姚 芳，吳 平，劉 萍*，王力欣

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院 食品科技學(xué)院，江蘇 泰州 225300）

黑果腺肋花楸（Aronia melanocarpa）于2018年被列入我國新食品原料，其果實(shí)含有豐富的多酚、花青素、維生素、有機(jī)酸、多糖等多種活性成分[1-3]。研究表明，黑果腺肋花楸具有抗氧化[4]、抑菌抗炎[5-6]、調(diào)節(jié)大腦功能[7]、降血壓[8]和降血糖[9]等功效，因而受到學(xué)者和食品從業(yè)者的廣泛關(guān)注[10]。黑果腺肋花楸的多酚含量是藍(lán)莓的5倍，抗氧化活性是蔓越莓的9倍，是已知植物中含量最高的[11]，但由于黑果腺肋花楸的單寧含量較高，口感酸澀，故鮮食不易被消費(fèi)者接受，因此將花楸果進(jìn)行發(fā)酵可改善其食用品質(zhì)[12]。發(fā)酵制果酒是花楸加工的一個(gè)主要方向，可豐富花楸風(fēng)味，改善口感，提高食用價(jià)值。WITKOWSKA A M等[13]研究發(fā)現(xiàn)，黑果腺肋花楸果酒的抗氧化能力強(qiáng)于紅葡萄酒、黑加侖酒、醋栗果酒。

本研究以黑果腺肋花楸果為原料進(jìn)行果酒釀造，以感官評分為評價(jià)指標(biāo)，通過單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)對黑果腺肋花楸果酒發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，并對果酒的品質(zhì)、多酚含量、花色苷含量及抗氧化活性進(jìn)行研究，旨在研制出風(fēng)味佳、抗氧化活性強(qiáng)的黑果腺肋花楸果酒，為花楸資源的深加工提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑果腺肋花楸果：產(chǎn)地遼寧大連；果膠酶（50 000 U/g）、纖維素酶（10 000 U/g）：河南萬邦實(shí)業(yè)有限公司；偏重亞硫酸鉀（分析純）：河南禾興生物科技有限公司；檸檬酸（分析純）：廣州利成實(shí)業(yè)有限公司；安琪果酒專用酵母（RW）：安琪酵母股份有限公司；白砂糖：上海市糖業(yè)煙酒有限公司；沒食子酸（純度≥99%）、2,2'-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazo line-6-sulphonate），ABTS）（純度≥98%）：北京沃凱生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（純度≥98%）：美國Sigma公司；福林酚試劑、過硫酸鉀、甲醇（99.5%）、硫酸亞鐵、水楊酸、抗壞血酸等試劑（分析純）：國藥集團(tuán)。

1.2 儀器與設(shè)備

XY600-2C型電子秤：常州市幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司；HH-S8型水浴鍋：金壇市全城國盛實(shí)驗(yàn)儀器廠；DF-101SE型磁力攪拌器：南京予華儀器有限責(zé)任公司；HT 512ATC型酒精度折射儀：福安普和電子有限公司；1001-00A型恒溫培養(yǎng)箱：佛山勁申機(jī)電設(shè)備有限公司；PHS-3E酸度計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；WZS 32手持折光儀糖度計(jì)：上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司；BT25S型電子分析天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；DHG9101-2S型電熱恒溫干燥箱：上海精科實(shí)業(yè)有限公司；T6-紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；PRIMOR型高速冷凍離心機(jī)：美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 黑果腺肋花楸果酒發(fā)酵工藝流程與操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：

原料預(yù)處理：挑選無霉變、完好的黑果腺肋花楸果，洗凈、晾干、直接打漿。

酶解：取黑果腺肋花楸果漿1 000 g，加入0.2%的果膠酶和0.2%的纖維素酶，攪拌均勻，50 ℃酶解2 h，再90 ℃滅酶5 min，冷卻至室溫。

添加偏重亞硫酸鉀：使用100目尼龍網(wǎng)濾布過濾，過濾出的果汁直接添加80 mg/L偏重亞硫酸鉀，攪拌溶解。

成分調(diào)整：使用檸檬酸將黑果腺肋花楸果汁pH值調(diào)節(jié)至3.0～5.0，補(bǔ)加一定量白砂糖調(diào)節(jié)黑果腺肋花楸果汁的初始糖度。

