雷亞萍,周世偉,滕雨萌,農(nóng)碧丹,龐曉敏,張 詣,劉曉麗,王玉蓮,2*,胡薛英*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,武漢 430070;2.國家獸藥殘留基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)),武漢 430070)

雞毒支原體(Mycoplasmagallisepticum,MG)感染常會(huì)導(dǎo)致家禽慢性呼吸道疾病(chronicrespirtory disease,CRD)[1]。雞毒支原體在世界范圍廣泛分布,且感染后不易清除,給家禽養(yǎng)殖帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。目前CRD的治療主要是應(yīng)用抗生素,但由于抗生素耐藥性的產(chǎn)生和藥物殘留問題[3],急需更安全有效的藥物進(jìn)行治療。麻杏石甘口服液是麻杏石甘湯臨床用藥的劑型之一,有鎮(zhèn)咳、抗炎、調(diào)節(jié)免疫功能等多種藥理作用,對(duì)咳嗽、支氣管炎、肺炎、哮喘等多種疾病具有良好的治療效果,但其在臨床上主要用于治療人、小鼠、牛和羊肺炎支原體感染的呼吸系統(tǒng)疾病,治療雞毒支原體感染的相關(guān)研究較少[4-6]。本試驗(yàn)擬觀察麻杏石甘口服液對(duì)人工感染雞毒支原體的治療效果,以期為臨床治療CRD提供新思路和新方向。

1 材料與方法

1.1 材料

麻杏石甘口服液(批號(hào):202009073):保定冀中生物科技有限公司。

雞毒支原體M17:國家獸藥殘留實(shí)驗(yàn)室(華中農(nóng)業(yè)大學(xué))保存。

1日齡健康廣西黃二號(hào)雞,購自武漢溫氏畜禽有限公司。

1.2 麻杏石甘口服液對(duì)MG感染雞的療效試驗(yàn)

1.2.1 雞毒支原體的復(fù)蘇與培養(yǎng) 將雞毒支原體M17傳代2～3次后,按謝道遠(yuǎn)等[7]的方法測定顏色變化單位為109CCU·mL-1。將培養(yǎng)好的菌液置于-20 ℃保存,備用。

1.2.2 試驗(yàn)動(dòng)物分組與處理 87只1日齡健康廣西黃二號(hào)雞,在干燥通風(fēng),衛(wèi)生良好的動(dòng)物房常規(guī)飼養(yǎng)至20日齡,其中飼料為不添加任何抗菌藥的全價(jià)配合飼料。該群雞臨床表現(xiàn)正常,試驗(yàn)前采集喉拭子檢測支原體結(jié)果為陰性。將試驗(yàn)雞隨機(jī)分成3組,分別為感染對(duì)照組、空白對(duì)照組和治療組,空白對(duì)照組單獨(dú)隔離飼養(yǎng)?？瞻讓?duì)照組正常飼喂,不感染;感染對(duì)照組和治療組的全部雞用保存的菌量為109CCU·mL-1的菌液分別通過滴鼻、點(diǎn)眼、氣囊注射菌液0.2、0.3、1 mL,1次·d-1,連續(xù)感染4 d,感染期間每天早晚兩次用2%氨水噴灑每籠雞及雞籠周圍的環(huán)境;采集全部雞只的喉拭子,由生工武漢技術(shù)部合成設(shè)計(jì)雞毒支原體特異性引物,F上游引物:5′-CCCATCTCGACCACCAGAAA-3′,R下游引物:5′-ATGGTAACACAGCCAACACCT-3′,采用PCR方法檢測,目的片段堿基數(shù)為259 bp。在感染的第5天,治療組通過飲水給予麻杏石甘口服液治療,劑量為每1升水添加1.5 mL麻杏石甘口服液,連用5 d,停藥后觀察6 d,分別于D0(給藥前1 d)和D12(停藥第7天)進(jìn)行試驗(yàn)雞體重稱量,計(jì)算平均增重。感染對(duì)照組和空白對(duì)照組正常飼喂,不給藥。

