季 拓，高玉芝，王 彥，高緒柱*

1江蘇大學(xué)附屬連云港市第二人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222000；2南京醫(yī)科大學(xué)康達(dá)學(xué)院附屬連云港市第二人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222000

嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia，S.maltophilia，SMA）是一種革蘭陰性條件致病菌，廣泛存在于自然和醫(yī)院環(huán)境中，是醫(yī)院獲得性感染的重要病原菌之一，位于臨床分離的非發(fā)酵菌第三位［1］，環(huán)境或臨床分離株表現(xiàn)出多種抗生素和抗逆性表型［2］。SMA危及免疫功能低下人群的生命安全［3］，最常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)是肺炎、菌血癥、傷口感染和尿路感染［4］。目前，臨床采用常規(guī)的生化培養(yǎng)法鑒定SMA耗時(shí)較久，易耽誤治療［1］。選擇性培養(yǎng)基可以根據(jù)SMA 的分泌物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，以達(dá)到從混合菌株中鑒定SMA的目的［5］，但該方法需要建立嚴(yán)格無(wú)菌的環(huán)境且周期較長(zhǎng)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)已被用于檢測(cè)急性白血病或骨髓增生異常綜合征化療患者血液樣本中的SMA［6］，該方法雖然檢測(cè)時(shí)間短、精度高，但受限于精密儀器和專業(yè)技術(shù)人員，難以打破實(shí)驗(yàn)室的壁壘，無(wú)法實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)（point of care testing，POCT）。因此，建立一種便捷、靈敏的檢測(cè)方法，對(duì)于快速診斷SMA至關(guān)重要。

重組聚合酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（recombinase polymerase amplification，RPA）是一種不依賴于精密儀器、可在37 ℃恒溫、短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增目的基因的核酸擴(kuò)增技術(shù)［7-8］。側(cè)向流動(dòng)試紙條（lateral flow strips，LFS）是以納米膠體金顆粒（Au nanopartical，AuNP）作為信號(hào)標(biāo)簽的紙基即時(shí)檢測(cè)裝置［9］。將LFS 與RPA 技術(shù)聯(lián)合使用，可突破儀器和專業(yè)技術(shù)人員的限制，在較短時(shí)間內(nèi)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行目視檢測(cè)［10-11］。RPA-LFS反應(yīng)原理如圖1所示。

圖1 RPA-LFS反應(yīng)原理Figure 1 The principle of RPA-LFS

目前，RPA-LFS已經(jīng)被成功用于肺炎鏈球菌［12］、肺炎克雷伯菌［13］、白色念珠菌［14］等病原菌的分子診斷［15］。而對(duì)于SMA，RPA-LFS 的檢測(cè)方法還沒(méi)有建立。本研究旨在建立一種改良的RPA-LFS技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)SMA的快速檢測(cè)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源本研究所用的標(biāo)準(zhǔn)菌株列于表1，均由連云港市第二人民醫(yī)院提供。所有標(biāo)準(zhǔn)菌株保存于-80 ℃超低溫冰箱，使用前于35 ℃微生物培養(yǎng)箱活化。為驗(yàn)證RPA-LFS技術(shù)對(duì)臨床標(biāo)本的適用性，于2022年1—12 月收集108 例臨床檢驗(yàn)樣本，其中57 例來(lái)自痰液，30例來(lái)自尿液，21例來(lái)自血液。

表1 本研究所用標(biāo)準(zhǔn)菌株Table 1 Standard strains used in this study

1.1.2 主要儀器和試劑

微生物培養(yǎng)箱（上海BluePard 公司），震蕩培養(yǎng)箱（上海旻泉公司），超微量分光光度計(jì)（Quawell 公司，美國(guó)），電熱恒溫水浴鍋（上海精宏公司），電泳儀（Bio-Rad 公司，美國(guó)），全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)（上海培清公司），細(xì)菌基因組提取試劑盒（北京天根公司），基礎(chǔ)型RPA試劑盒、nfo型RPA試劑盒、側(cè)向流動(dòng)試紙條（常州安普未來(lái)公司）。