酵母發(fā)酵：將11 g安琪果酒酵母RW加入110 mL由無菌水配制的50 g/L糖水中，37 ℃活化30 min，以一定的比例接種至黑果腺肋花楸果汁中，25 ℃恒溫發(fā)酵一定時(shí)間。

陳釀、過濾：使用300目尼龍網(wǎng)濾布過濾，4 ℃陳釀10 d后即為黑果腺肋花楸果酒成品。

1.3.2 黑果腺肋花楸果酒發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，設(shè)定果膠酶的添加量0.2%、纖維素酶的添加量0.2%、偏重亞硫酸鉀的添加量80 mg/L、發(fā)酵溫度25 ℃為固定水平，以黑果腺肋花楸果酒的感官評分、酒精度為評價(jià)指標(biāo)，分別考察酵母接種量（0.4%、0.7%、1.0%、1.3%、1.6%）、初始糖度（18 °Bx、20 °Bx、22 °Bx、24 °Bx、26 °Bx）、初始pH值（3.5、4.0、4.5、5.0、5.5）、發(fā)酵時(shí)間（5 d、6 d、7 d、8 d、9 d）對黑果腺肋花楸果酒品質(zhì)的影響。

1.3.3 黑果腺肋花楸果酒發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以釀酒酵母接種量（A）、初始糖度（B）、初始pH值（C）和發(fā)酵時(shí)間（D）為影響因素，以感官評分為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)4因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)，響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 黑果腺肋花楸果酒發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface method for fermentation technology optimization of A. melanocarpa fruit wine

1.3.4 測定方法

黑果腺肋花楸果酒的感官評價(jià)分析：參考魏春雨[14]的方法，根據(jù)NY/T 1508—2017《綠色食品 果酒》，選取具有一定果酒感官評定經(jīng)驗(yàn)的10人組成評價(jià)小組，對黑果腺肋花楸果酒從外觀、風(fēng)格、香氣、滋味4個(gè)方面進(jìn)行打分，取10人平均分，滿分100分。感官評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 黑果腺肋花楸果酒感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standard of A. melanocarpa fruit wine

DPPH自由基清除率：參考金海炎等[15]的方法進(jìn)行測定；ABTS+自由基清除率：參考吳雙從等[16]的方法進(jìn)行測定；羥自由基清除率：參考YANG H等[17]的方法進(jìn)行測定；多酚含量：參照姚芳等[18]的方法采用福林酚法進(jìn)行測定；花青素含量：參照魏春雨[14]的方法采用pH示差法進(jìn)行測定。

酒精度：酒精度折射儀進(jìn)行測定；糖度：手持式糖度儀進(jìn)行測定；總糖、總酸、揮發(fā)酸含量：分別參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的直接滴定法、電位滴定法和蒸餾法進(jìn)行測定；菌落總數(shù)：參照GB 4789.2—2022《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定》進(jìn)行測定；大腸菌群：參照國標(biāo)GB 4789.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》進(jìn)行測定。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert 8.06和Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，利用SPSS 23.0軟件進(jìn)行顯著性分析。每個(gè)數(shù)據(jù)重復(fù)測定3次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑果腺肋花楸果酒發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 釀酒酵母接種量對黑果腺肋花楸果酒品質(zhì)的影響

釀酒酵母接種量對黑果腺肋花楸果酒品質(zhì)的影響見圖1。

圖1 釀酒酵母接種量對黑果腺肋花楸果酒品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of Saccharomyces cerevisiae inoculum on the quality of A. melanocarpa fruit wine