1.2.3 臨床觀察 觀察記錄D0～D11(停藥第6天)各組雞的臨床癥狀。每日定時(shí)觀察各組雞的呼吸、咳嗽、流涕、甩鼻、食欲情況、精神狀態(tài),根據(jù)各臨床癥狀的輕重程度以計(jì)分方法表示。各項(xiàng)評(píng)分均為1～4分,6種癥狀評(píng)分的和為總評(píng)分,總分為6～24分,分?jǐn)?shù)越高提示癥狀越嚴(yán)重[8]。癥狀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 病情分級(jí)及臨床癥狀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Disease classification and clinical symptom scoring criteria

1.2.4 病理剖檢及樣品采集 在給藥的第2天(D2)、停藥第1天(D6)和停藥第7天(D12),每組隨機(jī)抽取6只雞進(jìn)行剖檢。觀察記錄氣囊和肺部的病理變化并采集肺組織樣本,根據(jù)Swayne[10]和林曦[9]的研究中所述的病理變化和評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)肺和氣囊的損傷進(jìn)行分級(jí)評(píng)分,具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 氣囊和肺病變?cè)u(píng)分Table 2 Air sac and lung lesion score

1.2.5 肺組織病理學(xué)觀察 在D2、D6、D12采集肺組織,用4%多聚甲醛固定,用于組織病理學(xué)觀察。在光鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化,并對(duì)其從以下6個(gè)方面進(jìn)行評(píng)分:肺組織二級(jí)支氣管上皮細(xì)胞完整性、二級(jí)支氣管黏膜炎性細(xì)胞浸潤、二級(jí)支氣管管腔內(nèi)漿液、三級(jí)支氣管管腔和肺房內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤、三級(jí)支氣管和肺房內(nèi)漿液及肺組織淤血、出血、水腫,具體見表3,總分為0～24分,是各項(xiàng)指標(biāo)評(píng)分總和,總分越低說明臨床癥狀越輕[11]。

表3 肺組織病變?cè)u(píng)分Table 3 Lung tissue lesion score

1.2.6 療效判定標(biāo)準(zhǔn) 療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》2002版制定[12],分臨床痊愈、有效、無效,以療效指數(shù)判定。計(jì)算公式:療效指數(shù)(%)=[(治療前癥候總評(píng)分-治療后癥候總評(píng)分)/治療前癥候總評(píng)分]×100%

痊愈率(%):臨床癥狀消失或基本消失,療效指數(shù)≥95%,判為痊愈。計(jì)算公式:痊愈率(%)=痊愈雞只數(shù)/試驗(yàn)雞只數(shù)×100%

有效率(%):臨床癥狀有明顯改善,30%≤療效指數(shù)<95%,判為有效。計(jì)算公式:有效率(%)=(痊愈雞數(shù)+顯效雞數(shù)+有效雞數(shù))/試驗(yàn)雞數(shù)×100%。

無效率(%):臨床癥狀均無明顯改善,甚至加重,療效指數(shù)<30%,判為無效。計(jì)算公式:無效率(%)=(無效雞數(shù)+死亡雞數(shù))/試驗(yàn)雞數(shù)×100%。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用GraphPad Prism 7.00軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,組間差異采用one-way ANOVA分析。P<0.05時(shí),表示差異顯著;P>0.05時(shí),表示差異不顯著。

2 結(jié) 果

2.1 臨床癥狀結(jié)果分析

在MG連續(xù)感染4 d后,試驗(yàn)雞出現(xiàn)呼吸困難、咳嗽、甩鼻、采食減少和精神沉郁等臨床癥狀,喉拭子檢測結(jié)果均呈陽性,部分結(jié)果見圖1?？瞻讓?duì)照組為健康不感染組,試驗(yàn)雞無臨床癥狀(圖2A)。連續(xù)給藥5 d后,治療組臨床癥狀基本消失(圖2B),感染對(duì)照組雞食欲減退,仍出現(xiàn)甩鼻、張口呼吸等癥狀(圖2C)。

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);N.陰性對(duì)照;P.陽性對(duì)照;1～18.雞毒支原體特異性序列擴(kuò)增產(chǎn)物M.DL2000 DNA marker;N. Negative control; P. Positive control; 1-18. MG specific sequence amplification product圖1 雞毒支原體擴(kuò)增條帶的電泳鑒定Fig.1 Electrophoresis results of MG

