林俊生, 葉怡虹, 盧娉霞, 胡倩, 葉婷婷, 陳加弟, 曹穎平

遺傳學(xué)因素是導(dǎo)致先天畸形的重要因素之一[1-2]。臨床上對(duì)于先天畸形的遺傳學(xué)檢測(cè)方法主要有常規(guī)核型分析(conventional cytogenetic analysis, CCA)、單核苷酸多態(tài)性微陣列(single nucleotide polymorphism microarray, SNP)分析和熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization, FISH)技術(shù)。CCA雖然能夠分析全部染色體,但其只能檢測(cè)大片段異常(>10 Mb),無法檢測(cè)小片段的插入、倒位、微缺失和微重復(fù),而且對(duì)于區(qū)帶相似、片段大小相近的大片段染色體隱匿性易位也不易檢出[3]。SNP技術(shù)作為CCA的重要補(bǔ)充,可以檢測(cè)CCA難以檢測(cè)出的染色體微缺失和微重復(fù),但是無法檢測(cè)平衡易位。FISH技術(shù)雖然能夠檢測(cè)平衡易位,尤其是隱匿性易位,但是只能分析已知序列的染色體異常,無法實(shí)現(xiàn)全基因組檢測(cè)。本研究聯(lián)合CCA、SNP和FISH技術(shù)對(duì)攜帶有罕見隱匿性染色體異常的胎兒進(jìn)行遺傳學(xué)分析,并為父母再生育提供遺傳咨詢。

1 資料與方法

1.1 一般資料 胎兒母親年齡28歲,2019年3月孕16周左右胚胎停育。本次妊娠為宮內(nèi)單胎妊娠,因胎兒超聲異常于19周行產(chǎn)前診斷。孕19+6周三維超聲提示,胎兒腦積水、臍靜脈走行異常(持續(xù)性右臍靜脈?)、心肌回聲稍增強(qiáng)、局部腸管回聲稍增強(qiáng);孕22+3周三維超聲提示,胎兒各生長徑線測(cè)值均小于相應(yīng)孕周,存在胎兒腦積水、復(fù)雜心臟畸形(室間隔缺損、主動(dòng)脈增寬騎跨、肺動(dòng)脈狹窄——法洛四聯(lián)癥?)、永存左上腔靜脈、持續(xù)性右臍靜脈、雙側(cè)腎盂分離、臍帶繞頸。胎兒父母為非近親婚配。本研究經(jīng)筆者醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2023KY200)。

1.2 方法

1.2.1 試劑和儀器 羊水細(xì)胞培養(yǎng)基(BM1013-10,杭州寶榮科技有限公司);FISH探針試劑盒(S500-24,美國雅培公司);QIAamp DNA Mini Kit(51304,德國 QIAGEN公司);CytoScanTMHD芯片及試劑盒(901859,美國Affmetrix公司)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀(7900,美國ABI公司);分光光度計(jì)(NanoDrop 2000/2000c)和GeneChipTM雜交爐(Applied Biosystems)(美國賽默飛公司);基因芯片全自動(dòng)洗滌工作站(Affymetrix 7G)和高分辨率芯片掃描儀(Affymetrix Genechip Scanner 3000)(美國 Affmetrix公司)。

1.2.2 顯帶核型分析技術(shù)檢測(cè)染色體核型 抽取羊水及胎兒父母外周血,按照常規(guī)方法制備染色體,利用G顯帶技術(shù)進(jìn)行顯帶。利用Cytoversion軟件(LeicaGSL120,德國萊卡公司)進(jìn)行分析,按照人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制(ISCN2018)進(jìn)行描述。

1.2.3 SNP檢測(cè) 提取羊水細(xì)胞及父母外周血核酸,進(jìn)行SNP測(cè)序操作,并利用DECIPHER數(shù)據(jù)庫、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM)和美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)等在線數(shù)據(jù)庫對(duì)異常染色體進(jìn)行分析,并判讀結(jié)果。

1.2.4 中期FISH技術(shù)檢測(cè) 根據(jù)操作手冊(cè),分別利用FISH探針進(jìn)行雜交和檢測(cè),其中1號(hào)和12號(hào)短臂末端信號(hào)均為綠色,長臂末端信號(hào)均為紅色。