1.2 方法

1.2.1 微生物基因組提取

將凍存的SMA接種于哥倫比亞血瓊脂平板，置于35 ℃微生物培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。挑取培養(yǎng)皿上的單菌落，置于5 mL Luria-Bertani 培養(yǎng)基中，在35 ℃振蕩培養(yǎng)箱中震蕩培養(yǎng)12 h。根據(jù)細(xì)菌基因組提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取SMA 基因組DNA，保存于-20 ℃?zhèn)溆??；蚪MDNA 濃度使用超微量分光光度計(jì)定量。其他標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床分離的SMA 使用加熱煮沸法提取DNA。菌株培養(yǎng)后，挑取菌苔置于100 μL Tris-EDTA 中，100 ℃加熱煮沸10 min，釋放基因組DNA?；蚪M提取液冷卻后，12 000 r/min 離心5 min，取上清轉(zhuǎn)移至無(wú)菌EP 管，保存于-20 ℃?zhèn)溆?。用于RPA-LFS檢測(cè)的臨床樣本，使用加熱煮沸法粗提基因組。12 000 r/min 離心5 min，沉淀溶于100 μL Tris-EDTA 中，100 ℃加熱煮沸10 min，釋放基因組DNA。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及RPA反應(yīng)

在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）檢索SMA 特異性序列NC_010943.1。使用Primer premier 5 軟件設(shè)計(jì)引物對(duì)，由通用生物有限公司（中國(guó)）合成。引物設(shè)計(jì)原則如下：引物長(zhǎng)度30～35 bp；GC 含量30%～70%；擴(kuò)增子長(zhǎng)度100～500 bp；最大單核苷酸重復(fù)長(zhǎng)度為5。使用基礎(chǔ)型RPA 試劑盒篩選最佳引物對(duì)。RPA 反應(yīng)體系共50 μL，向含有酶組分的反應(yīng)管中加入29.4 μL 反應(yīng)緩沖液、2.4 μL 10 μmol/L 上游引物（F）、2.4 μL 10 μmol/L下游引物（R）、13.3 μL基因組模板和2.5 μL 280 nmol/L醋酸鎂溶液。上下顛倒充分混勻反應(yīng)管內(nèi)溶液，瞬時(shí)離心。將反應(yīng)管置于37 ℃水浴鍋孵育30 min。RPA 反應(yīng)完成后，使用等體積的苯酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1）混合液抽提RPA擴(kuò)增產(chǎn)物。12 000 r/min離心5 min，取上清，加入適量DNA 上樣緩沖液，通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳分離（90 V，30 min），在紫外燈下觀察RPA反應(yīng)產(chǎn)物。

1.2.3 探針設(shè)計(jì)及RPA-LFS反應(yīng)

根據(jù)RPA 反應(yīng)篩選出最佳引物對(duì)后，將上游引物向3′端方向延長(zhǎng)16 bp即為探針序列。探針的5′端使用FITC 標(biāo)記，3′端使用C3-間臂基團(tuán)（3′-Block）修飾，探針中部的一個(gè)堿基使用四氫呋喃（tetrahydrofuran，THF）取代，其中至少30 bp 位于THF位點(diǎn)的5′端，至少15 bp位于其3′端。下游引物的5′端使用生物素（Biotin）標(biāo)記。RPA-LFS 反應(yīng)體系共50 μL，向含有酶組分的反應(yīng)管中加入29.4 μL反應(yīng)液、2.1 μL 10 μmol/L上游引物、2.1 μL 10 μmol/L下游引物、0.6 μL 10 μmol/L探針、13.3 μL基因組模板溶液和2.5 μL 280 μmol/L醋酸鎂溶液。上下顛倒充分混勻反應(yīng)管內(nèi)溶液，瞬時(shí)離心。將反應(yīng)管置于37 ℃水浴鍋孵育12 min。使用雙蒸水將反應(yīng)產(chǎn)物稀釋20倍，取50 μL稀釋液滴加入試紙條的加樣孔中，等待顯色。

1.2.4 特異度檢驗(yàn)

為檢測(cè)RPA-LFS體系的特異度，使用該方法檢測(cè)了其他12種臨床常見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)菌株和12株臨床來(lái)源的SMA，檢測(cè)方法如前文所述。

1.2.5 靈敏度檢驗(yàn)