A. 空白對(duì)照組;B. 治療組;C. 感染對(duì)照組,精神萎靡,張口呼吸(圓圈)A. Blank control group; B. Treatment group; C. Infection control group, mental malaise, mouth breathing (circle)圖2 感染雞臨床癥狀Fig.2 Clinical symptoms of infected chickens

對(duì)D0～D11三組雞的呼吸、采食、精神狀態(tài)、甩鼻、咳嗽、流涕評(píng)分6種臨床癥狀的總評(píng)分進(jìn)行分析,結(jié)果見圖3。治療組總評(píng)分在給藥治療后逐漸降低,與感染對(duì)照組相比,治療組的總評(píng)分在D3明顯下降(P<0.05);在D6～D11,治療組總評(píng)分明顯低于感染對(duì)照組(P<0.05),且與空白對(duì)照組總評(píng)分無明顯差異(P>0.05)。

2.2 平均增重

各試驗(yàn)組雞的平均增重見表4,D0各組雞平均體重?zé)o差異,D12感染對(duì)照組和治療組的體重和平均增重顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05)。

表4 各組試驗(yàn)雞平均增重Table 4 Average weight gain of chickens in each

2.3 大體病變及評(píng)分結(jié)果

雞毒支原體感染后主要病變表現(xiàn)在肺和氣囊。在D2、D6和D12抽取試驗(yàn)雞進(jìn)行剖檢發(fā)現(xiàn),空白對(duì)照組的氣囊薄而透明(圖4 A1、A2、A3);感染對(duì)照組氣囊壁變厚,變渾濁,囊內(nèi)可見滲出的大量黃白色干酪樣物質(zhì)(圖4 C1、C2、C3);治療組在D2氣囊內(nèi)有滲出物(圖4 B1),在D6,氣囊透明,僅氣囊邊緣有少量泡沫樣和干酪樣滲出物(圖4 B2);D12天,部分試驗(yàn)雞的氣囊基本恢復(fù)正常(圖4 B3)。

A1～A3. 空白對(duì)照組;B1～B3. 治療組;C1～C3:感染對(duì)照組;B1、C1、C2、C3:氣囊壁變厚,囊內(nèi)可見滲出的大量黃白色干酪樣物質(zhì)(→標(biāo)注)。D2. 給藥1 d后;D6. 停藥第1天;D12.停藥第7 天,下同A1-A3.Blank control group; B1—B3: Treatment group; C1-C3.Infection control group; B1, C1, C2, C3.the wall of the air sac was thickened, and there was yellow-white cheese-like exudation in the air sac(→ labeled). D2.1 day after administration; D6.Day 1 of withdrawal; D12.Day 7 of withdrawal. The same as below圖4 氣囊病理變化Fig.4 Gross pathology in air sac

在D2、D6和D12的剖檢發(fā)現(xiàn),空白對(duì)照組的肺呈粉紅色,無眼觀病變(圖5 A1、A2、A3)。感染對(duì)照組和治療組在D2天,肺組織局部灰紅色,質(zhì)地變實(shí),有稍凸出肺表面的黃白色病灶(圖5 B1和C1);感染對(duì)照組的肺組織在D6和D12,呈灰紅色,在肺組織表面有凸起的灰白色病灶(圖5 C2、C3)。治療組中部分試驗(yàn)雞的肺在D6和D12眼觀無病變(圖5 B2、B3)。

A1～A3. 空白對(duì)照組;B1～B3. 治療組;C1～C3. 感染對(duì)照組;B1、C1、C2、C3. 肺組織局部灰紅色,質(zhì)地變實(shí),有稍凸出肺表面的黃白色或灰白色病灶(→標(biāo)注)A1-A3. Blank control group; B1-B3. Treatment group; C1-C3. Infection control group; B1, C1, C2, C3. The local lung tissue was grayish red, the texture became solid, and there were yellow-white or gray-white lesions slightly protruding from the lung surface (→ labeled)圖5 肺病理變化Fig.5 Gross pathology in lesions in lung

