姜肖軍,郭亞男,何生虎

(寧夏大學 農學院,寧夏 銀川 750021)

雞滑液囊支原體病是雞滑液囊支原體(Mycoplasmasynoviae,Ms)引起的一種以滲出性滑液囊膜炎及腱鞘滑膜炎為主的一種急性或慢性傳染病,常發(fā)于1～4月齡雞群,主要危害蛋雞和肉雞,導致產蛋量和蛋品質下降、生長發(fā)育遲緩和胴體降級[1],Ms常常會結合其他致病因子使雞病情惡化,死亡率增加。Ms主要通過接觸進行傳播,一旦感染終身帶菌,對于蛋雞養(yǎng)殖來說,垂直傳播是Ms流行、無法凈化的一個重要原因。若雛雞群中有經垂直傳播的帶菌雛雞,該病可在短時間內蔓延至整個雞群,發(fā)病率高達90%～100%。流行病學調查顯示,Ms在全球不同地區(qū)蛋雞群中的感染率非常高,蛋用種雞場的陽性率可達70 %,該病的發(fā)病率近些年在中國呈逐年上升趨勢。目前對于該病尚無有效的治療手段,藥物治療雖然能取得一定效果,但無法徹底根除Ms[2]。加上近些年抗生素殘留和耐藥性問題的不斷加重,使藥物治療在生產中的使用越來越受到限制,所以,研制有效的疫苗成為該病防治的一個重要突破口。目前國內尚無針對該病的有效疫苗上市,只有澳大利亞有經突變選育的一種弱毒苗[3],該疫苗是活苗,免疫后雖不會引起雞體發(fā)病,但會永久性的根植于雞體內,這明顯不利于養(yǎng)殖場的支原體清除計劃,因此在有些國家該疫苗被禁用。本研究利用Ms菌株Q5-2經滅活處理制成Ms滅活疫苗并對該疫苗進行安全性和不同劑量下免疫后的效果評價,以期為該病滅活疫苗的研究提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試驗材料

MsQ5-2菌株由寧夏大學臨床獸醫(yī)實驗室分離并保存;20日齡海藍褐雛雞 50只(無Ms感染),由寧夏某禽業(yè)有限公司提供。Marcol-52白油佐劑購自南京天邦生物科技有限公司;雞滑液囊支原體抗體檢測試劑盒(編號為CK118)購自北京愛德士元亨生物科技有限公司;改良Frey氏培養(yǎng)基購自北京中海生物科技有限公司;普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和鮮血瓊脂培養(yǎng)基均購自青島海博生物科技有限公司。

1.2 Ms滅活疫苗的制備

將本實驗室保存Ms Q5-2菌株復蘇后進行擴繁培養(yǎng),期間用顏色單位變化法(CCU)測定菌體濃度,待菌體濃度達到109CCU以上時在菌液中加入終濃度為0.4%的甲醛,于恒溫培養(yǎng)箱中滅活72 h。離心后,用PBS洗滌3次后重懸為原體積的1/10即得Ms抗原懸液,用核酸蛋白測定儀測定其蛋白含量,然后加入等體積白油佐劑用超聲波破碎儀使其完全乳化,制成油包水型油乳疫苗。保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.3 滅活疫苗質量檢測

將1.2中得到的抗原懸液接種于改良Frey氏固體培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基和鮮血瓊脂培養(yǎng)基中,分別于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～7 d,根據(jù)其生長情況來鑒定其滅活效果以及是否含有活菌;選取健康小鼠10只、蛋雞5只,將疫苗以肌肉注射的方式注射于動物體內,小鼠0.2 mL/只,蛋雞0.1 mL/只,觀察1周并記錄其健康狀況。

1.4 蛋雞的分組與免疫

選取Ms抗體檢測結果為陰性的蛋雞40只,隨機分為4組,每組10只,分別為低劑量組(P1)、中劑量組(P2)、高劑量組(P3)和陰性對照組(P0),對照組單獨飼養(yǎng)。預飼1周后進行基礎免疫,經胸腹部肌肉注射,劑量為P1組0.05 mg/只;P2組0.10 mg/只;P3組0.15 mg/只;P0組注射0.50 mL生理鹽水。加強免疫時間分別在首免后第4周和第6周進行,注射劑量與首免相同。