由圖1可知，隨著釀酒酵母接種量的增加，黑果腺肋花楸果酒感官評分、酒精度均呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢。酵母接種量較低時(shí)，因發(fā)酵不完全而產(chǎn)生的乙醇較少，酒香也不明顯，故感官評分也低；而酵母接種量過大時(shí)，酵母菌的自身繁殖消耗了大量的營養(yǎng)物質(zhì)，增加了產(chǎn)酸量，會(huì)抑制酵母菌的生長，生成的酒精量減少，同時(shí)破壞了果酒的風(fēng)味[19]，感官評分也降低。酵母接種量為1.0%時(shí)，黑果腺肋花楸果酒的感官評分、酒精度均達(dá)到最高，分別為84.2分、9.34%vol；且顯著高于其他接種量（P＜0.05）。此時(shí)，黑果腺肋花楸果酒的品質(zhì)達(dá)到最佳，故選擇較適的釀酒酵母接種量為1.0%。

2.1.2 初始糖度對黑果腺肋花楸果酒品質(zhì)的影響

初始糖度對黑果腺肋花楸果酒品質(zhì)的影響見圖2。

圖2 初始糖度對黑果腺肋花楸果酒品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of different initial sugar content on the quality of A. melanocarpa fruit wine

由圖2可知，隨著初始糖度的增加，黑果腺肋花楸果酒感官評分、酒精度均呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢。糖類是酵母發(fā)酵所需的重要營養(yǎng)物質(zhì)，適量的糖會(huì)促進(jìn)酵母的發(fā)酵；初始糖度較低時(shí)，酵母發(fā)酵不充分，不利于酒精度和風(fēng)味的形成，酒體單薄，感官評分低[19]。但初始糖度過高時(shí)，由于高滲透作用會(huì)抑制酵母菌的生長[20]，導(dǎo)致酒精度下降，果酒甜度過高，破壞了果酒的糖酸比，感官評分下降。初始糖度為22°Bx時(shí)，黑果腺肋花楸果酒的感官評分、酒精度均達(dá)到最高，分別為85.8分、9.42%vol；且顯著高于其他初始糖度（P＜0.05）。故選擇較適的初始糖度為22°Bx。

2.1.3 初始pH值對黑果腺肋花楸果酒品質(zhì)的影響

初始pH值對黑果腺肋花楸果酒品質(zhì)的影響見圖3。

圖3 初始pH值對黑果腺肋花楸果酒品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of initial pH value on the quality of A. melanocarpa fruit wine

由圖3可知，隨著初始pH值的增加，黑果腺肋花楸果酒感官評分、酒精度均呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢。酵母菌有其生長的最適pH值，過低或過高的pH值會(huì)影響酵母菌的生長和發(fā)酵產(chǎn)物的生成。當(dāng)初始pH值過低或過高時(shí)，酵母菌生長緩慢，酒精度下降，發(fā)酵產(chǎn)物減少，果酒的風(fēng)味較平淡，感官評分下降[21]。初始pH值為4.5時(shí)，黑果腺肋花楸果酒的感官評分、酒精度均為達(dá)到最高，分別為84.8分、9.48%vol。故選擇較適的初始pH值為4.5。

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間對黑果腺肋花楸果酒品質(zhì)的影響

發(fā)酵時(shí)間對黑果腺肋花楸果酒品質(zhì)的影響見圖4。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對黑果腺肋花楸果酒品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of fermentation time on the quality of A. melanocarpa fruit wine

由圖4可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，黑果腺肋花楸果酒感官評分呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢，酒精度呈先上升后平緩的趨勢。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間短時(shí)，花楸發(fā)酵未完全，果酒的酒精度低，酒味偏淡，酒體中殘?zhí)呛扛?，口感偏甜；而?dāng)發(fā)酵時(shí)間過長時(shí)，果酒中殘?zhí)呛科停诟衅?，酒體不協(xié)調(diào)，酒精度變化差異不顯著，與王娟等[22]有關(guān)拐棗山楂果酒發(fā)酵的研究結(jié)果相似。發(fā)酵時(shí)間為7 d時(shí)，果酒的感官評分最高，且顯著高于其他發(fā)酵時(shí)間（P＜0.05），酒精度也達(dá)到了最大值，分別為86.5分、9.40%vol。故選擇較適的發(fā)酵時(shí)間為7 d。

