支 巖,梅 晨,劉珍邑,烏云格日樂,王宏俊*,胡 格*

(1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,北京 102206;2.北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100097;3.扎魯特旗畜牧業(yè)良種繁育中心,通遼 029100)

副雞禽桿菌(Avibacteriumparagallinarum, Apg)為革蘭陰性菌,無鞭毛,其毒力菌株常常存在莢膜結(jié)構(gòu)。Apg是一種兼性厭氧菌,目前常用的Page分型方法[1]可將其分為A、B、C三個(gè)血清型。研究表明,這三個(gè)血清型菌株均有致病性。Apg是引起雞傳染性鼻炎(infectious coryza, IC)的病原菌。IC最明顯的癥狀是鼻道和鼻竇等上呼吸道有漿液性或黏液性分泌物流出、面部水腫和結(jié)膜炎,導(dǎo)致蛋雞的產(chǎn)蛋率下降和生長(zhǎng)停滯[2]。該病在世界范圍內(nèi)廣泛分布。最新的調(diào)查顯示,在國(guó)內(nèi)17個(gè)省市地區(qū)的240個(gè)規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)中,Apg陽性場(chǎng)有119個(gè),場(chǎng)陽性率高達(dá)49.6%[3-4]。國(guó)際上,在印度,該病是僅次于沙門菌感染的第二大細(xì)菌性疾病[5],在南非和美國(guó)的部分地區(qū)肉雞中也廣泛感染,引起嚴(yán)重的肉質(zhì)下降,增加淘汰率,給養(yǎng)雞業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[6]。

深入研究病原菌的毒力因子和致病機(jī)理是建立科學(xué)防控策略的基礎(chǔ)和前提[7]。近年來,對(duì)Apg毒力因子的研究取得了一定的進(jìn)展,這對(duì)于挖掘疫苗候選抗原和研究弱毒疫苗具有重要意義。本文將從該病原菌的結(jié)構(gòu)成分和功能性分泌物等方面進(jìn)行系統(tǒng)綜述,以便深入研究Apg的致病機(jī)制和防控策略。

1 細(xì)菌被膜及組分

1.1 莢膜和莢膜多糖

莢膜是許多細(xì)菌的關(guān)鍵毒力因子,其位于細(xì)菌細(xì)胞壁表面。莢膜表現(xiàn)為一層邊界不明顯,易被洗脫的松散黏液物質(zhì),具有介導(dǎo)免疫反應(yīng)和抵抗物理應(yīng)激的作用[8]。細(xì)菌莢膜多糖(capsule polysacharides, CPS)是莢膜上的多糖結(jié)構(gòu),可以保護(hù)細(xì)菌免受吞噬作用和補(bǔ)體介導(dǎo)的殺傷,直接影響細(xì)菌的毒力[9]。一些細(xì)菌能夠在感染的不同階段調(diào)節(jié)莢膜表達(dá),這對(duì)疾病的發(fā)生和發(fā)展至關(guān)重要。CPS具有阻止細(xì)菌與宿主受體結(jié)合、干擾細(xì)菌定植的作用,因此被認(rèn)為是一種優(yōu)質(zhì)的疫苗候選抗原[10]。

Wu等[11]研究發(fā)現(xiàn),Apg中的莢膜生物合成位點(diǎn)有兩種基因型(I和II),但與血清型無關(guān)?；蛐虸和II的莢膜生物合成基因座分別由6個(gè)和5個(gè)基因組成。基因型I編碼的蛋白質(zhì)與多殺性巴氏桿菌莢膜A型和F型的蛋白質(zhì)最相似,而基因型II編碼的蛋白質(zhì)與多殺性假單胞菌莢膜D型和大腸桿菌K5的蛋白質(zhì)最相似。這些蛋白質(zhì)分別含有合成軟骨素和肝素的特異性基因。同時(shí),提取并純化Apg莢膜多糖,并以Apg血凝素(hemagglutinin, HA)為目標(biāo)抗原,結(jié)合后進(jìn)行免疫保護(hù),發(fā)現(xiàn)可以顯著提高血清抗體水平[12]。以上結(jié)果表明HA和CPS作為兩種不同性質(zhì)的細(xì)菌外膜成分,均具有一定的免疫原性,可以作為候選抗原,具有研發(fā)重組疫苗的應(yīng)用潛力。

