張 昕,張自強(qiáng),朱欣妍,張晨杰,劉玉梅

(河南科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,河南 洛陽(yáng) 471000)

兔球蟲病是家兔中最常見的也是危害最嚴(yán)重的寄生蟲病,被列為國(guó)家二類動(dòng)物疫病。根據(jù)國(guó)內(nèi)外學(xué)者的報(bào)道,各兔場(chǎng)均發(fā)現(xiàn)不同程度的球蟲感染[1-4]。按球蟲的種類和寄生部位不同可將兔球蟲病分為肝型、腸型和混合型。臨床上混合型和腸型常見,分別占31.75%和56.48%,肝型較為少見,約占3.34%[5]。兔球蟲病多發(fā)于幼兔,感染率、病死率高,可出現(xiàn)高達(dá)70%的死亡率;成年兔一般均可耐過(guò),但可排出卵囊成為長(zhǎng)期帶蟲者和傳染源,且耐過(guò)兔長(zhǎng)期消瘦、發(fā)育遲緩、體質(zhì)變差、抗病能力降低,極易繼發(fā)其他病原菌的感染[6]。兔大腸桿菌病是一種條件性致病菌,當(dāng)兔生活環(huán)境發(fā)生變化、飼養(yǎng)管理不當(dāng)、斷奶以及患上其他致使家兔抵抗力降低的疾病時(shí),通常會(huì)引起該病的發(fā)生,該病呈現(xiàn)暴發(fā)性、潛伏期短、死亡率高的特點(diǎn)[7]。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于兔混合型或腸型球蟲病繼發(fā)大腸桿菌報(bào)道較多,但關(guān)于兔肝球蟲與大腸桿菌混合感染報(bào)道較少[8]。本研究結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)中疑似兔肝球蟲與大腸桿菌混合感染病例,通過(guò)臨床癥狀觀察、病理剖檢、球蟲檢測(cè)以及從病兔組織分離病原菌,并進(jìn)行PCR鑒定、基因測(cè)序及藥敏試驗(yàn),確定球蟲感染類型以及病原菌的耐藥譜,對(duì)科學(xué)用藥、預(yù)防控制肝球蟲和大腸桿菌混合感染提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源

2021年1月,河南省某兔場(chǎng)商品兔群出現(xiàn)食欲不振、消瘦、腹圍增大并伴有明顯腹瀉癥狀為主要特征的疾病,病兔出現(xiàn)大量死亡,死亡率約70%。通過(guò)臨床觀察發(fā)病兔、病理剖檢、球蟲檢測(cè)及無(wú)菌采集病死兔肝臟、肺臟、氣管、腎臟、盲腸等組織,進(jìn)行病原菌的分離培養(yǎng)及檢測(cè)。

1.2 主要試劑與儀器

普通瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;藥敏紙片、細(xì)菌微量生化鑒定管購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司;Premix TaqTM(E× TaqTM Version 2.0 plus dye)購(gòu)自大連TaKaRa公司;細(xì)菌基因組DNA小量提取試劑盒、Proteinase K、DL2000 DNA Maker購(gòu)自北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司;溴化乙錠溶液購(gòu)自蘇州天可貿(mào)易有限公司。試驗(yàn)用主要儀器包括顯微鏡、臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)(Beckman Coulter)、普通PCR儀(Applied Biosystems 2720)、凝膠成像系統(tǒng)(BIORAD)、電泳儀(北京市六一儀器廠)。

1.3 球蟲檢測(cè)

取3～5 g新鮮糞便,加入7 mL飽和食鹽水,搗碎混勻,再加入50 mL飽和食鹽水,混勻后60目篩網(wǎng)過(guò)濾,取濾液,注滿麥克馬斯特板計(jì)數(shù)室,置于顯微鏡下放3～5 min,而后在顯微鏡下計(jì)數(shù)1 cm2的蟲卵總數(shù),求2個(gè)計(jì)數(shù)室中蟲卵數(shù)的平均數(shù),根據(jù)公式OPG=(n1/0.15)×60÷m計(jì)算出每克糞便中的蟲卵數(shù)(OPG)。其中n1為卵數(shù),0.15為每個(gè)計(jì)數(shù)室有效體積,60為糞液總體積,m為糞便克數(shù)。

肝球蟲檢測(cè):抽取膽汁涂片于玻片上,置于顯微鏡下檢測(cè)。

1.4 病原菌的分離純化

無(wú)菌采集病死兔肝臟、肺臟、氣管、腎臟、盲腸等組織,分別接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)24 h后,觀察菌落的生長(zhǎng)情況。挑取疑似單個(gè)菌落接種于麥康凱瓊脂平板上純化,并對(duì)純培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行革蘭染色,鏡檢。

