彭怡 許紅玉 黃厚強(qiáng) 張曲

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，LM），簡(jiǎn)稱為單增李斯特氏菌，是一種需氧兼性厭氧的食源性病原菌、革蘭氏陽(yáng)性短桿菌，廣泛存在于自然界中。其中，奶制品、肉制品、水產(chǎn)品、海產(chǎn)品、禽類食品、蔬菜等容易受到該菌污染，誤食用含有該菌的新生兒、老年人等免疫力低者易患腦膜炎、敗血癥，孕婦則易發(fā)生早產(chǎn)或流產(chǎn)，致死率高達(dá)20%-30%，給食品安全造成嚴(yán)重威脅。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外關(guān)于單增李斯特氏菌的主要檢測(cè)方法包括國(guó)標(biāo)法、免疫學(xué)檢測(cè)法、生物傳感器檢測(cè)法等，這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。能力驗(yàn)證通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)室間的檢驗(yàn)?zāi)芰M(jìn)行比對(duì)，評(píng)價(jià)參加者的能力，是證明實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)?zāi)芰Φ闹匾绞街?。資陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心生物檢驗(yàn)科參加了由四川省食品檢驗(yàn)研究院組織的“食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢驗(yàn)?zāi)芰︱?yàn)證”，采用國(guó)標(biāo)法《GB 4789.30-2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》第一法對(duì)樣品進(jìn)行定性檢驗(yàn)。

一、材料與方法

1.樣品。由四川省食品檢驗(yàn)研究院提供3份單核細(xì)胞增生李斯特氏菌樣品，每份樣品包括一瓶白色球狀西林瓶裝和一袋質(zhì)量約為25g的奶粉，樣品編號(hào)分別為L(zhǎng)M-029、LM-177和LM-307。

2.菌種。單增李斯特氏菌ATCC 19115、斯氏李斯特氏菌ATCC 35967、伊氏李斯特氏菌ATCC 19119、英諾克李斯特氏菌ATCC 33090，均由廣東環(huán)凱生物科技有限公司提供。

3.主要試劑。腦心浸出液肉湯（BHI）、李氏菌增菌肉湯（LB1，LB2）基礎(chǔ)、PALCAM瓊脂、李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基、SIM生化管、HBI單增李斯特氏菌生化鑒定條（GB），購(gòu)自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基、PALCAM瓊脂、含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆瓊脂（TSA-YE）、血平板、革蘭氏染色液試劑盒、3%過(guò)氧化氫、單增李斯特氏菌干制生化鑒定試劑盒，購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

4.主要儀器。電子天平（上海浦春 JEB602），恒溫恒濕培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn) LRHS-150-II），生化培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn) SPX-300-II），生物安全柜（蘇州博萊爾 BHC-1300IIB2），立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安 LDZH-150KBS），顯微鏡（Leica 1349522X）。

5.方法。依據(jù)四川省食品檢驗(yàn)研究院提供的《食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢驗(yàn)?zāi)芰︱?yàn)證作業(yè)指導(dǎo)書(shū)》和《GB 4789.30-2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》第一法對(duì)樣品進(jìn)行定性檢驗(yàn)。

二、過(guò)程與結(jié)果

1.樣品的前處理。在生物安全柜內(nèi)將單核細(xì)胞增生李斯特氏菌樣品的西林瓶打開(kāi)，取225mL滅菌LB1增菌液，加入到無(wú)菌均質(zhì)袋中，并將西林瓶?jī)?nèi)白色小球加入LB1增菌液中，充分溶解。然后將與西林瓶相同編碼的奶粉樣品加入到上述LB1增菌液中，在拍擊式均質(zhì)器上連續(xù)均質(zhì)1-2min，使其混勻。依此方法分別對(duì)3份樣品進(jìn)行處理。

2.增菌。于（30±1）℃培養(yǎng)（24±2）h，移取0.1mL，轉(zhuǎn)種于10mL LB2增菌液內(nèi)，于（30±1）℃培養(yǎng)（24±2）h。

3.分離。取LB2二次增菌液劃線接種于李斯特氏菌顯色平板和PALCAM瓊脂平板，于（36±1）℃培養(yǎng)24-48h，觀察各個(gè)平板上生長(zhǎng)的菌落。典型菌落在 PALCAM 瓊脂平板上為小的圓形灰綠色菌落，周?chē)凶睾谏馊Γ行┚溆泻谏枷?；在李斯特氏菌顯色平板上的菌落特征，參照產(chǎn)品說(shuō)明進(jìn)行判定。