Sawata等[13]發(fā)現(xiàn)一種含有透明質(zhì)酸的莢膜,它與細(xì)菌定植有關(guān),也是引起IC及其相關(guān)病變的主要因素。該莢膜能抵抗正常雞血清的殺菌活性,從而起到保護(hù)細(xì)菌的作用。具有莢膜結(jié)構(gòu)的Apg分離株往往擁有更強(qiáng)的毒力[14]。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證莢膜對(duì)Apg毒力的影響,Tu等[15]通過TargeTronH基因敲除系統(tǒng)構(gòu)建了hctA基因沉默的Apg莢膜突變株,發(fā)現(xiàn)該突變株的血凝活性與野生型菌株相比有明顯提升。此外,突變株表現(xiàn)出對(duì)雞胚成纖維細(xì)胞DF-1更強(qiáng)的黏附性和在非生物表面上形成生物膜的能力。毒力測(cè)定表明,莢膜突變株的毒性低于野生型菌株,敲除莢膜在增加了血凝和黏附活性的同時(shí)降低了毒力。

1.2 脂多糖

脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是革蘭陰性菌細(xì)胞壁外壁的組成成分,與致病菌的黏附、侵染和宿主細(xì)胞間的擴(kuò)散有關(guān)。脂多糖是一種“內(nèi)毒素”,細(xì)菌在生長(zhǎng)過程中不會(huì)主動(dòng)分泌,只有在細(xì)菌死亡時(shí)才會(huì)從破碎的菌體中被釋放出來?，F(xiàn)有研究表明,Apg的毒力強(qiáng)弱與脂多糖有關(guān),從血清型A、C菌株培養(yǎng)上清液中分離的脂多糖能引起心包積液,導(dǎo)致動(dòng)物發(fā)生中毒癥狀,產(chǎn)蛋率下降[16]。

1.3 磷酸膽堿

磷酸膽堿(phosphorylcholine, ChoP)是在許多黏膜病原體表面發(fā)現(xiàn)的重要毒力因子,其主要在LPS上表達(dá),具有增強(qiáng)細(xì)菌在黏膜上定植的作用[17]。Chiang等[18]研究發(fā)現(xiàn)在Apg臺(tái)灣分離株TW07的全基因組測(cè)序中,含有與流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)的lic1ABCD操縱子[19]和多殺巴斯德菌(Pasteurellamultocida)的pcgDABC操縱子[20]具有高度序列相似性的四基因操縱子,編碼膽堿激酶、膽堿通透酶、磷酸膽堿胞苷轉(zhuǎn)移酶和磷酸膽堿轉(zhuǎn)移酶;兩個(gè)操縱子都參與細(xì)菌LPS上ChoP的代謝和合成。在雞抗菌肽的殺菌試驗(yàn)中,ChoP的高表達(dá)增加了Apg的存活率。這些結(jié)果表明,ChoP與LPS的生物合成有關(guān),并具有一定保護(hù)效果,是影響Apg毒力強(qiáng)弱的重要因子。