使用雙蒸水梯度稀釋SMA基因組DNA（1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、10 CFU/mL）用于檢測(cè)RPA-LFS 體系的靈敏度。取1 μL基因組DNA稀釋液加入RPA-LFS 反應(yīng)管中，補(bǔ)雙蒸水至13.3 μL，使得每個(gè)反應(yīng)分別含有1×104、1×103、1×102、10、1、1×10-1、1×10-2CFU SMA的基因組，其余步驟如前文所述。每組濃度進(jìn)行10 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，通過(guò)對(duì)10 個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的概率回歸分析，確定該方法的最低檢測(cè)限（limit of detection，LOD），即95%的概率檢測(cè)出陽(yáng)性產(chǎn)物的最低濃度。

1.2.6 臨床標(biāo)本檢測(cè)

通過(guò)與生化培養(yǎng)法和qPCR檢測(cè)法進(jìn)行比較來(lái)評(píng)估RPA-LFS 法在臨床標(biāo)本檢測(cè)中的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。用于生化培養(yǎng)法和qPCR檢測(cè)法檢測(cè)的臨床樣本使用選擇培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，置于35 ℃微生物培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～48 h。VITEK 2 全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行菌種鑒定。根據(jù)基因序列NC_010943.1 設(shè)計(jì)qPCR 引物［16］，按照操作流程對(duì)臨床樣本使用qPCR法進(jìn)行檢測(cè)。qPCR 法步驟如下：95 ℃預(yù)變性2 min后進(jìn)入循環(huán)階段，95 ℃變性10 s，56 ℃退火50 s，72 ℃延伸15 s，共40個(gè)循環(huán)。根據(jù)公式：（共同陽(yáng)性樣本個(gè)數(shù)+共同陰性樣本個(gè)數(shù)）÷樣品總數(shù)×100%，計(jì)算RPA-LFS 法與另外兩種方法的符合率，通過(guò)kappa指數(shù)來(lái)評(píng)估該方法與其他方法的一致性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS 13.0 軟件分析。對(duì)臨床檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行kappa 一致性檢驗(yàn)，kappa 值>0.8 表示一致性較強(qiáng)，P<0.05表明kappa值可靠。

2 結(jié)果

2.1 引物和探針設(shè)計(jì)

根據(jù)SMA 特異性基因序列NC_010943.1 設(shè)計(jì)出4組引物對(duì)（表2），對(duì)4組候選引物對(duì)進(jìn)行基礎(chǔ)型RPA反應(yīng)（圖2A）。4組引物對(duì)均產(chǎn)生了與預(yù)期大小一致的靶向條帶，分別為470、163、369、189 bp，但在無(wú)模板對(duì)照（no template control，NTC）中出現(xiàn)了少量小于100 bp的引物二聚體條帶。相比之下，引物對(duì)1 具有較亮的目標(biāo)條帶，并且無(wú)肉眼可見(jiàn)的引物二聚體。因此，選擇引物對(duì)1用于探針的設(shè)計(jì)。

表2 RPA引物對(duì)序列Table 2 RPA primer sequences

圖2 最佳引物對(duì)篩選及探針設(shè)計(jì)Figure 2 Optimal primers for screening and probe design

根據(jù)引物對(duì)1 的上游引物設(shè)計(jì)探針，修飾后的探針和引物見(jiàn)表3，通過(guò)RPA-LFS 檢測(cè)引物探針組合F1/R1/P1 的擴(kuò)增性能及時(shí)確定是否存在假陽(yáng)性的情況。結(jié)果如圖2B 所示，F(xiàn)1/R1/P1 引物-探針組合提供了正確的陽(yáng)性信號(hào)（檢測(cè)線和質(zhì)控線上都有可見(jiàn)的紅色條帶），這表明F1/R1/P1 引物-探針組合具有良好的擴(kuò)增性能。然而，在無(wú)模板對(duì)照組中，檢測(cè)線上也顯示出一條可見(jiàn)的弱化紅帶，表明F1/R1/P1 引物探針組合存在假陽(yáng)性擴(kuò)增?？紤]到RPA反應(yīng)環(huán)境下可能發(fā)生不利的引物相互作用，產(chǎn)生較低分子量的DNA副產(chǎn)物（<100 bp），即“引物噪音”。為減少“引物噪音”的產(chǎn)生，本研究在引物中適當(dāng)引入了堿基錯(cuò)配。錯(cuò)配原則如下：對(duì)具有4 個(gè)以上連續(xù)配對(duì)堿基的區(qū)域進(jìn)行堿基錯(cuò)配；靠近3′端的3 個(gè)堿基不能替換；每條引物上替換的堿基不超過(guò)5 個(gè)；不能有連續(xù)的2 個(gè)堿基替換；優(yōu)先使用A-G互換、T-C 互換。F1/R1/P1 引物-探針組合可產(chǎn)生的引物二聚體和堿基錯(cuò)配如圖2C 所示。當(dāng)引入適當(dāng)堿基錯(cuò)配后，無(wú)模板對(duì)照組的假陽(yáng)性信號(hào)消失（圖2B），后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用F/R/P引物-探針組合。