1.5 抗體水平的檢測

基礎免疫前1周開始,每周固定時間采血1次并分離血清,編號并保存于-20 ℃冰箱中備用。按照Ms抗體檢測試劑盒說明書對血清進行檢測。

1.6 疫苗保護效力試驗

三免后第8周所有試驗動物均用MsQ5-2強毒(109CCU /mL )攻擊,每只雞滴鼻500 μL,滴眼200 μL,連續(xù)攻毒3 d。攻毒后連續(xù)15 d觀察雞的臨床癥狀并記錄直腸溫度,判斷是否發(fā)病的標準為:抗體檢測為陽性、病雞出現(xiàn)跛行的同時伴有雞冠蒼白、排綠色稀便及羅音3個癥狀中的任何一個癥狀即可判斷為發(fā)病。計算每組雞攻毒后的保護率。并分別于第0、5、10、15天采集咽拭子進行Ms分離培養(yǎng)試驗[4]。保護率=(P0組發(fā)病數(shù)-該組發(fā)病數(shù))/P0發(fā)病數(shù)×100%)

1.7 統(tǒng)計學分析

采用Excel (Microsoft Office 2010)軟件對數(shù)據(jù)進行初步統(tǒng)計,各組試驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準誤表示,組間的差異比較采用方差分析,數(shù)據(jù)分析應用SPSS 20.0軟件,P<0.05被認為有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 滅活疫苗質量檢測結果

經核酸蛋白測定儀檢測,所得抗原濃度為0.8 mg/mL,加入等體積的白油佐劑后,滅活疫苗最終濃度為0.4 mg/mL。將抗原懸浮液接種于改良Frey氏培養(yǎng)基中,于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～7 d,未見有“煎蛋樣”菌落出現(xiàn),說明滅活完全。將抗原懸浮液接種至普通瓊脂培養(yǎng)基和鮮血瓊脂培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)2～4 d,未見有雜菌生長。注射疫苗后,小鼠及蛋雞,采食正常,精神狀況良好;注射部位未見有紅腫、化膿現(xiàn)象出現(xiàn)。檢驗結果均符合疫苗制作要求,表明疫苗安全可靠。

2.2 抗體水平的檢測

首免后收集的血清經Ms抗體檢測試劑盒檢測結果顯示,首免1周后即可檢測到抗體的產生,試驗組中3個劑量組血清抗體轉陽率為100%,對照組試驗期間抗體一直為陰性。在第2次加強免疫前,3個劑量組抗體效價的變化趨勢基本一致;第2次加強免疫后P1組抗體效價持續(xù)上升并于首免后第12周時達到峰值1∶158 000,之后抗體效價開始緩慢下降。P2組和P3組在第2次加強免疫后,抗體效價經過短暫的上升在首免后第8周時達到峰值,分別為1∶10 200和1∶6 400。達到峰值后開始下降,高劑量組的下降快于低、中劑量組(P<0.05)(圖1)。經統(tǒng)計學分析,首免8周后不同劑量組之間差異顯著(P<0.05)。說明低劑量組的免疫效果最好。

2.3 滅活疫苗免疫保護效果

采用滴鼻、滴眼方式對免疫后的試驗組和對照組進行攻毒,觀察其健康發(fā)病情況并計算保護率,分別于攻毒后第0、5、10、15天采集咽拭子進行Ms分離培養(yǎng)試驗,并記錄每天15:00的肛溫。結果顯示,攻毒后對照組體溫迅速上升,然后維持在43 ℃左右,并表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀,發(fā)病率為100%;試驗組中3個劑量組攻毒后體溫也迅速上升,但比對照組略低,第9天后體溫迅速下降并趨于正常體溫(見圖2)。低劑量組發(fā)病率為0,攻毒保護率為100%;中劑量組和低劑量組發(fā)病率為20%,攻毒保護率為80%。隨著時間的推移,免疫后的3個劑量組攻毒后排毒動物的數(shù)量明顯少于對照組(表1)。表明經該疫苗免疫后,蛋雞對于強毒攻擊具有良好的抵抗力,并對感染動物的排毒起到了一定抑制作用。