1.5 生化試驗(yàn)

將分離的菌純培養(yǎng)物分別接種到微量生化管,37 ℃培養(yǎng)24～48 h,觀察并記錄結(jié)果。

1.6 引物設(shè)計(jì)與合成

選取GenBank中發(fā)布的大腸桿菌eae基因序列,經(jīng)DNA Star軟件對(duì)比分析后,利用Primer Primier 5.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)引物。引物由通用生物(安徽)股份有限公司合成,引物序列及目的片段的大小見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.7 分子生物學(xué)鑒定

取分離純化后的菌液,按照細(xì)菌基因組DNA小量提取試劑盒說(shuō)明書上的步驟進(jìn)行細(xì)菌DNA的提取后,以菌液的核酸為模板,分別進(jìn)行大腸桿菌eae基因的PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系25 μL:DNA模板 1 μL,Premix TaqTM 12.5 μL,上、下游引物各1 μL,ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件:94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s,54 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,30個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min;4 ℃保存。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)后,送至通用生物(安徽)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序,將測(cè)序結(jié)果與GenBank中已登錄的菌株進(jìn)行同源性比對(duì)分析,并利用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.8 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

將1株分離菌分別接種于普通營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)24 h后用平板法進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù),稀釋菌液濃度至109CFU/mL。將8只20 g左右SPF級(jí)KM小鼠隨機(jī)分為2組,每組4只,第1組每只小鼠分別腹腔注射稀釋好的菌液0.2 mL,對(duì)照組小鼠注射相同劑量的PBS。相同環(huán)境下飼養(yǎng),接種后觀察,對(duì)病死鼠進(jìn)行剖檢。

1.9 藥敏試驗(yàn)

按照美國(guó)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)推薦的K-B紙片法[9]進(jìn)行藥敏試驗(yàn)操作和結(jié)果判斷。將分離的菌接種到普通瓊脂培養(yǎng)基上,放入藥敏紙片,測(cè)量抑菌圈的直徑。抗生素紙片包括:紅霉素、慶大霉素、新霉素、四環(huán)素 、多西環(huán)素、復(fù)方新諾明、多黏菌素B、麥迪霉素、卡那霉素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、氨芐西林、丁胺卡那、頭孢哌酮、氯霉素。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床剖檢

病兔腹瀉嚴(yán)重,排出棕褐色水樣糞便,污染肛門周圍和后肢被毛(圖1A)。腸系膜出血,盲腸出血嚴(yán)重(圖1B)。膽囊充盈(圖1C)。肝臟腫大,表面和實(shí)質(zhì)有白色和淡黃色結(jié)節(jié),呈圓形,如粟粒至豌豆大,沿膽小管分布(圖1D)。

圖1 病死兔剖檢Fig. 1 Dissection of sick and dead rabbits

2.2 球蟲檢測(cè)結(jié)果

隨機(jī)抽取5只兔子取糞樣檢測(cè),OPG值分別是0.0156×104、0.0623×104、0.0321×104、0.0252×104、0.0276×104(圖2A),未達(dá)到腸球蟲感染標(biāo)準(zhǔn)(OPG≥0.5×104)[10]。膽汁涂片鏡檢可看到視野里出現(xiàn)大量球蟲卵囊(圖2B)。

圖2 球蟲檢測(cè)Fig. 2 Cryptococcus assay

2.3 細(xì)菌形態(tài)及培養(yǎng)特性觀察

經(jīng)細(xì)菌分離培養(yǎng),從5只病死兔肝臟中分離到5株細(xì)菌,5株菌體形態(tài)特征、培養(yǎng)特性、生化特性和藥物敏感性一致。細(xì)菌在普通瓊脂上生長(zhǎng)后,能看到不產(chǎn)生色素、圓形、中等大小、表面有微微凸起、邊緣整齊、半透明灰白色的菌落(圖3A),在麥康凱瓊脂平板上能形成紅色菌落(圖3B)。革蘭染色鏡檢可見染色陰性、無(wú)芽孢的中等大小直桿菌,大小為(0.4～0.7)μm×(2～3)μm,其菌體兩端鈍圓,多單個(gè)散在或者成對(duì)排列(圖3C)。

圖3 細(xì)菌培養(yǎng)形態(tài)及革蘭氏染色A.普通瓊脂培養(yǎng);B. 麥康凱瓊脂培養(yǎng);C.革蘭染色鏡檢Fig. 3 Bacterial culture morphology and Gram stainingA. Ordinary AGAR culture;B. McConkey AGAR culture;C. Gram staining microscopy

2.4 生化試驗(yàn)

