馬丹陽,高雪嫣,彭凌峰,伍少峰,王慶濤,郝智慧*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)三亞研究院,三亞 572025;2.中獸醫(yī)藥創(chuàng)新中心,中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,北京 100193;3.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,烏魯木齊 830052)

檳榔(Arecae Semen)作為我國著名的“四大南藥”之首以及海南長期依賴的“三棵樹”之一,為棕櫚科植物檳榔(ArecacatechuL.)的干燥成熟種子,廣泛分布于中國(海南、臺(tái)灣等)、印度以及印度尼西亞等地[1]。它含有豐富的生物堿類、黃酮類、多酚類等多種化合物,臨床上可用于球蟲、絳蟲以及食滯等疾病的治療[2],除此之外,檳榔也具有悠久的食用歷史[3]。隨著檳榔全產(chǎn)業(yè)鏈的發(fā)展,商品檳榔給社會(huì)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)效益,也為熱帶農(nóng)業(yè)發(fā)展和農(nóng)民增收提供有力保障,但其生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的大量副產(chǎn)物,如檳榔籽(又稱檳榔核,即檳榔加工后產(chǎn)生的干燥檳榔種子,呈紅褐色)和檳榔蒂,這些副產(chǎn)物往往直接廢棄,未被充分開發(fā)和利用,導(dǎo)致檳榔的營養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值無法得到充分發(fā)揮,造成資源大量浪費(fèi)[4]。研究發(fā)現(xiàn),檳榔核具有抗菌、降糖和良好的抗氧化特性[5-7],還可部分替代普通栽培料來培養(yǎng)平菇[4],但其物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確,這在很大程度上限制了檳榔籽的進(jìn)一步開發(fā)利用。

超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道肼高分辨質(zhì)譜法(UHPLC-QE-Orbitrap-MS)具有高靈敏度、高精密度、快速獲得化合物多級(jí)質(zhì)譜信息等優(yōu)勢(shì),可對(duì)未知成分進(jìn)行快速、精確的確證,在中藥復(fù)雜成分的鑒定和分析中發(fā)揮重要作用[8]。

因此,本研究基于UHPLC-QE-Orbitrap-MS技術(shù),對(duì)深加工副產(chǎn)物檳榔籽進(jìn)行成分鑒定,為綜合利用檳榔深加工副產(chǎn)物提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Q Exactive Plus Orbitrap高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀(Q Exactive Plus,Thermo Fisher),U3000超高效液相色譜及自動(dòng)進(jìn)樣器(U3000,Thermo Fisher),ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1×100 mm,1.8 μm,Waters)渦旋混合器(Vortex-2 Genie,Scientific Industries),低溫離心機(jī)(5810R,Eppendorf),超聲波清洗器(WD-9415C,北京市六一儀器廠)。甲醇、乙腈、甲酸(色譜級(jí),Thermo Fisher公司);去離子水(使用Milli Q Advantage A10超純水機(jī)制備)。

1.2 樣品

深加工檳榔籽來源于某公司兩個(gè)地區(qū)的生產(chǎn)基地。使用粉碎機(jī)將干燥檳榔籽粉碎,過60目篩,即為待測(cè)樣品。取待測(cè)樣品粉末10 mg,加入1 mL 80%甲醇配制成10 mg·mL-1的樣品溶液(含內(nèi)標(biāo)尼克地平5 μg·mL-1),超聲10 min,14 000 r·min-1離心10 min,取上清液置入進(jìn)樣瓶中,待UHPLC-QE-Orbitrap-MS分析。

1.3 液相條件

色譜柱選用ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm),柱溫為35 ℃,進(jìn)樣體積為10 μL,流速為0.3 mL·min-1,以0.1%甲酸水溶液(A)-0.1%甲酸乙腈溶液(B)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫,具體梯度洗脫條件如表1所示。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution condition %

1.4 質(zhì)譜條件

采用Q Exactive Plus Orbitrap高分辨質(zhì)譜進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集,檢測(cè)模式為Full MS-ddMS2,正離子和負(fù)離子模式同時(shí)掃描,掃描范圍為m/z100～1 200,MS1分辨率設(shè)置為70 000,MS2分辨率設(shè)置為17 500,離子源電壓為3.2 kV,毛細(xì)管離子傳輸管溫度320 ℃,輔助氣加熱溫度350 ℃,鞘氣流速40 L·min-1,輔助氣流速15 L·min-1,AGC Target設(shè)置為1×106,TopN設(shè)置為5,觸發(fā)MS2掃描的碰撞能量采用階梯式碎裂電壓NCE,設(shè)置為30、40和50。