表3 RPA-LFS探針序列Table 3 RPA-LFS probe sequences

2.2 RPA-LFS反應(yīng)條件的優(yōu)化

為實(shí)現(xiàn)RPA反應(yīng)條件的最優(yōu)化，對(duì)其反應(yīng)時(shí)間和溫度進(jìn)行了改良?？刂品磻?yīng)溫度為37 ℃，將反應(yīng)時(shí)間分別設(shè)置為0、2、4、6、8、10、12 min（圖3A）。結(jié)果顯示，反應(yīng)4 min時(shí)檢測(cè)線出現(xiàn)顏色較弱的條帶，在8 min 時(shí)檢測(cè)線條帶清晰明亮。8 min 后，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，檢測(cè)線無(wú)明顯變化?？刂品磻?yīng)時(shí)間，分別在22、27、32、37、42、47、52 ℃進(jìn)行RPA擴(kuò)增（圖3B）。在反應(yīng)溫度為22 ℃時(shí)，檢測(cè)線無(wú)條帶，27 ℃時(shí)檢測(cè)線出現(xiàn)較淺的條帶。反應(yīng)溫度在37 ℃～42 ℃，具有較為清晰的陽(yáng)性條帶?？紤]到RPA-LFS反應(yīng)體系所需的酶不耐高溫，推測(cè)反應(yīng)溫度為52 ℃時(shí)，無(wú)目的產(chǎn)物的擴(kuò)增。與假設(shè)相符，當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)到52 ℃時(shí)，檢測(cè)線無(wú)條帶。綜合時(shí)間、經(jīng)濟(jì)成本，RPA-LFS 法的最佳反應(yīng)條件為37 ℃，反應(yīng)8 min。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將采用該條件進(jìn)行。

圖3 RPA-LFS反應(yīng)時(shí)間和溫度的優(yōu)化Figure 3 Optimization of RPA-LFS reaction conditions

2.3 RPA-LFS檢測(cè)的特異度分析

為評(píng)價(jià)RPA-LFS 檢測(cè)法是否能特異性檢測(cè)SMA，使用12 種臨床常見(jiàn)致病菌和12 株SMA 臨床分離株進(jìn)行RPA-LFS 檢測(cè)。如圖4A 所示，使用其他致病菌基因組作為RPA-LFS反應(yīng)模板時(shí)，檢測(cè)線未出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，當(dāng)使用臨床分離的SMA 基因組DNA 作為模板時(shí)，檢測(cè)線上出現(xiàn)了明顯的陽(yáng)性信號(hào)（圖4B）。結(jié)果表明，建立的RPA-LFS 檢測(cè)體系對(duì)SMA 具有良好的特異度，與其他病原菌無(wú)交叉反應(yīng)。