2 結(jié) 果

2.1 CCA結(jié)果 CCA檢測(cè)結(jié)果顯示,胎兒、母親和父親均未見染色體異常(圖1)。

A：胎兒染色體核型分析結(jié)果為46,XX;B：母親染色體核型分析結(jié)果為46,XX;C：父親染色體核型分析結(jié)果為46,XY。

2.2 SNP分析結(jié)果 胎兒SNP檢測(cè)結(jié)果：arr[hg19]Xp22.12(20,212,014-20,718,134)x3, 1p36.33p36.13 (849,466-16,724,642)x1, 12q24.31q24.33 (122,915,078-133,777,562) x3,提示本例為Xp22.12(506.1 kb)片段重復(fù)、1p36.33p36.13缺失和12q24.31q24.33重復(fù)的胎兒。Xp22.12區(qū)段含有RPS6KA3(300075) 基因部分片段(圖2A),1p36.33p36.13內(nèi)含GABRD(137163)、PRDM16 (605557)和SKI(164780)等147個(gè)OMIM基因(圖2B),12q24.31q24.33區(qū)段內(nèi)含PUS1 (608109)和ANKLE2 (616062)等56個(gè)OMIM基因(圖2C)。母親SNP結(jié)果正常。父親SNP結(jié)果顯示,Xp22.12(506.1 kb)片段重復(fù),與胎兒X染色體SNP檢測(cè)結(jié)果一致,但父親無臨床表型,提示該片段重復(fù)不是胎兒超聲畸形的遺傳因素。1p36.33p36.13缺失和12q24.31q24.33重復(fù)可能是由于父母一方攜帶t(1;12)(1p36.13;12q24.31)所致。

SNP：?jiǎn)魏塑账岫鄳B(tài)性微陣列。A：X染色體重復(fù),Xp22.12存在506.1 kb重復(fù);B：1號(hào)染色體缺失,1p36.33p36.13區(qū)段存在15.8 Mb片段缺失;C：12號(hào)染色體重復(fù),12q24.31q24.33區(qū)段存在10.8 Mb片段重復(fù)。

2.3 FISH技術(shù)檢測(cè)結(jié)果 胎兒羊水中期FISH檢測(cè)結(jié)果顯示：2條12號(hào)染色體均正常;2條1號(hào)染色體中,1條正常,1條為衍生染色體,為ish der(1)t(1;12)(12q+,1q+),即1號(hào)染色體于1p36.13斷裂丟失,并連接上來自于12號(hào)染色體12q24.31q24.33片段(圖3A、B)。母親外周血中期FISH檢測(cè)結(jié)果顯示：ish t(1;12)(12q+,1q+;12p+,1p+)(圖3C、D)。父親FISH檢測(cè)結(jié)果為正常(圖3E、F)。

FISH：熒光原位雜交。A、B：胎兒FISH結(jié)果為ish der(1)t(1;12)(12q+,1q+)(紅色箭頭所指為異常染色體);C、D：母親FISH結(jié)果為ish t(1;12)(12q+,1q+;12p+,1p+)(紅色箭頭所指為異常染色體);E、F：胎兒父親FISH檢測(cè)結(jié)果未見異常。

2.4 遺傳咨詢 綜合CCA、SNP技術(shù)和FISH檢測(cè)結(jié)果,明確胎兒核型為46,XX, der(1)t(1;12)(1p36.13;12q24.31);母親核型為46,XX, t(1;12)(1p36.13;12q24.31);父親核型為46,XY。結(jié)合胎兒超聲檢查結(jié)果異常,孕婦及家屬選擇終止妊娠。經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)討論,于妊娠28周時(shí)進(jìn)行引產(chǎn)。

3 討 論

CCA雖然是胎兒染色體疾病產(chǎn)前診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”,但其無法檢測(cè)微缺失、微重復(fù)以及隱匿性染色體相互易位[4-5]。隱匿性染色體相互易位指在光學(xué)顯微鏡下無法辨認(rèn)的微小或條帶相似的染色體片段的易位[6]。聯(lián)合SNP和FISH技術(shù)可以檢測(cè)CCA不易檢測(cè)的染色體隱匿性易位,為患者提供更為全面和準(zhǔn)確的產(chǎn)前遺傳學(xué)診斷。本次研究聯(lián)合CCA、SNP和FISH技術(shù)對(duì)該多發(fā)畸形胎兒進(jìn)行遺傳學(xué)產(chǎn)前診斷。