細(xì)菌理化性質(zhì)見表2,其理化性質(zhì)符合大腸桿菌的生化特性。因此,據(jù)分離菌形態(tài)、培養(yǎng)特性及表2生化特性分析結(jié)果,初步判定此次分離培養(yǎng)菌為大腸桿菌。

表2 生化試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Biochemical test results

2.5 分子生物學(xué)鑒定

經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后,5只兔子的肝臟處分離得到的細(xì)菌約在833 bp處出現(xiàn)特異性條帶(圖4 )。分別將2種擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI blast分析,采用DNAStar軟件中MegAlign進(jìn)行多序列比對(duì),采用MEGA 7.0軟件分別構(gòu)建其遺傳進(jìn)化樹,結(jié)果見圖5。

圖4 分離菌eae基因 PCR擴(kuò)增電泳圖M. DL2000 Marker;1～5.分離菌株Fig. 4 eae gene PCR amplification electrophoresis of isolation bacteriaM. DL2000 Marker; 1～5. Isolated strains

圖5 分離菌16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹(鄰接法構(gòu)建)Fig. 5 Phylogenetic tree of isolation bacteria 16S rRNA gene(Neighbor-joining,NJ)

2.6 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

通過(guò)動(dòng)物回歸試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),對(duì)照組小鼠在觀察期內(nèi)無(wú)臨床癥狀。試驗(yàn)組小鼠在注射24 h后出現(xiàn)精神沉郁、進(jìn)食減少、嗜睡等癥狀,48 h后開始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象,至72 h 小鼠死亡3只,余1只存活,存活小鼠精神沉郁,被毛無(wú)光澤,厭食消瘦。死亡小鼠剖檢觀察發(fā)現(xiàn)皮下有出血點(diǎn),腹水充盈,肝臟淤血腫大,腎臟腫大有出血點(diǎn),腸道內(nèi)容物有血塊。肝臟、腎臟等組織接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng),分離菌的菌落特征和染色鏡檢結(jié)果均與原分離菌株一致,16S rRNA的PCR鑒定證實(shí)序列與原分離株相同。

2.7 藥敏試驗(yàn)

根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS,2004年第14版)[9]推薦的K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)及結(jié)果判定。將該大腸桿菌接種到普通瓊脂培養(yǎng)基上,放入藥敏紙片,測(cè)量抑菌圈的直徑。大腸桿菌對(duì)不同藥物的敏感性見表3。由表3可知,大腸桿菌對(duì)多黏菌素B、丁胺卡那、氨芐西林、頭孢哌酮敏感,對(duì)環(huán)丙沙星表示中介,對(duì)紅霉素、慶大霉素、新霉素、麥迪霉素、四環(huán)素、卡那霉素、多西環(huán)素、復(fù)方新諾明、諾氟沙星、氯霉素不敏感。

表3 不同藥物對(duì)大腸桿菌菌株的抑菌效果Table 3 Bacteriostatic effects of different drugs on Brodetella bronchiseptica strains

3 討 論

兔球蟲病是養(yǎng)兔業(yè)危害最大的疾病之一,因球蟲造成的經(jīng)濟(jì)損失高居首位[11]。球蟲按感染部位可分為肝型、腸型和混合型,臨床上以混合型和腸型較為常見。Okumu等[12]通過(guò)抽檢肯尼亞農(nóng)場(chǎng)2 680只兔發(fā)現(xiàn)兔球蟲感染率85.1%,其中腸球蟲29.5%,肝球蟲11.5%,其余為混合感染。張嘉等[13]對(duì)福建某肉兔場(chǎng)球蟲感染進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)球蟲總感染率為89.79%,以腸球蟲為主,混合型為次。葉勇剛等[14]對(duì)四川規(guī)模兔場(chǎng)球蟲病感染情況調(diào)查顯示總感染率為71.11%,其中1～3月齡幼兔感染率達(dá)96%,全部為混合型感染。彭家煒[15]對(duì)河南南陽(yáng)地區(qū)兔球蟲病流行病學(xué)進(jìn)行調(diào)查,發(fā)現(xiàn)總感染率為52.5%,幼兔的感染率顯著高于其他年齡段,均屬于混合型和腸型。ElShahawi等[16]調(diào)查了埃及家兔球蟲的感染情況,發(fā)現(xiàn)感染率達(dá)到70%,大多數(shù)是腸球蟲,混合型和肝型少見。