圖4 RPA-LFS特異度檢測(cè)Figure 4 Specificity of the RPA-LFS assay

2.4 RPA-LFS檢測(cè)的靈敏度分析

為評(píng)估RPA-LFS 方法的最低檢測(cè)限，以梯度稀釋的SMA 基因組DNA 為反應(yīng)模板。反應(yīng)體系中含有1×104CFU 基因組時(shí)，檢測(cè)線上出現(xiàn)強(qiáng)的陽(yáng)性信號(hào)，隨著模板濃度的降低，陽(yáng)性條帶的顏色減弱。當(dāng)濃度低至1×10-1CFU時(shí)，陽(yáng)性信號(hào)完全消失（圖5A）。此外，為了進(jìn)一步確定RPA-LFS檢測(cè)的準(zhǔn)確LOD，對(duì)所有濃度進(jìn)行10次獨(dú)立的檢測(cè)。結(jié)果顯示，當(dāng)反應(yīng)體系中基因組含量為1 CFU時(shí)，有9次為陽(yáng)性結(jié)果，基因組含量為1×10-1CFU時(shí)，有1次結(jié)果呈陽(yáng)性。通過(guò)SPSS 軟件對(duì)10 次檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行probit 回歸分析（圖5B）。在95%的陽(yáng)性概率下，RPA-LFS 反應(yīng)的最低檢測(cè)限為1.107 CFU。為了測(cè)試該系統(tǒng)是否能抵抗其他物種基因組的干擾，除了在反應(yīng)體系中加入SMA 基因組外，額外加入10 ng的人類基因組DNA。結(jié)果顯示，該方法檢測(cè)靈敏度不受人類DNA的影響（圖5C）。

圖5 RPA-LFS檢測(cè)的靈敏度分析Figure 5 The sensitivity of the RPA-LFS assay

2.5 RPA-LFS在臨床標(biāo)本檢測(cè)中的應(yīng)用

通過(guò)與qPCR 法［16］和傳統(tǒng)生化培養(yǎng)法比較，評(píng)估RPA-LFS 方法在臨床中的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值（表4）。對(duì)收集的108 例臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，RPA-LFS 法和qPCR 法檢測(cè)108例標(biāo)本中有23例樣本呈現(xiàn)SMA陽(yáng)性，而采用生化培養(yǎng)法只檢測(cè)出22例樣本為陽(yáng)性。建立的RPA-LFS方法與qPCR法的符合率為100%。RPA-LFS與傳統(tǒng)生化培養(yǎng)方法的陽(yáng)性符合率為99.07%，kappa 指數(shù)值為0.972，P<0.001，說(shuō)明RPA-LFS與傳統(tǒng)生化培養(yǎng)方法一致性較好。

表4 RPA-LFS與qPCR法和傳統(tǒng)生化培養(yǎng)法比較Table 4 Comparison of RPA-LFS，qPCR，and traditional bacterial culture methed

3 討論

病原微生物的即時(shí)、精確診斷是臨床檢驗(yàn)不可忽視的難點(diǎn)之一。本研究開(kāi)發(fā)了一種改良型的RPA-LFS 方法，用于檢測(cè)SMA，既實(shí)現(xiàn)了SMA 的快速檢測(cè)，也拓寬了RPA-LFS的應(yīng)用范圍。

SMA 常與金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌等混合生長(zhǎng)［1］，傳統(tǒng)的微生物分離培養(yǎng)技術(shù)對(duì)于鑒定SMA 具有一定挑戰(zhàn)性。PCR 技術(shù)快速準(zhǔn)確、靈敏度高，但該方法需要復(fù)雜的反應(yīng)儀器且用時(shí)較長(zhǎng)，不適用于病原微生物的快速檢測(cè)［17］。相比其他分子擴(kuò)增技術(shù)，RPA可在較低的溫度中進(jìn)行，不依賴于儀器的精準(zhǔn)溫控，有利于POCT 的發(fā)展［8］。將RPA 技術(shù)與LFS 檢測(cè)方法聯(lián)合使用，可在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的快速可視化檢測(cè)。在RPA-LFS 反應(yīng)過(guò)程中，DNA 聚合酶從上游引物的3′端開(kāi)始移位以產(chǎn)生較小的擴(kuò)增子，從斷裂探針的3′端開(kāi)始移位產(chǎn)生雙標(biāo)記擴(kuò)增子（主要擴(kuò)增子），用于下游試紙條的“三明治”檢測(cè)［18］。