1.4 外膜蛋白

外膜蛋白(outer membrane protein, OMPs)是革蘭陰性菌外膜的主要結(jié)構(gòu)成分,同時(shí)也是最先與宿主細(xì)胞相互作用的部位,在維持細(xì)菌自身結(jié)構(gòu)、營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸、致病性和免疫保護(hù)性等方面發(fā)揮著重要作用。OMPs還具有較強(qiáng)的免疫原性且能誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)[21]。HMTp210是Apg外膜蛋白上最主要的抗原之一,它包含一種在致病過程中起重要作用的外膜血凝素[22],具有血凝、細(xì)胞黏附和影響生物膜形成活性的功能[23]。其全長(zhǎng)約6.1 ku,分為“區(qū)域1”“區(qū)域2”和“區(qū)域3”三個(gè)區(qū)域。區(qū)域2的序列(大約位于HMTp210的編碼核苷酸3300-4800處)已被確定為高變區(qū)[24],可以作為抗原起到有效保護(hù)效果[25],并且與Apg的血清型分型有關(guān)[1],也是亞單位疫苗研發(fā)的重要靶點(diǎn)。全細(xì)菌滅活苗因?yàn)楹写罅績(jī)?nèi)毒素等非保護(hù)性抗原成分,毒副作用比較強(qiáng),而亞單位疫苗克服了這一缺點(diǎn),在降低生產(chǎn)成本的同時(shí)減輕了毒副作用,具有更高的安全性和保護(hù)效力。早期進(jìn)行過以外膜蛋白HagA作為Apg亞單位疫苗的抗原的相關(guān)研究,但由于免疫保護(hù)效果較差,因此未用于疫苗開發(fā)[26]。隨著對(duì)于Apg外膜蛋白的深入研究,發(fā)現(xiàn)利用HMTp210區(qū)域2構(gòu)建的重組融合肽可以起到和全菌滅活疫苗相同的保護(hù)效果,并且無明顯毒副作用,為新型IC疫苗的制備提供了思路[25]。

2 細(xì)菌分泌物

2.1 外膜囊泡

致病菌毒力因子的釋放有賴于專屬的分泌系統(tǒng),許多革蘭陰性菌通過分泌系統(tǒng)將毒力因子從細(xì)菌的胞內(nèi)分泌到宿主細(xì)胞或環(huán)境中。外膜囊泡(outer membrane vesicles, OMVs)是一種在革蘭陰性菌中普遍存在的包含生物學(xué)活性物質(zhì)的球狀囊泡狀結(jié)構(gòu)[27]。目前已知的大多數(shù)革蘭陰性菌如銅綠假單胞菌、幽門螺桿菌等分泌的OMVs可攜帶多種生物活性物質(zhì)[28-29],不僅是致病性病原的毒力因子[30],而且具有很好的免疫原性,是極具潛力的新型疫苗抗原[31]。早在2005年Ramón等[32]就發(fā)現(xiàn)Apg的外膜囊泡中含有RTX蛋白、血凝素抗原等毒力因子。Mei等[33]通過質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)Apg的OMVs蛋白組分包含膜蛋白、ATP依賴的RNA解旋酶、磷酸甘油酸激酶等。將該OMVs與雞巨噬細(xì)胞共培養(yǎng),細(xì)胞中炎癥相關(guān)基因表達(dá)水平顯著升高。將提取的A型Apg的OMVs制成疫苗進(jìn)行動(dòng)物免疫攻毒試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)接種疫苗的雞血清中IgG水平顯著提高,說明OMVs刺激了雞的體液免疫。但是免疫后的試驗(yàn)雞僅對(duì)A型Apg菌株的攻毒保護(hù)率高達(dá)80%,對(duì)于B型和C型菌株的保護(hù)率不超過30%[33],這表明OMVs攜帶的抗原成分具有特異性,并且沒有血清型之間的交叉保護(hù)作用。

Xu等[34]對(duì)Apg分離株P(guān)4chr1及其OMVs進(jìn)行比較基因組分析,發(fā)現(xiàn)OMVs具有攜帶和轉(zhuǎn)移抗生素抗性基因(antibiotics resistance genes, ARGs)的能力。測(cè)序和數(shù)據(jù)分析表明,分離株P(guān)4chr1的基因組大小約為2.77 Mb,包含一個(gè)大小為25 kb,涵蓋11種ARGs的耐藥基因島。該OMVs囊括的基因組大小約為2.69 Mb,覆蓋了97%的基因組長(zhǎng)度和P4chr1株幾乎所有基因序列。經(jīng)過純化和DNase處理后,來自耐藥分離株的OMVs與抗生素敏感的參考株在含有氯霉素、紅霉素、四環(huán)素或鏈霉素的培養(yǎng)基平板上共同培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)均有菌落生長(zhǎng),并可在這些菌落中檢測(cè)到對(duì)應(yīng)的ARG,表明OMVs具有傳遞攜帶Apg耐藥基因的特性。