4.初篩及鑒定。自選擇性瓊脂平板上分別挑取3-5個(gè)典型或可疑菌落，分別接種木糖、鼠李糖發(fā)酵管，于（36±1）℃培養(yǎng)（24±2）h，同時(shí)在TSA-YE平板上劃線，于（36±1）℃培養(yǎng)18-24h，然后選擇木糖陰性、鼠李糖陽(yáng)性的純培養(yǎng)物繼續(xù)進(jìn)行染色鏡檢、動(dòng)力實(shí)驗(yàn)、生化鑒定及溶血實(shí)驗(yàn)。

5.結(jié)果。通過(guò)國(guó)標(biāo)法檢驗(yàn)與鑒定，樣品LM-177檢出單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，樣品LM-029和LM-307未檢出，各樣品增菌和分離結(jié)果如表1和圖1-圖4所示，鑒定結(jié)果如表2和圖5-圖6所示。

三、討論與分析

顯色培養(yǎng)基是一種基于生化反應(yīng)的微生物鑒定技術(shù)，通過(guò)加入特定底物，在特異性酶的作用下，發(fā)色基團(tuán)游離并顯色，從而對(duì)菌種進(jìn)行鑒別。通過(guò)圖1-圖4可以觀察到，PALCAM培養(yǎng)基雖然可以分離出李斯特氏菌，但不能有效區(qū)分單增李斯特氏菌和其他李斯特氏菌，所有種類的李斯特氏菌均為灰綠色菌落且菌落周?chē)寄墚a(chǎn)生棕黑色暈圈；而李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基能夠通過(guò)藍(lán)綠色菌落且周?chē)袩o(wú)不透明環(huán)，有效區(qū)分單增李斯特氏菌和其他李斯特氏菌，其特異性明顯高于PALCAM培養(yǎng)基。最終，資陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心生物檢驗(yàn)科在此次能力驗(yàn)證考核中獲得的結(jié)果為“滿意”。

雖然順利通過(guò)了考核，但實(shí)驗(yàn)中仍有許多需要注意、改進(jìn)和總結(jié)的地方。例如，剛開(kāi)始制備李斯特氏菌顯色平板，在添加配套試劑時(shí)，可能是因?yàn)闆](méi)有很好地把控培養(yǎng)基溫度，也可能是因?yàn)闆](méi)有一邊少量多次加入添加劑一邊搖晃玻璃瓶，導(dǎo)致培養(yǎng)基出現(xiàn)許多絮狀物，不得不重新配制新的顯色培養(yǎng)基。再如，在李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)中，為避免產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果（菌落周?chē)霈F(xiàn)不透明環(huán)），有的廠家建議培養(yǎng)24h，有的則建議培養(yǎng)24-48h，實(shí)際操作過(guò)程中我們發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)48h的樣品菌落更大、更明顯。而為了避免假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，我們挑取了三個(gè)樣品的所有典型和可疑菌落分別進(jìn)行后續(xù)鑒定試驗(yàn)，在生化鑒定（圖5）中觀察到，三個(gè)樣品的生化鑒定結(jié)果與目標(biāo)菌——單增李斯特氏菌一模一樣，為此只能再通過(guò)溶血試驗(yàn)（圖6）進(jìn)行觀察與判斷。但溶血試驗(yàn)的操作難度較大，要求穿刺時(shí)在不能使瓊脂破裂的情況下盡量接近底部，否則很容易出現(xiàn)漏檢或者假陽(yáng)性的可能。

通過(guò)此次能力驗(yàn)證，我們不僅找到不足之處，還通過(guò)實(shí)驗(yàn)分析尋找到解決問(wèn)題的方法和對(duì)策，積累了許多經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)，提高了自身的檢驗(yàn)?zāi)芰Α?/p>

作者簡(jiǎn)介：彭怡（1994-），女，漢族，四川成都人，工程師，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸锵嚓P(guān)檢測(cè)。

*通信作者：張曲（1991-），女，漢族，四川自貢人，工程師，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称芳庸づc安全及質(zhì)量控制。