根據(jù)表2對(duì)肺和氣囊大體病變進(jìn)行評(píng)分,結(jié)果見圖6。在D2、D6和D12,與空白對(duì)照組相比較,感染對(duì)照組試驗(yàn)雞的肺和氣囊病變?cè)u(píng)分均顯著升高(P<0.05);與感染對(duì)照組相比,麻杏石甘口服液治療后肺和氣囊病變?cè)u(píng)分均顯著下降(P<0.05)。治療組D6天肺組織大體評(píng)分為0,顯著低于D2和D6(P<0.05);治療組的不同時(shí)間氣囊評(píng)分無顯著差異。

字母a和b分別表示與空白對(duì)照組、感染對(duì)照組比較(P<0.05)Letter a and b represent a significant difference compared to the blank control group and the infection control group respectively(P<0.05)圖6 麻杏石甘口服液治療試驗(yàn)肺和氣囊大體病變?cè)u(píng)分Fig.6 Maxingshigan oral liquid treatment test lung tissue and air sac gross lesion score

2.4 肺組織病理學(xué)觀察及評(píng)分結(jié)果

對(duì)D2、D6和D12采集的肺組織進(jìn)行組織病理學(xué)觀察,發(fā)現(xiàn)肺的二級(jí)和三級(jí)支氣管出現(xiàn)了相同的病理變化,其中三級(jí)支氣管結(jié)果見圖7。D2、D6和D12空白對(duì)照組的肺三級(jí)支氣管未見異常(圖7 A1、A2、A3)。在D2,感染對(duì)照組三級(jí)支氣管出現(xiàn)了肉芽腫,其中心為干酪樣壞死物(圖7 C1)。在D6,部分三級(jí)支氣管,上皮增生導(dǎo)致上皮葉延伸到周圍的三級(jí)支氣管腔,引起管腔閉塞(圖7 C2)。在D12,三級(jí)支氣管出現(xiàn)液化性壞死,其中壞死物質(zhì)導(dǎo)致氣道閉塞,病變合并在一起,累及大面積的肺組織(圖7 C3)。在D2,治療組肺的三級(jí)支氣管的肺房中混有紅細(xì)胞、脫落的上皮細(xì)胞以及滲出的漿液(圖7 B1),在D6、D12部分試驗(yàn)雞的肺三級(jí)支氣管基本恢復(fù)正常結(jié)果(圖7 B2、B3)。

A1～A3. 空白對(duì)照組;B1～B3. 治療組,上皮細(xì)胞脫落,漿液滲出(B1,→標(biāo)注);C1～C3. 感染對(duì)照組,凝固型壞死(C1,→標(biāo)注),上皮細(xì)胞增生(C2,→標(biāo)注),液化性壞死(C3,→標(biāo)注);Bar=200 μmA1-A3. Blank control group; B1-B3. Treatment group, epithelial cell shedding, slurry exudation ( B1, → labeled ),C1-C3. Infection control group, coagulation necrosis (C1, → labeled), epithelial cell proliferation ( C2, → labeled ), Liquefied necrosis ( C3, → labeled ); Bar=200 μm圖7 肺三級(jí)支氣管組織病理學(xué)觀察Fig.7 Histopathological observation of tertiary bronchus of lung

按表3中的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)肺組織進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)分,結(jié)果如圖8。在試驗(yàn)的D2、D6和D12,與空白對(duì)照組相比較,治療組和感染對(duì)照組病變?cè)u(píng)分顯著上升(P<0.05);與感染對(duì)照組相比,治療組病變?cè)u(píng)分顯著下降(P<0.05),治療組的不同時(shí)間肺組織病理學(xué)評(píng)分無顯著差異。

字母a和b分別表示與空白對(duì)照組、感染對(duì)照組比較(P<0.05)Letter a and b represent a significant difference compared to the blank control group and the infection control group respectively(P<0.05)圖8 麻杏石甘口服液治療試驗(yàn)肺組織病變?cè)u(píng)分Fig.8 Maxing shigan oral liquid treatment test lung tissue lesion score

2.5 臨床療效評(píng)價(jià)