2.2 金屬蛋白酶

細(xì)菌蛋白酶,特別是由病原體產(chǎn)生的蛋白酶,會(huì)對(duì)其宿主產(chǎn)生毒性作用[35],并與毒力和致病性有關(guān)。金屬蛋白酶(metalloproteinases, MPs)是一類活性中心含有金屬離子的蛋白酶[36],可以有效地水解蛋白質(zhì)和多肽[37]。金屬蛋白酶最初以不活躍的酶原形式產(chǎn)生,由胞內(nèi)和胞外蛋白(如纖溶酶)激活。Rivero-García等[38]就發(fā)現(xiàn)Apg在體內(nèi)生長(zhǎng)時(shí),黏膜表面可以分泌一種金屬蛋白酶,能降解雞免疫球蛋白IgA和IgG,盡管不能做到完全降解,但這種蛋白酶活性可能是一種毒力因子,促進(jìn)細(xì)菌定植并逃避免疫防御或獲得營(yíng)養(yǎng),在Apg引起致病過程中發(fā)揮作用。

2.3 RTX毒素

RTX毒素(repeats in the structural toxin)是由多種革蘭陰性細(xì)菌產(chǎn)生的一種外毒素,可對(duì)人和動(dòng)物致病,也是評(píng)估細(xì)菌毒力的重要標(biāo)志物[39]。Mena-Rojas等[40]在Apg中純化出一種相對(duì)分子質(zhì)量為110 ku的蛋白,并通過試驗(yàn)證明該蛋白可能屬于RTX蛋白家族,被認(rèn)為是不同于革蘭陰性病原體的重要毒力因子,該蛋白家族還包含溶血毒素、金屬蛋白酶和脂肪酶等[41]。以前的報(bào)道也提到嗜血桿菌中有潛在的RTX毒素基因[42],這些基因在Apg中更可能以細(xì)胞毒素的形式出現(xiàn)。2014年,Küng和Frey等[43]發(fā)現(xiàn)一種名為avxA的二價(jià)絲氨酸蛋白酶-RTX孔蛋白毒素(bivalent serine-protease-RTX-porin toxin),并構(gòu)建得到Apg突變株JF4965(包含特定的重組基因avxA-RTX、avxC和hlyBD)。該毒素編碼RTX操縱子結(jié)構(gòu),具有激活基因avxC、結(jié)構(gòu)絲氨酸蛋白酶-RTX毒素基因avxA和適當(dāng)?shù)腎型分泌系統(tǒng)基因avxBD。AvxA屬于復(fù)合RTX毒素,在結(jié)構(gòu)毒素中具有兩個(gè)主要結(jié)構(gòu)域,這在RTX毒素中相當(dāng)罕見。在AvxA中,N端結(jié)構(gòu)域代表絲氨酸蛋白酶,C端結(jié)構(gòu)域代表RTX細(xì)胞毒素,這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域相互切割。因此,AvxA被稱為多功能自動(dòng)處理RTX毒素(MARTX),屬于具有多種活性的RTX毒素[44]。AvxA-RTX對(duì)禽巨噬細(xì)胞HD11具有細(xì)胞毒性,但對(duì)牛巨噬細(xì)胞BoMac無細(xì)胞毒性。來自血清A型Apg菌株的重組AvxA-RTX單特異性兔抗血清中的IgG能夠中和Apg血清型A、B和C培養(yǎng)物上清液的細(xì)胞毒活性[43],表明AvxA是Apg的主要細(xì)胞毒力因子。

3 鐵離子獲取和利用

鐵是大多數(shù)細(xì)菌必不可少的微量元素,參與細(xì)胞內(nèi)酶的合成,影響細(xì)胞代謝過程。細(xì)菌的獲鐵系統(tǒng)在其感染宿主及致病過程中起著重要作用,細(xì)菌獲鐵系統(tǒng)相關(guān)的蛋白也是重要的毒力因子。然而,宿主中游離鐵的濃度不足以支持細(xì)菌的生長(zhǎng)[45]。為了實(shí)現(xiàn)有效的鐵穩(wěn)態(tài),細(xì)菌已經(jīng)進(jìn)化出復(fù)雜的鐵獲取系統(tǒng),以從周圍環(huán)境(鐵載體、血細(xì)胞或宿主分子結(jié)合蛋白)中獲取鐵,以確保充足的供應(yīng)[46],從而發(fā)揮其毒力。