2.2 黑果腺肋花楸果酒發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)分析

黑果腺肋花楸果酒發(fā)酵條件優(yōu)化的響應(yīng)面試驗(yàn)分析見表3。

表3 黑果腺肋花楸果酒發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface tests for optimization of fermentation conditions of A. melanocarpa fruit wine

利用Design-Expert 8.06數(shù)據(jù)分析軟件對表3的結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到回歸模型的二次多項(xiàng)方程：

Y=87.14+1.18A-0.58B-0.54C-0.98D-1.0AB-0.68AC-0.7AD+

0.6BC+0.75BD+2.35CD-2.98A2-3.92B2-3.73C2-1.37D2

2.2.2 黑果腺肋花楸果酒感官評分回歸模型的方差分析

以黑果腺肋花楸果酒感官評分為考察指標(biāo)的模型及回歸系數(shù)進(jìn)行回歸分析，結(jié)果見表4。

表4 感官評分回歸模型的方差分析Table 4 Variance analysis of regression model of sensory score

從表4可以看出，黑果腺肋花楸果酒感官評分模型的F值為83.09，該模型極顯著（P＜0.01）。失擬項(xiàng)P=0.072 2＞0.05不顯著，表明響應(yīng)面模型有效。決定系數(shù)R2值為0.988 1，校正決定系數(shù)R2Adj為0.976 2，預(yù)測決定系數(shù)R2Pred=0.935 3，說明模型的擬合效果好、數(shù)據(jù)可信度高，預(yù)測性好。回歸方程中一次項(xiàng)A、B、C、D，交互項(xiàng)AB、AD、BD、CD和二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對黑果腺肋花楸果酒感官評分有極顯著影響（P＜0.01），交互項(xiàng)AC和BC對黑果腺肋花楸果酒感官評分有顯著影響（P＜0.05）。

2.2.3 響應(yīng)面作用的交互作用分析

各因素交互作用對黑果腺肋花楸果酒感官評分影響的響應(yīng)曲面及等高線見圖5。

圖5 各因素交互作用對黑果腺肋花楸果酒感官評分響應(yīng)曲面和等高線Fig.5 Response surface plot and contour lines effect of interaction between various factors on the sensory score of A. melanocarpa fruit wine

由圖5可知，AB、AD、BD、CD交互作用的響應(yīng)面圖中等高線密度分布不均勻，曲面陡峭，表明AB、AD、BD、CD交互作用強(qiáng)，對黑果腺肋花楸果酒的感官評分影響極顯著（P＜0.01），與表4的方差分析結(jié)果一致。以AB交互作用的響應(yīng)面圖為例，當(dāng)初始糖度（B）一定時(shí)，隨著酵母接種量（A）的增加，黑果腺肋花楸果酒感官評分呈現(xiàn)出先增加，達(dá)到峰值后再顯著下降，響應(yīng)面曲面的變化十分陡峭。同時(shí)，從等高線的疏密程度來看，酵母接種量（A）對果酒的感官評分的影響高于初始糖度（B）。由此可知，各因素對黑果腺肋花楸果酒感官評分的影響順序?yàn)榻湍附臃N量＞初始糖度＞發(fā)酵時(shí)間＞初始pH值。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