1.5 化合物鑒定

采用Compound Discoverer 3.3軟件進(jìn)行原始數(shù)據(jù)特征峰提取,特征峰元素匹配、分子式預(yù)測(cè)及同位素分布匹配的質(zhì)量偏差均設(shè)置為5 ppm以內(nèi)。采用mzCloud在線數(shù)據(jù)庫和本地自建mzVault中藥天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫進(jìn)行特征峰鑒定,陽性結(jié)果篩選標(biāo)準(zhǔn)為質(zhì)量偏差<5 ppm、符合同位素分布及mzVault best match數(shù)據(jù)庫匹配得分>70分。采用內(nèi)標(biāo)法對(duì)化合物相對(duì)含量進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié) 果

2.1 深加工檳榔籽UHPLC-QE-Orbitrap-MS成分分析

根據(jù)設(shè)定的色譜和質(zhì)譜條件,對(duì)兩個(gè)生產(chǎn)基地的檳榔籽中的成分進(jìn)行分析,獲得負(fù)、正離子模式總離子流圖(TIC圖),見圖1。借助Compound Discoverer 3.3軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,采用本地?cái)?shù)據(jù)庫和mzCloud在線數(shù)據(jù)庫對(duì)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。最終,在兩個(gè)檳榔深加工基地共鑒定出檳榔籽相同成分85種,其中生物堿類化合物3種、黃酮類化合物24種、有機(jī)酸類化合物15種、酚類化合物7種、萜類化合物7種、氨基酸類化合物6種、糖類化合物4種、酯類化合物4種、酰胺類化合物2種、鞘脂類化合物2種、類固醇衍生物1種、苯丙素類化合物1種、香豆素類化合物1種以及其它8種。負(fù)、正離子掃描模式下得到的成分的保留時(shí)間、化合物名稱、分子式、m/z、二級(jí)質(zhì)譜碎片離子、相對(duì)含量、分類、分別見表2和表3。

圖1 深加工檳榔籽負(fù)(A)、正(B)離子模式下的UHPLC-QE-Orbitrap-MS總離子流圖Fig.1 Total chromatograms of seed of Areca catechu L. in deep processing by UHPLC-QE-Orbitrap-MS in negative (A) and positive (B) ion modes

表2 深加工檳榔籽負(fù)離子掃描模式的成分結(jié)構(gòu)信息Table 2 Composition and structure information of seed of Areca catechu L. in deep processing in negative ion scanning mode

(續(xù)表2 Continued)

表3 深加工檳榔籽正離子掃描模式的成分結(jié)構(gòu)信息Table 3 Composition and structure information of seed of Areca catechu L. in deep processing in positive ion scanning mode

(續(xù)表3 Continued)

2.2 深加工檳榔籽中主要成分的質(zhì)譜裂解規(guī)律

2.2.1 生物堿類化合物 正離子掃描模式下共鑒別出生物堿類化合物3種,分別是化合物檳榔堿(9.851 4 μg·mL-1)、葫蘆巴堿(3.014 0 μg·mL-1)和川芎嗪(0.089 4 μg·mL-1)。本研究以化合物葫蘆巴堿為例,進(jìn)行裂解規(guī)律分析。葫蘆巴堿的準(zhǔn)分子離子峰為m/z138.053 9 [M+H]+,同時(shí)可以觀測(cè)4個(gè)特征離子碎片,分別是分子離子峰失去一個(gè)甲基再丟失一個(gè)氫的碎片離子峰(m/z122.525 7 [M+H-CH3-H]+)以及再失去一個(gè)羧基的碎片離子峰(m/z78.033 3 [M+H-CH3-H-COO-]+)。分子離子峰通過脫甲基脫氫(m/z122.525 7 [M+H-CH3-H]+)后,可再脫羰基,形成特征離子碎片(m/z94.064 4 [M+H-CH3-H-CO]+)。分子離子峰還可直接脫羰基形成特征離子碎片(m/z110.059 2 [M+H-CO]+)。根據(jù)正離子模式下的精確分子質(zhì)量以及特征離子碎片信息,結(jié)合文獻(xiàn)[11],判斷該化合物為葫蘆巴堿(其可能的裂解規(guī)律以及二級(jí)質(zhì)譜圖,如圖2所示)。