胎兒CCA分析結(jié)果顯示,未見染色體異常,但是超聲顯示胎兒為多發(fā)畸形。SNP結(jié)果為Xp22.12重復(fù)(506.1 kb)、1p36.33p36.13缺失(15.8 Mb)和12q24.31q24.33重復(fù)(10.8 Mb),提示胎兒父母之一可能為1號(hào)和12號(hào)染色體易位的攜帶者。FISH結(jié)果明確胎兒遺傳了因母親攜帶隱匿性易位形成的衍生1號(hào)染色體der(1)t(1;12)(1p36.13;12q24.31)。相互易位的片段均大于10 Mb,理論上利用CCA可檢測(cè)出來,但是由于1p36.33p36.13和12q24.31q24.33的G顯帶帶紋均為淺帶,很相似,兩者的易位使用CCA技術(shù)難以檢測(cè)。本次聯(lián)合應(yīng)用CCA、SNP和FISH技術(shù),成功診斷出攜帶有隱匿性染色體變化的胎兒。CCA結(jié)果父親為46,XY,母親為46,XX,FISH檢測(cè)發(fā)現(xiàn),母親存在隱匿性易位,胎兒母親理論上在減數(shù)分裂會(huì)形成18種配子,生育正常胎兒為1/18,生育表型正常的攜帶者概率為1/18,其余16/18均為染色體不平衡易位。因此該母親再次妊娠時(shí),應(yīng)進(jìn)行遺傳學(xué)咨詢。

胎兒Xp22.12發(fā)生506.1 kb的重復(fù),內(nèi)含RPS6KA3基因的部分片段,該基因突變與X染色體連鎖顯性遺傳的Coffin-Lowry綜合征等疾病相關(guān)[7-8],但該片段重復(fù)與胎兒的臨床表型是否相關(guān)尚不明確。父母SNP結(jié)果顯示,該片段遺傳自父親,父親無異常表型,推測(cè)Xp22.12發(fā)生506.1 kb的重復(fù)不是胎兒致畸的遺傳學(xué)因素。

胎兒在1p36.33p36.13發(fā)生15.8 Mb片段的缺失,內(nèi)含GABRD、PRDM16、SKI等147個(gè)OMIM基因,通過數(shù)據(jù)庫分析,提示1p36.33p36.13為致病性,主要涉及1p36缺失綜合征,又稱為1p36單體[9]。1p36缺失綜合征是最常見的染色體亞端粒區(qū)域微缺失,在活產(chǎn)新生兒中發(fā)病率約為1/5 000,于1980年由HAIN等[10]首次報(bào)道。SHAPIRA等[11]發(fā)現(xiàn),1p36缺失綜合征患者具有典型的臨床表型：面容異常、前囟閉合延遲、細(xì)發(fā)絲、內(nèi)眥贅皮、短指/先天性指屈曲、短足、身材矮小、不同程度的發(fā)育遲緩和智力障礙等。季修慶等[12]和劉慧麗等[13]也發(fā)現(xiàn),1p36缺失綜合征具有典型面容特征、智力障礙,尤其是語言發(fā)育落后和矮小等特點(diǎn)。

胎兒在12q24.31q24.33發(fā)生10.8 Mb片段的重復(fù),內(nèi)含PUS1和ANKLE2等56個(gè)OMIM基因。12號(hào)染色體長臂末端部分三體綜合征是一種非常罕見的染色體異常。李紅嫵[14]報(bào)道1例12q24三體胎兒存在先天畸形,出生后14 d死亡。數(shù)據(jù)庫分析顯示,PUS1基因純合突變與常染色體隱性遺傳的乳酸酸中毒性肌病并鐵粒幼細(xì)胞貧血1型疾病相關(guān),臨床表型包括生長發(fā)育異常、小頭畸形、肌無力和智力障礙等[15]。ANKLE2基因純合或復(fù)合雜合突變與常染色體隱性遺傳的原發(fā)性小頭畸形16型疾病相關(guān),臨床表型包括身材矮小、小頭畸形、上瞼下垂以及隱睪癥等[16]。胎兒孕20周三維彩超結(jié)果顯示,胎兒雙側(cè)側(cè)腦室擴(kuò)張(1.4 cm)、持續(xù)性右臍靜脈、心肌回聲稍增強(qiáng)、局部腸管回聲稍增強(qiáng),可能與1p末端缺失和12q末端重復(fù)有關(guān)。

綜上所述,本研究通過聯(lián)合應(yīng)用CCA、SNP和FISH技術(shù),對(duì)攜帶有隱匿性易位導(dǎo)致胎兒染色體發(fā)生隱匿性結(jié)構(gòu)異常的患者進(jìn)行分析,明確了CCA和SNP結(jié)果不一致的原因,以及1p36.33p36.13缺失(15.8 Mb)和12q24.31q24.33重復(fù)(10.8 Mb)是該胎兒畸形的遺傳學(xué)病因。因此,產(chǎn)前診斷時(shí)應(yīng)用多種遺傳學(xué)診斷技術(shù)進(jìn)行綜合判斷,可為臨床提供更準(zhǔn)確的遺傳信息,有利于遺傳缺陷胎兒的診斷。