3.1 鐵載體轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)

能夠獲取游離無機(jī)鐵的鐵載體轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)由細(xì)菌外膜上的鐵載體和TonB依賴性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TonB-dependent transferrin receptors, TBDR)組成[47]。三價(jià)鐵載體通過外膜受體運(yùn)輸時(shí)需要耗能,而這種能量是由TonB能量系統(tǒng)提供的。因此,在鐵限制條件下,細(xì)菌會(huì)增加一些與TonB能量系統(tǒng)相關(guān)的蛋白表達(dá),以促進(jìn)鐵載體穿過外膜進(jìn)入胞質(zhì)。TonB依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(TonB-dependent transporters, TBDT)是一種膜蛋白,能夠高親和地結(jié)合鐵、維生素B12、鐵載體和碳水化合物,其中一些成分還可能作為毒力因子發(fā)揮作用[48]。

TonB ExbB-ExbD蛋白存在于許多革蘭陰性細(xì)菌中,其中大多數(shù)存在于大腸桿菌系統(tǒng)中。Huo等[49]研究發(fā)現(xiàn)在鐵刺激條件下,Apg中發(fā)生了TonB系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ExbD和ExbB共轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象,很可能還存在TonB ExbB-ExbD蛋白質(zhì)復(fù)合物。由于將鐵從周質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)需要細(xì)胞質(zhì)膜上的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-binding cassette transporter, ABC transporter)參與,因此轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ATP結(jié)合蛋白的表達(dá)也被上調(diào),以更好地促進(jìn)鐵進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)并提高細(xì)菌對(duì)鐵的利用率。以上試驗(yàn)結(jié)果表明,ExbD和ExbB通過鐵載體轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)發(fā)揮作用,影響細(xì)菌的鐵獲取和毒性。

3.2 血紅素利用系統(tǒng)

血紅素利用系統(tǒng)在細(xì)菌的鐵獲取和致病性中起到重要作用[50]。通常,血紅素?cái)z取系統(tǒng)由TonB依賴性外膜受體蛋白、周質(zhì)結(jié)合蛋白和內(nèi)膜相關(guān)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白組成[45]。對(duì)病原菌而言,游離鐵的可用性受到嚴(yán)格限制,導(dǎo)致鐵載體獲取不足[51]。因此,為了從血紅素中獲取鐵,細(xì)菌利用了復(fù)雜的血紅素獲取機(jī)制[46]。革蘭陰性菌還可以通過外部TBDR將血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)至周質(zhì),然后周質(zhì)血紅素結(jié)合蛋白將其轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)[52]。在細(xì)胞質(zhì)中,血紅素可以被血紅素降解酶降解,從而獲得鐵離子[51]。

HutZ是一種儲(chǔ)存血紅素的蛋白,它在血紅素利用、生物膜形成和某些細(xì)菌的致病性方面起著重要作用[50]。研究發(fā)現(xiàn),HutX是一種細(xì)胞質(zhì)血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,有促進(jìn)血紅素向HutZ的轉(zhuǎn)移的作用,通過特定的蛋白質(zhì)相互作用實(shí)現(xiàn)[53]。在鐵限制條件下,HutZ和HutX蛋白會(huì)優(yōu)先表達(dá)[52],這表明血紅素?cái)z取可能是獲得鐵的重要途徑之一。HutZ也可以被視為在細(xì)胞質(zhì)中釋放鐵的血紅素降解酶,而HutX則是HutZ的細(xì)胞質(zhì)血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,有助于Apg獲得鐵和利用血紅素。