圖2 葫蘆巴堿的質(zhì)譜裂解規(guī)律(A)和二級(jí)質(zhì)譜圖(B)Fig.2 Mass spectrum cleavage of trigonelline (A) and secondary mass spectrum (B)

2.2.2 黃酮類化合物 正負(fù)離子掃描模式下共鑒別出黃酮類化合物24種,其中相對(duì)含量較高的黃酮類化合物有兒茶素(1.248 8μg·mL-1)、原花青素B1(0.557 7μg·mL-1)、原花青素B2(0.069 8μg·mL-1)以及異鼠李素-3-O-新橙皮苷(0.051 3μg·mL-1)。本研究以化合物兒茶素為例,進(jìn)行裂解規(guī)律分析?；衔飪翰杷氐臏?zhǔn)分子離子峰為m/z289.069 7 [M-H]-,同時(shí)可以觀測(cè)到分子離子峰分別失去C9H8O3、C9H8O4和CO2形成的碎片離子峰m/z125.023 4 [M-H-C9H8O3]-、m/z109.028 5 [M-H-C9H8O4]-和m/z245.080 0 [M-H-CO2]-。根據(jù)負(fù)離子模式下的精確分子質(zhì)量以及特征離子碎片信息,結(jié)合文獻(xiàn)[8],判斷該化合物為兒茶素(其可能的裂解規(guī)律以及二級(jí)質(zhì)譜圖,如圖3所示)。

圖3 兒茶素的質(zhì)譜裂解規(guī)律(A)和二級(jí)質(zhì)譜圖(B)Fig.3 Mass spectrum cleavage of catechin (A) and secondary mass spectrum (B)

2.2.3 有機(jī)酸類化合物 正負(fù)離子模式下共鑒別出有機(jī)酸類化合物15種,其中相對(duì)含量較高的有機(jī)酸類化合物有右旋奎寧酸(5.677 1 μg·mL-1)、L-蘋果酸(1.921 3 μg·mL-1)和檸檬酸(1.010 8 μg·mL-1)。本研究以化合物檸檬酸為例,進(jìn)行裂解規(guī)律分析?；衔餀幟仕岬臏?zhǔn)分子離子峰為m/z191.018 3 [M-H]-,可以觀測(cè)到分子離子峰依次失去H2O、H2O和CO2形成的碎片離子峰m/z173.007 6 [M-H-H2O]-、m/z154.997 5 [M-H-H2O-H2O]-和m/z111.007 9 [M-H-H2O-H2O-CO2]-?；衔餀幟仕岬臏?zhǔn)分子離子峰失去C3H6O4形成的碎片離子峰m/z85.028 8 [M-H-C3H6O4]-。根據(jù)負(fù)離子模式下的精確分子質(zhì)量以及特征離子碎片信息,結(jié)合文獻(xiàn)[10],判斷該化合物為檸檬酸(其可能的裂解規(guī)律以及二級(jí)質(zhì)譜圖,如圖4所示)。

圖4 檸檬酸的質(zhì)譜裂解規(guī)律(A)和二級(jí)質(zhì)譜圖(B)Fig.4 Mass spectrum cleavage of citric acid (A) and secondary mass spectrum (B)

2.2.4 氨基酸類化合物 正負(fù)離子模式下共鑒別出氨基酸類化合物6種,其中相對(duì)含量較高的氨基酸類化合物為L-苯丙氨酸(0.952 2 μg·mL-1)和L-谷氨酸(0.109 7 μg·mL-1)。本研究以L-苯丙氨酸為例,進(jìn)行裂解規(guī)律分析。L-苯丙氨酸的準(zhǔn)分子離子峰為m/z166.085 1 [M+H]+,經(jīng)過脫羧可以觀測(cè)碎片離子峰m/z120.079 9 [M+H-COOH]-。分子離子峰也可分別脫氨基和羧基形成碎片離子峰m/z149.058 8 [M+H-NH3]-和m/z103.053 4 [M+H-NH3-COOH]-。根據(jù)正離子掃描模式下的精確分子質(zhì)量以及特征離子碎片信息,結(jié)合文獻(xiàn)[10],判斷該化合物為L-苯丙氨酸(其可能的裂解規(guī)律以及二級(jí)質(zhì)譜圖,如圖5所示)。