根據(jù)“1.2.6”中的療效判定標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算,治療組的痊愈率為76.5%,治療的有效率為94.1%,無效率為5.9%(表5)。

表5 療效評(píng)價(jià)結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 5 Statistics on the efficacy evaluation results

3 討 論

目前,雞毒支原體感染仍在全球范圍流行[1,13],雞群之間主要是通過接觸、氣溶膠和污染物的直接和間接傳播[14]。雞群感染雞毒支原體后,嚴(yán)重影響蛋產(chǎn)量、雞蛋孵化率和飼料利用效率[15]。且一旦感染MG后機(jī)體抵抗力下降,極易引起其他并發(fā)癥,增加雞群30%以上的死亡率,給家禽養(yǎng)殖帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失[16]。臨床上多用疫苗和抗生素進(jìn)行防治,隨著抗生素耐藥的普遍性以及人們對(duì)綠色健康食品的關(guān)注增加,中藥組方在獸藥使用中越來越受關(guān)注。

MG入侵后在呼吸道上皮組織的黏附、定植、引起定植部位宿主細(xì)胞的損傷及機(jī)體免疫失調(diào)是其主要致病原因[17]。MG進(jìn)入宿主體內(nèi)后,首先通過其膜表面的黏附分子GapA和CrmA吸附在宿主呼吸道上皮細(xì)胞,然后在局部組織細(xì)胞內(nèi)大量增殖,并造成機(jī)體特別是呼吸系統(tǒng)的病理損傷,引起氣管和肺部的炎癥[18-20]。本試驗(yàn)中感染對(duì)照組肺組織的各級(jí)支氣管均出現(xiàn)了炎癥反應(yīng),治療組的肺和氣囊病變?cè)诮o藥后均顯著減輕(P<0.05),且肺各級(jí)支氣管炎性細(xì)胞浸潤較感染對(duì)照組輕,說明藥物治療能夠有效修復(fù)肺和氣囊病變,減輕或阻止肺組織的炎癥損傷。這可能是麻杏石甘口服液收縮了肺毛細(xì)血管,防止了滲出[21-22];減少炎癥反應(yīng)細(xì)胞的滲透從而減輕肺組織炎性細(xì)胞浸潤[23-24]。說明麻杏石甘湯有潛在的抗炎特性,能治療肺損傷[25]。本試驗(yàn)中使用的麻杏石甘口服液為麻杏石甘湯臨床用藥的劑型之一,有清肺平喘、辛涼宣泄的效果[26],能有效減少臨床癥狀[27]。在本研究中能夠減輕感染組雞群的呼吸困難的癥狀,給藥3 d后,雞群總體的臨床感染癥狀出現(xiàn)好轉(zhuǎn);在D6天,臨床癥狀基本消失;治療的有效率達(dá)94.1%,治愈率為76.5%。

本試驗(yàn)中治療組的雞增重遲緩改善不顯著,可能由于樣本較少或試驗(yàn)周期較短所致。試驗(yàn)雞D6天的肺大體評(píng)分顯著低于D2天,而在D12天肺組織大體評(píng)分高于D6天,且麻杏石甘口服液減輕呼吸困難雖有顯著效果,但未達(dá)到百分百的治愈率,可能是因其殺菌效果較弱,停藥后部分支原體恢復(fù)活力導(dǎo)致的。許多初步研究證實(shí)了天然產(chǎn)物的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用, 有一定的抗支原體作用[28-30]。但麻杏石甘湯實(shí)現(xiàn)抗菌效果的濃度是方劑的十倍或百倍,然而這是常用治療濃度難以達(dá)到的[31]。單方治療的痊愈率略低,制約了麻杏石甘湯在獸醫(yī)臨床上抗菌方面的應(yīng)用和普及,針對(duì)不同病因聯(lián)合抗生素可以提高療效,同時(shí)能減少抗生素的用量[32],或許臨床中治療肉雞感染雞毒支原體時(shí)與相應(yīng)抗生素合用,效果更佳。

4 結(jié) 論

麻杏石甘口服液可明顯改善雞毒支原體感染引起的呼吸困難,減弱氣囊和肺組織病理損傷,對(duì)雞慢性呼吸道病有較好的治療效果。