酚A的影響下稀有鮈鯽的卵巢出現(xiàn)不良發(fā)育,此時卵巢中GDF9表達(dá)的下降,證明了GDF9對稀有鮈鯽卵巢發(fā)育的影響[30]。在本研究中,GDF9在大鱗副泥鰍卵巢里顯著高表達(dá),與別的魚類研究結(jié)果一致,說明GDF9參與大鱗副泥鰍卵巢的發(fā)育。

且CPEB4和GDF9在大鱗副泥鰍性腺中的表達(dá)量與miR-140-3p的表達(dá)顯著負(fù)相關(guān),說明CPEB4和GDF9與miR-140-3p存在潛在的靶標(biāo)關(guān)系,在大鱗副泥鰍性腺中,miR-140-3p通過高表達(dá)抑制CPEB4和GDF9基因的表達(dá),從而促進(jìn)精巢的發(fā)育,miR-140-3p通過低表達(dá),對CPEB4和GDF9基因的抑制作用消失,CPEB4和GDF9基因高表達(dá),從而促進(jìn)卵巢的發(fā)育。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明,miR-140-3p在大鱗副泥鰍雌雄魚的性腺組織中均表達(dá),且精巢中的表達(dá)量顯著高于卵巢,靶基因定量結(jié)果顯示CPEB4和GDF9的在卵巢中表達(dá)顯著高于精巢,且表達(dá)量與miR-140-3p的表達(dá)顯著負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果在一定程度上說明miR-140-3p與其在性別和繁殖相關(guān)的通路上靶基因CPEB4和GDF9之間具有靶向調(diào)控關(guān)系,為后續(xù)進(jìn)一步研究miR-140-3p的生物學(xué)功能提供了基礎(chǔ)。