圖5 L-苯丙氨酸的質(zhì)譜裂解規(guī)律(A)和二級(jí)質(zhì)譜圖(B)Fig.5 Mass spectrum cleavage of L-Phenylalanine (A) and secondary mass spectrum (B)

2.2.5 糖類化合物 正負(fù)離子模式下共鑒別出糖類化合物4種,分別是D-果糖(0.171 6 μg·mL-1)海藻糖(0.629 4 μg·mL-1)、葡糖胺(0.095 6 μg·mL-1)以及棉籽糖(0.003 0 μg·mL-1)。本研究以化合物海藻糖為例,進(jìn)行裂解規(guī)律分析?；衔锖Ｔ逄堑臏?zhǔn)分子離子峰為m/z341.104 4 [M-H]-,同時(shí)可以觀測(cè)到分子離子峰依次失去CH3O、C8H13O7形成的碎片離子峰m/z89.023 7 [M-H-CH3O-C8H13O7]-,以及再失去H2O形成的碎片離子峰m/z71.013 2 [M-H-CH3O-C8H13O7-H2O]-。此外還觀測(cè)到了m/z113.023 5 [M-H-C7H10O7-2 H-H2O-2 H]-,m/z101.023 6 [M-H-C4H8O4-C4H8O4]-,m/z161.043 8 [M-H-C6H12O6]-,m/z143.033 5 [M-H-C6H12O6-H2O]-和m/z179.054 3 [M-H-C6H10O5]-的特征碎片離子峰。根據(jù)負(fù)離子模式下的精確分子質(zhì)量以及特征離子碎片信息,結(jié)合文獻(xiàn)[12],判斷該化合物為海藻糖(其可能的裂解規(guī)律以及二級(jí)質(zhì)譜圖,如圖6所示)。

圖6 海藻糖的質(zhì)譜裂解規(guī)律(A)和二級(jí)質(zhì)譜圖(B)Fig.6 Mass spectrum cleavage of α,α-Trehalose (A) and secondary mass spectrum (B)

2.2.6 香豆素類化合物 正離子模式下共鑒別出香豆素類化合物甲氧基香豆素,其相對(duì)含量為0.009 2 μg·mL-1。其準(zhǔn)分子離子峰為m/z177.053 3 [M-H]-,同時(shí)可以觀測(cè)到分子離子峰依次失去CO2、脫氫、脫甲基形成的碎片離子峰m/z117.032 6 [M-H-CO2-H-CH3]-,繼續(xù)脫羰基形成的碎片離子峰m/z89.037 8 [M-H-CO2-H-CH3-CO]-。分子離子峰分別失去OCH4和羰基形成m/z145.027 3 [M-H-OCH4]-和m/z149.058 6 [M-H-CO]-的碎片離子峰。分子離子峰還可以分別脫羰基、脫甲基和加氫形成碎片離子峰m/z135.043 3 [M-H-CO-CH3+H]-,隨后脫氫形成m/z134.035 2 [M-H-CO-CH3+H-H]-的碎片離子峰,再失去羥基形成碎片離子峰m/z117.032 6 [M-H-CO-CH3+H-H-OH]-。根據(jù)正離子模式下的精確分子質(zhì)量以及特征離子碎片信息,結(jié)合文獻(xiàn)[11],判斷該化合物為甲氧基香豆素(其可能的裂解規(guī)律以及二級(jí)質(zhì)譜圖,如圖7所示)。

圖7 甲氧基香豆素的質(zhì)譜裂解規(guī)律(A)和二級(jí)質(zhì)譜圖(B)Fig.7 Mass spectrum cleavage of 7-Methoxycoumarin (A) and secondary mass spectrum (B)