表1 Ms滅活疫苗免疫保護效果 Table 1 Protective efficacy of the inactivated Ms vaccine

圖2 攻毒后體溫變化趨勢Fig.2 Trend of tempreture after challenge

3 討 論

目前,國內尚無針對Ms的有效疫苗,僅有澳大利亞有經突變選育的兩株減毒苗Ms1和(ts+)Ms-H。

該疫苗的免疫效果和保護力均已得到相關研究的證實。但是由于是活苗且價格昂貴,目前在中國還沒有得到廣泛的推廣和應用。大部分養(yǎng)殖企業(yè)對Ms的防治依然以藥物治療為主,因此研制一種安全有效的滅活疫苗,控制中國Ms感染流行的現(xiàn)狀顯得尤為重要。

本研究成功制備了Ms滅活疫苗,為了評價該疫苗的保護效果并探究其最佳免疫劑量,分3個劑量組對蛋雞進行免疫后,進行了攻毒試驗。結果證明該疫苗能刺激機體產生良好的免疫應答,并對強毒感染雞只的排毒具有一定的抑制作用,綜合評價后確定最佳免疫劑量為0.05 mg/只。機體的免疫應答至少受3個因素的影響:抗原、免疫佐劑和試驗雞本身情況,抗原劑量能明顯影響免疫應答,抗體的濃度和抗體的效價水平,一般而言,在一定劑量范圍內,免疫效果會隨著抗原劑量的增加而增加,但過高的免疫劑量會引起機體出現(xiàn)免疫抑制[5-7]。相關研究結果表明,使用0.1 mg的鼠IgG為免疫原免疫試驗雞的免疫效果要比1 mg劑量好。目前得到大多數(shù)學者公認的是,抗原劑量在10～1 000 μg免疫效果最佳[8],筆者所選用的劑量也以此為基礎。針對多次免疫中的最佳免疫間隔時間問題,存在著不同的見解和習慣,但大量研究表明為了獲得高濃度抗體,第1次和第2次抗原注射的時間間隔至少為4周,以便有足夠的時間產生免疫記憶[9]。故本研究中首免和二次免疫的時間間隔為4周。結果表明,3個劑量組經過3次免疫均達到了較高的抗體效價,說明滅活疫苗的免疫效果較好,與低劑量組相比,中劑量組和高劑量組在第2次加強免疫后抗體效價經過短暫上升后即開始顯著下降。而低劑量組二次加強免疫后抗體效價持續(xù)上升,峰值達到的最高抗體效價為1∶158 000,高水平的抗體效價穩(wěn)定持久。造成這一現(xiàn)象的原因可能是由于,第1次和第2次加強免疫時間間隔較短,這時雞體內抗體仍處于較高的水平,再次接種劑量較大的同種抗原時,雞體內大部分抗體與抗原發(fā)生中和反應,導致抗體水平的上升不太顯著。疫苗保護效力試驗表明,該疫苗對于強毒攻擊具有良好的保護作用,其中低劑量組的保護率最高,為100%,高劑量組為80%,隨著時間的延長攻毒后疫苗接種組從咽拭子中分離出支原體的概率明顯低于對照組。這一結果的不同可能是由于攻毒時3個劑量組Ms抗體水平的不同引起的,攻毒是在第3次免疫后第8周進行的,此時P2和P3組的抗體水平已經明顯下降,故對Ms的攻擊只能部分保護。另外Ms一經感染終身攜帶,但不一定會發(fā)病,試驗表明,感染1～4周齡的雞接觸健康雞后數(shù)日,健康雞的呼吸道中就能檢測到Ms的存在,所以從鼻拭子中分離出Ms并不能表明疫苗不具有保護力。

4 結 論

Ms滅活疫苗對雞具有較好的保護效果,免疫劑量會影響免疫應答,本研究得出的最佳免疫劑量為每只雞0.05 mg。