本研究根據(jù)SMA 特異性序列（NC_010943.1）設(shè)計(jì)引物和探針。該基因序列由Fraser 等［16］于2019 年首次鑒定為SMA 的保守序列，可用于SMA的鑒定。在設(shè)計(jì)探針過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)下游引物和探針產(chǎn)生的引物二聚體會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性信號(hào)的發(fā)生，因此本研究引入堿基錯(cuò)配以避免假陽(yáng)性信號(hào)。文獻(xiàn)報(bào)道，RPA 反應(yīng)可允許少許錯(cuò)配堿基的引入［19］，但要避免在3′端引入錯(cuò)配。在引入錯(cuò)配堿基后，本研究建立了適用于特異性檢驗(yàn)SMA的引物-探針序列F/R/P。值得注意的是，擴(kuò)增效率及擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)效能在理論上遜色于錯(cuò)配前的引物探針組合，但考慮到檢測(cè)的特異性，這種錯(cuò)配不可避免。通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)時(shí)間和溫度，確定了RPA-LFS體系的最佳反應(yīng)條件為37 ℃，擴(kuò)增時(shí)間為8 min。根據(jù)probit回歸分析，確定該體系檢測(cè)SMA 的最低檢出限為1.107 CFU，且靈敏度不受其他物種基因組干預(yù)。通過(guò)對(duì)108例臨床來(lái)源的微生物樣本進(jìn)行檢測(cè)以驗(yàn)證臨床適用性，我們建立的RPA-LFS 方法與qPCR 檢測(cè)結(jié)果相符，具有一致性。但由于反應(yīng)時(shí)間的縮短、檢測(cè)設(shè)備的簡(jiǎn)易，以及堿基錯(cuò)配位點(diǎn)的引入，RPA-LFS 體系的靈敏度略低于qPCR 檢測(cè)法［16］。與傳統(tǒng)的“金標(biāo)準(zhǔn)”生化培養(yǎng)法相比，RPA-LFS 較為靈敏且不需要經(jīng)過(guò)純化步驟，大大縮短檢測(cè)時(shí)間，兩種檢測(cè)方法的陽(yáng)性符合率為99.07%，kappa指數(shù)值為0.971 8，對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明兩種方法具有良好的一致性。22例均被定義為SMA陽(yáng)性的樣本，其患者臨床診斷為SMA感染，經(jīng)抗菌藥物治療后康復(fù)。其中不一致的1例樣本被全自動(dòng)微生物鑒定儀定義為鮑曼不動(dòng)桿菌，來(lái)源于痰液，其誤差原因可能為技術(shù)人員在分離純化時(shí)操作失誤。由于非無(wú)菌部位標(biāo)本常常有多種細(xì)菌生長(zhǎng)，即使看似較純的菌落，下面也有可能掩蓋不易覺(jué)察的小菌落。該患者在治療過(guò)程中，重新采取痰液并分離純化，經(jīng)全自動(dòng)微生物鑒定儀檢測(cè)，確診感染SMA。因此，實(shí)驗(yàn)人員不能過(guò)分依賴儀器，動(dòng)手操作時(shí)也要刻畫(huà)入微，避免誤差。

本研究開(kāi)發(fā)了一種敏感且特異、適用于SMA的RPA-LFS 檢測(cè)方法，該方法打破了昂貴儀器的桎梏，可以在條件有限的環(huán)境使用。盡管已經(jīng)完成了改進(jìn)和臨床適用性評(píng)估，但這種方法還具有一些局限性：①開(kāi)發(fā)和測(cè)試只在本地實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，缺乏大規(guī)模樣本量分析檢測(cè)，無(wú)法實(shí)現(xiàn)真正意義上的POCT；②與傳統(tǒng)“金標(biāo)準(zhǔn)”檢測(cè)方法的比較仍需要大量樣本的驗(yàn)證；③RPA-LFS 技術(shù)尚未能實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)，只能通過(guò)多次RPA反應(yīng)來(lái)鑒定菌株和耐藥基因。未來(lái)需要致力于高通量RPA-LFS技術(shù)的建立，以及一體化核酸提取-RPA 反應(yīng)-檢測(cè)儀器的開(kāi)發(fā)，以便醫(yī)療資源的合理利用和POCT的發(fā)展?，F(xiàn)有的RPA技術(shù)可作為PCR檢測(cè)技術(shù)的重要補(bǔ)充，縮短檢測(cè)時(shí)間，便于治療的及時(shí)性［20］。目前，RPA-LFS 正處于向臨床應(yīng)用過(guò)渡的階段［8］。盡管如此，我們建立的RPA-LFS 方法對(duì)于檢測(cè)SMA 感染仍具有廣闊的應(yīng)用前景。