經(jīng)Design-Expert 23.0軟件分析得到最優(yōu)發(fā)酵條件為酵母接種量1.05%、初始糖度21.77 °Bx、初始pH值4.47、發(fā)酵時(shí)間6.33 d。在此條件下，得黑果腺肋花楸果酒感官評分預(yù)測值為87.6分?？紤]實(shí)際操作的便利性，將該條件修正為酵母接種量1.0%、初始糖度21.8 °Bx、初始pH值4.5、發(fā)酵時(shí)間6.4 d，進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，測得黑果腺肋花楸果酒感官評分實(shí)際值為（87.2±1.3）分，與黑果腺肋花楸果酒感官評分的預(yù)測值相差不大。

2.4 黑果腺肋花楸果酒成品的檢測結(jié)果

最佳發(fā)酵工藝下釀造出的黑果腺肋花楸果酒色澤呈深紅色有光澤，澄清無沉淀，花楸果香濃郁、酸甜協(xié)調(diào)，酒體豐滿，風(fēng)格優(yōu)雅，感官評分達(dá)87.2分；酒精度、總酸、揮發(fā)酸、總糖分別為9.56%vol、7.62 g/L、0.18 g/L、8.15 g/L，理化和微生物指標(biāo)均符合NY/T 1508—2017《綠色食品果酒》標(biāo)準(zhǔn)。

2.5 黑果腺肋花楸果酒的抗氧化活性分析

對黑果腺肋花楸果酒的總多酚、花青素及抗氧化活性進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖6和圖7。

圖6 黑果腺肋花楸果汁及果酒的總多酚和花青素的含量Fig.6 Total polyphenols and anthocyanins contents of A. melanocarpa juice and fruit wine

圖7 黑果腺肋花楸果汁及果酒的抗氧化活性Fig.7 Antioxidant activities of A. melanocarpa juice and fruit wine

由圖6和圖7可知，與黑果腺肋花楸果汁相比，發(fā)酵后的果酒中總多酚含量3 617.3 mg/L、花青素含量697.6 mg/L、DPPH自由基清除率93.8%、ABTS自由基清除率88.4%和羥自由基清除率76.5%，均顯著增加（P＜0.05），與WILKOWSKA A等[23]的研究結(jié)果相似。黑果腺肋花楸果酒的DPPH、ABTS自由基清除率與0.3%維生素C（vitamin C，VC）的測定結(jié)果無顯著性差異（P＞0.05），羥自由基清除率顯著低于0.3%VC（P＜0.05）。說明在發(fā)酵過程中，酵母菌產(chǎn)生的各種酶系作用可使大分子酚類物質(zhì)和花青素轉(zhuǎn)化成可溶性的小分子物質(zhì)，黑果腺肋花楸果實(shí)和果皮中的總多酚和花青素等抗氧化物質(zhì)能更有效的釋放溶出[24]，同時(shí)發(fā)酵產(chǎn)生的酒精也有助于酚類物質(zhì)和花青素的溶出[25]，故果酒中抗氧化活性成分含量升高，抗氧化活性顯著提升。

3 結(jié)論

本研究采用單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)對黑果腺肋花楸果酒的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳發(fā)酵工藝條件為釀酒酵母接種量1.0%、初始糖度21.8 °Bx、初始pH值4.5、發(fā)酵時(shí)間6.4 d，所制得的果酒呈深紅色有光澤，澄清無沉淀，花楸果香濃郁，酸甜協(xié)調(diào)，感官評分達(dá)87.2分，酒精度為9.56%vol，多酚含量為3 617.3 mg/L，花青素含量697.6 mg/L，DPPH自由基清除率93.8%，ABTS自由基清除率88.4%，羥自由基清除率76.5%，各項(xiàng)理化和微生物限量均符合NY/T 1508—2017《綠色食品果酒》標(biāo)準(zhǔn)。成品果酒中總多酚含量、花青素含量、DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率和羥自由基清除率均顯著高于未發(fā)酵的果汁，具有較強(qiáng)的抗氧化活性，可為高品質(zhì)黑果腺肋花楸果酒的開發(fā)提供依據(jù)。后期將進(jìn)一步對黑果腺肋花楸果酒的生理功能進(jìn)行研究。