兔大腸桿菌病是兔養(yǎng)殖中的主要傳染病之一,癥狀以腹瀉為主,具有潛伏期短、死亡率高的特點(diǎn)。大腸桿菌極易產(chǎn)生耐藥性,近年來(lái)抗生素頻繁使用導(dǎo)致大腸桿菌耐藥性愈發(fā)嚴(yán)重,病情復(fù)雜化,治療難度增加,且各個(gè)地區(qū)臨床用藥的不同造成大腸桿菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性呈現(xiàn)出不同程度的差異。韓超逸等[17]報(bào)道貴州省某兔場(chǎng)爆發(fā)大腸桿菌病,發(fā)病率17%,死亡率14%,藥敏結(jié)果顯示僅對(duì)慶大霉素和頭孢曲松敏感。王孝友[18]報(bào)道重慶市某兔場(chǎng)大腸桿菌對(duì)環(huán)丙沙星、慶大霉素、氟派酸、新霉素敏感,發(fā)病初期未能及時(shí)采取敏感藥物治療導(dǎo)致60日齡病兔腹瀉嚴(yán)重,發(fā)病后很快死亡。王佳佳等[19]報(bào)道河南省某兔場(chǎng)大腸桿菌與克雷伯氏菌混合感染導(dǎo)致病兔腹瀉迅速死亡,藥敏結(jié)果顯示大腸桿菌對(duì)慶大霉素、環(huán)丙沙星、頭孢氨芐、頭孢唑啉、頭孢哌酮、頭孢拉定、氨芐西林7種藥物敏感。高?；鄣萚20]報(bào)道分離得到的75株牛源大腸桿菌對(duì)阿莫西林、哌拉西林、氨芐西林、頭孢唑啉、氟苯尼考、恩諾沙星、四環(huán)素的耐藥率均大于90%,且多重耐藥菌株占85.33%,耐藥嚴(yán)重。王昌建[21]報(bào)道79株臨床分離的豬源大腸桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺酶類的藥物氨芐西林耐藥率為92.4%。

本次發(fā)病兔場(chǎng)病兔精神沉郁、食欲減退、俯臥不動(dòng)、消瘦、腹脹、肝區(qū)觸診有痛感,腹瀉嚴(yán)重,排出棕褐色水樣糞便,死亡前歪倒,慘叫而亡。通過(guò)采取飽和食鹽水漂浮法對(duì)兔場(chǎng)病兔進(jìn)行糞檢,檢測(cè)出球蟲的OPG值未達(dá)到腸球蟲感染標(biāo)準(zhǔn)(OPG≥0.5×104)。剖檢多只病兔后觀察發(fā)現(xiàn)個(gè)別肝臟表面和實(shí)質(zhì)有白色和淡黃色條形結(jié)節(jié),沿膽小管分布。抽取膽汁涂片顯微鏡下可見大量球蟲卵囊,其余病兔膽汁均可觀察到球蟲卵囊,是典型的由斯氏艾美耳球蟲寄生在肝臟和膽管上皮細(xì)胞造成的肝球蟲癥狀[10]。后經(jīng)細(xì)菌的分離培養(yǎng)、PCR鑒定和進(jìn)一步的測(cè)序,確定分離菌為大腸桿菌,藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,該菌僅對(duì)多黏菌素B、丁胺卡那、氨芐西林、頭孢哌酮敏感,對(duì)其他藥物有較強(qiáng)抗性,耐藥嚴(yán)重。該兔場(chǎng)發(fā)病后,兔場(chǎng)技術(shù)人員檢測(cè)了糞便中的球蟲卵囊,未見球蟲感染,與實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果一致。由于肝球蟲感染在臨床球蟲感染中較為少見,且前期臨床和病理變化不明顯,導(dǎo)致該場(chǎng)技術(shù)人員未能及時(shí)發(fā)現(xiàn)肝球蟲及對(duì)癥治療,僅當(dāng)做細(xì)菌感染治療。在使用大量針對(duì)細(xì)菌感染治療的藥物后,仍然不能有效控制兔群發(fā)病,兔群在肝球蟲與大腸桿菌相互協(xié)同作用下,病死率高達(dá)70%,造成兔場(chǎng)損失慘重。該兔場(chǎng)最終根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果,采用磺胺氯丙嗪鈉與丁胺卡那聯(lián)合用藥,控制住了兔場(chǎng)大規(guī)模的發(fā)病,療效顯著,避免了更大的經(jīng)濟(jì)損失。

在兔的養(yǎng)殖過(guò)程中,單獨(dú)的肝球蟲感染較為少見,球蟲感染常常會(huì)繼發(fā)細(xì)菌性感染,生產(chǎn)中應(yīng)以預(yù)防為主、治療為輔,預(yù)防上采取加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、消毒保持兔舍衛(wèi)生、定期使用藥物預(yù)防球蟲。在該病流行季節(jié)采取輪換或穿梭用藥進(jìn)行預(yù)防。一旦發(fā)病,使用抗球蟲藥并通過(guò)藥敏試驗(yàn)篩選出細(xì)菌敏感藥物進(jìn)行科學(xué)合理的治療。