3 討 論

檳榔作為“四大南藥”之首,具有抗寄生蟲、抗炎、抗氧化、抗菌等多種藥理活性,目前已有文獻(xiàn)對(duì)檳榔籽不同萃取部位的成分進(jìn)行研究[7,29],但對(duì)深加工副產(chǎn)物檳榔籽成分的系統(tǒng)研究鮮有報(bào)道,這在很大程度上制約了它的進(jìn)一步發(fā)展。因此,本試驗(yàn)利用UHPLC-QE-Orbitrap-MS技術(shù)對(duì)深加工檳榔籽中的成分進(jìn)行分析,最終鑒定出化合物85個(gè),其中包括生物堿類、黃酮類、有機(jī)酸類、酚類、萜類、氨基酸類、糖類、酯類、酰胺類、鞘脂類、類固醇、苯丙素類、香豆素類等化合物,其中58種化合物在檳榔籽中首次被報(bào)道(除L-谷氨酸、右旋奎寧酸、葫蘆巴堿、3-哌啶甲酸、富馬酸、馬來酸、棉籽糖、檸檬酸、檳榔堿、L-酪氨酸、5-羥甲基糠醛、糖精、原花青素B1、尼泊金乙酯、原花青素B2、對(duì)羥基苯甲酸、兒茶素、3,4-二羥基苯甲醛、蘆丁、異牡荊素、異鼠李素、二氫槲皮素、槲皮素、紐甜、柚皮素、川陳皮素、亞麻酸外),進(jìn)一步探明了檳榔籽的化學(xué)成分。此外,還發(fā)現(xiàn)了甜味劑糖精、紐甜、甜菊糖苷和甜菊雙糖苷,以及防腐保鮮劑尼泊金乙酯等。

以檳榔堿為主的生物堿被認(rèn)為是檳榔中的主要活性物質(zhì)[2]。據(jù)報(bào)道,檳榔堿具有廣泛的藥理活性,包括對(duì)神經(jīng)、心血管、內(nèi)分泌和消化系統(tǒng)影響,以及抗寄生蟲和抗菌的作用,檳榔堿可通過麻痹蟲體、致使蟲體失去活動(dòng)能力,發(fā)揮驅(qū)蟲作用,檳榔堿還可對(duì)變形桿菌、白色念珠菌和炭疽桿菌具有抑制作用[30]。葫蘆巴堿具有神經(jīng)保護(hù)作用[31],也可通過抗炎、抗氧化、抗凋亡機(jī)制發(fā)揮對(duì)胃潰瘍的保護(hù)作用[32]。由于檳榔堿和葫蘆巴堿具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu),有研究推測(cè)檳榔堿是由葫蘆巴堿衍生而來的[33],這也可能是兩種生物堿含量較多的原因。其次,深加工檳榔籽中還含有較多的黃酮類和有機(jī)酸類化合物,如原花青素B1、原花青素B2、兒茶素、檸檬酸等。原花青素B2具有抑制氧化應(yīng)激、緩解炎癥、神經(jīng)保護(hù)等多種藥理活性[34],可通過靶向NF-κB、NLRP3和TLR4等信號(hào)通路,調(diào)節(jié)多種炎癥介質(zhì)的表達(dá),還可通過維持氧化還原平衡和減輕細(xì)胞凋亡從而緩解胃腸道疾病[35]。兒茶素可通過改變NF-κB、Nrf-2、TLR4/NF-κB、COMT和MAPKs通路發(fā)揮抗炎、抗糖尿病、抗癌、神經(jīng)保護(hù)、殺菌、增強(qiáng)記憶、抗關(guān)節(jié)炎和保護(hù)肝的作用[36]。在飼料中添加檸檬酸可改善適口性,增強(qiáng)動(dòng)物食欲,提高畜禽采食量,同時(shí)對(duì)維持畜禽消化道中微生物菌群的平衡也起到促進(jìn)作用[37]。

4 結(jié) 論

本研究采用UHPLC-QE-Orbitrap-MS技術(shù)首次對(duì)深加工副產(chǎn)物檳榔籽成分進(jìn)行系統(tǒng)分析,為闡明檳榔籽物質(zhì)基礎(chǔ)提供科學(xué)數(shù)據(jù)參考。研究發(fā)現(xiàn)深加工副產(chǎn)物檳榔籽中含有多種成分,提示具有潛在的驅(qū)蟲、抗菌、抗氧化、抗炎和神經(jīng)保護(hù)等作用,有望在飼料添加劑、開發(fā)抗氧化劑、驅(qū)蟲等多領(lǐng)域開展應(yīng)用研究,檳榔產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供新的思路。