4 內(nèi)源性質(zhì)粒

質(zhì)粒是一種獨(dú)立于細(xì)菌基因組之外的攜帶遺傳信息并具有自主復(fù)制能力的環(huán)狀DNA分子,可以攜帶耐藥基因或其他功能元件,是細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性以及額外功能的重要途徑,同時(shí)也是影響細(xì)菌毒力的一個(gè)重要因素[54]。

質(zhì)?？赡苓€攜帶一些特殊基因,會(huì)對(duì)菌株的生長(zhǎng)特性或者毒力產(chǎn)生影響。最早在2003年,Terry等[55]在Apg分離株HP250中首次檢測(cè)到一種大小為6.29 kb的質(zhì)粒p250。該質(zhì)粒上存在一個(gè)細(xì)菌素編碼位點(diǎn),該基因與流感嗜血桿菌素的細(xì)菌素(haemocin)編碼基因高度同源,但因其基因座中的基因無法擴(kuò)增,所以蛋白功能尚不清楚。

直到2007年,Hsu等[56]從18株中國(guó)臺(tái)灣地區(qū)Apg分離株中檢測(cè)鑒定了兩種質(zhì)粒:pYMH5和pA14。pYMH5是一種大小為5 047 bp的耐藥性相關(guān)質(zhì)粒,編碼功能性鏈霉素、磺胺、卡那霉素和新霉素的抗性基因,并顯示出與廣泛宿主范圍質(zhì)粒pLS88具有顯著的同源性,這是Apg中報(bào)道的第一個(gè)多重抗生素抗性質(zhì)粒。pA14是另一種質(zhì)粒,可以通過克隆獲得兩種表達(dá)載體:pYMH11和pYMH12。測(cè)序發(fā)現(xiàn)它們分別編碼MglA蛋白和外切核糖核酸酶(RNaseⅡ)。已有研究表明,在流產(chǎn)布魯氏菌(Brucellaabortus)和土拉弗朗西斯菌(Francisellatularensis)中也中也存在MglA蛋白,并且對(duì)其毒力產(chǎn)生重要影響。MglA通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子,導(dǎo)致細(xì)胞存活能力下降[57],并且影響土拉弗朗西斯菌中噬菌體與溶酶體的結(jié)合[58]。其他Apg分離株的全基因組測(cè)序分析也發(fā)現(xiàn)了RNase II基因序列的存在[34]。編碼RNase II的主要蛋白VacB在先前的試驗(yàn)中已被證實(shí)是福氏志賀菌(Shigellaflexneri)和腸侵襲性大腸桿菌(Escherichiacoli)中表達(dá)毒力所必需的基因,缺乏RNase II會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞無法正常生長(zhǎng)[59-60]。2018年,在我國(guó)的Apg分離株中也重復(fù)發(fā)現(xiàn)了這三種質(zhì)粒[61],表明這些質(zhì)粒的存在并不是偶然事件。2023年,劉洋洋等[62]誘導(dǎo)構(gòu)建了質(zhì)粒p250和p A14缺失株APG-HuΔ,攻毒試驗(yàn)表明,質(zhì)粒缺失株的毒力顯著下降。綜上所述,這些結(jié)果表明質(zhì)粒是Apg的重要毒力因子,需要進(jìn)一步研究其作用機(jī)制。

5 其他毒力因子

隨著對(duì)Apg的研究愈發(fā)深入,人們發(fā)現(xiàn)了更多的毒力因子,例如Tn10轉(zhuǎn)座子、菌毛蛋白和CDT毒素等。然而,這些毒力因子的作用機(jī)制尚不十分明確。

5.1 Tn10轉(zhuǎn)座子

Tn10是一種大小為9 147 bp的復(fù)合轉(zhuǎn)座子,攜帶四環(huán)素抗性基因(tetR/A/C/D)[63]。Tn10被廣泛應(yīng)用于誘變研究,以研究突變對(duì)適應(yīng)度的影響,并用于構(gòu)建標(biāo)記的mini-Tn10質(zhì)粒庫,以削弱病原體的毒力,可用于減毒活疫苗的制備[64]。2013年,Requena等[65]在秘魯Apg分離株中發(fā)現(xiàn)一個(gè)與轉(zhuǎn)座子Tn10相似性高達(dá)99%的6 488 nt片段,其中包含四個(gè)四環(huán)素抗性基因。此外,基因組中還發(fā)現(xiàn)了IgA蛋白酶,表明其可能具有水解雞的IgA樣免疫球蛋白的能力。這種蛋白酶可以切割宿主分泌的IgA免疫球蛋白,從而繞過宿主黏膜防御機(jī)制,增強(qiáng)感染呼吸道的能力[66]。

5.2 菌毛蛋白

菌毛是許多病原菌表面的蛋白質(zhì)細(xì)絲,參與細(xì)菌對(duì)宿主細(xì)胞的黏附和侵襲,在微生物的定植中起重要作用[67]。2016年Liu等[68]通過對(duì)Apg TW07的測(cè)序發(fā)現(xiàn)了一個(gè)flfA蛋白,它是F17樣菌毛基因簇的一部分。研究發(fā)現(xiàn),在攻毒試驗(yàn)中,fifA蛋白可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體。同時(shí),發(fā)現(xiàn)flfA基因缺失株TW07-DflA的毒力低于其親本野生型菌株TW07,表明flfA基因也可能是Apg的一個(gè)重要毒力因子。

5.3 CDT毒素

細(xì)胞致死性膨脹毒素(cytolethal distending toxin, CDT)是由革蘭陰性致病菌產(chǎn)生的基因毒素。完整的CDT是由CdtA、Cdt B和Cdt C三個(gè)亞基組成的異源三聚體,其主要功能是破壞真核細(xì)胞的染色體DNA,導(dǎo)致細(xì)胞分裂周期阻滯,進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡,這有助于細(xì)菌有效突破宿主的防御并實(shí)現(xiàn)定植感染[69]。2013年Chen等[70]通過對(duì)Apg分離株進(jìn)行全基因組測(cè)序分析,發(fā)現(xiàn)了一段全長(zhǎng)約為2.1 kb的CdtABC基因。PCR結(jié)果顯示,不同的Apg分離株中均能擴(kuò)增CdtABC基因,并且其序列高度保守。采用HeLa細(xì)胞和DF-1細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞毒性測(cè)定試驗(yàn),結(jié)果表明Apg中的CDT毒素可以完全殺死DF-1細(xì)胞,并引起HeLa細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)膨脹和細(xì)胞核增大等中毒病變。免疫試驗(yàn)結(jié)果顯示,使用CdtABC基因制備的多克隆抗體可以有效中和CDT毒素的活性,為Apg疫苗的研發(fā)提供了新的方向。

6 小 結(jié)

Apg作為IC的病原菌,近年來在國(guó)內(nèi)外廣泛傳播,持續(xù)受到關(guān)注。最近有學(xué)者報(bào)道在發(fā)病的鵝和鵪鶉中分離到Apg,表明Apg的宿主動(dòng)物不再單一,有可能感染其他禽類,造成更嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,對(duì)Apg毒力因子的研究日益深入,不斷有新的毒力因子被發(fā)現(xiàn),其中部分毒力因子間具有協(xié)同作用。然而,至今還沒有完全闡明與Apg毒力分泌系統(tǒng)調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及涉及的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、群體感應(yīng)系統(tǒng)、外膜囊泡攜帶ARG轉(zhuǎn)移等上游機(jī)制有關(guān)的信息。鑒于細(xì)菌毒力系統(tǒng)的重要性,了解各毒力因子在致病過程中的地位和協(xié)同作用至關(guān)重要。通過結(jié)合生物信息學(xué)分析,可以綜合研究Apg的毒力相關(guān)基因表達(dá)、蛋白功能和生物學(xué)特性。同時(shí)還可以運(yùn)用蛋白-蛋白/蛋白-核酸互作技術(shù),深入探究Apg毒力因子的作用機(jī)制。希望通過這些研究,解決不同血清型Apg疫苗無法提供有效交叉保護(hù)的難題,為IC的防控和新型疫苗的開發(fā)提供新的思路和理論基礎(chǔ)。