劉晨, 曾烏查, 黃赟

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是最常見的肝惡性腫瘤類型,約占肝惡性腫瘤總病例數(shù)的90%[1-2]。HCC的病因主要有病毒性肝炎、非酒精性脂肪肝和酒精相關(guān)性肝病等[2]。近年來,盡管在治療性手術(shù)(手術(shù)切除和肝移植)、放療、全身化療、靶向治療和免疫治療等方面取得了進(jìn)展,但HCC患者的預(yù)后較其他癌癥仍然較差[2]。因此,尋找新的、有效的干預(yù)策略,探索更多有效的輔助治療方案,對提高HCC患者長期生存率具有重要的臨床意義和社會價值。

近年來,從中草藥中尋找高效、低毒的輔助抗癌藥物成為腫瘤治療研究的新熱點。紫檀芪(pterostilbene,PTE,3,5-二甲氧基-4′-羥基苯乙烯)是一種酚類化合物,提取自紫檀、藍(lán)莓和花櫚木等天然作物中,具有多種藥理作用,包括抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗纖維化和抗衰老等[3-4]。PTE能夠激活多種信號通路從而抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,其廣泛的抗癌活性、逆轉(zhuǎn)化療藥物的耐藥性以及增加放療敏感性等作用已在乳腺癌、宮頸癌和結(jié)腸癌等腫瘤中得到驗證[5]。已有研究[6-9]報道,PTE在肝臟中的保護(hù)作用可能與其抗氧化應(yīng)激、抗炎等作用密切相關(guān)。本研究旨在探索PTE在HCC增殖和遷移過程中的作用機(jī)制,并探討PTE對氧化應(yīng)激和 NLRP3 炎癥小體的影響,以期為PTE進(jìn)一步應(yīng)用于HCC的臨床治療提供新的思路和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和細(xì)胞系 PTE(純度>97 %,上海Aladdin公司);3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide, MTT]試劑盒、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、VAS2870、N-乙酰半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine,NAC)、過氧化氫(hydrogen peroxide, H2O2)、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)(美國Sigma-Aldrich公司);白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-18 ELISA試劑盒(美國Life Technologies公司);核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain, leucine-rich repeat and pyrin domain-containing3,NLRP3)、凋亡相關(guān)的斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(cysteine-requiring aspartate protease 1,Caspase-1)、尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(recombinant nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4,NOX4)、IL-1β抗體、周期蛋白-D1(Cyclin D1,CCND1)抗體、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)抗體、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)抗體(美國Cell Signaling Technology公司);抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體(美國Proteintech公司);磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、改良Eagle培養(yǎng)基(dulbecco’s modified eagle medium, DMEM)(美國Gibico公司);草酸銨結(jié)晶紫染色液(北京 Solarbio 公司);Transwell細(xì)胞培養(yǎng)小室(美國康寧公司);永生化人肝細(xì)胞LO2、HCC Hep3B、HepG2、Bel-7404 (上海中喬新舟生物技術(shù)有限公司);HCC Bel-7402 (上海聯(lián)邁生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)70% 密度時更換為無血清培養(yǎng)基,再給予藥物處理。

1.2.2 平板克隆形成實驗 細(xì)胞以200 個/孔的密度種植于6孔培養(yǎng)板上。培養(yǎng)14 d后用PBS洗滌,再用2.0% 結(jié)晶紫染色。使用顯微鏡對細(xì)胞克隆團(tuán)進(jìn)行計數(shù),并確保每個細(xì)胞團(tuán)含50個以上細(xì)胞。

1.2.3 細(xì)胞存活率及增殖能力檢測 采用MTT細(xì)胞增殖實驗檢測細(xì)胞的存活率和增殖情況。細(xì)胞以1 500個/孔(用于測定增殖活力)或5 000個/孔(用于測定存活率)的密度種植在96孔板中,培養(yǎng)1～2 d。PTE預(yù)處理后每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)。孵育4 h后去除培養(yǎng)基,每孔加入150 μL DMSO。在490 nm波長下測量光密度(optical density, OD)值。

1.2.4 細(xì)胞劃痕實驗 細(xì)胞用PTE預(yù)處理后接種于6 孔板中。當(dāng)細(xì)胞生長密度為80%時,用移液器吸頭尖端劃痕,PBS(pH值=7.4)小心洗去殘留的細(xì)胞碎片,再加入含2% FBS的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。同一位置在0、24、48 h 時間點進(jìn)行拍照以觀察細(xì)胞遷移情況。

1.2.5 細(xì)胞遷移實驗 采用Transwell實驗評估細(xì)胞遷移能力。將細(xì)胞(密度為1×105個/孔)用不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于Transwell裝置的上室中,下室用500 μL含10% FBS的DMEM填充,37 ℃下孵育18 h。孵育期結(jié)束后,將底膜完整剪切并用2.0% 結(jié)晶紫染色。顯微鏡下隨機(jī)選擇5個不同視野拍照并統(tǒng)計。

1.2.6 EdU細(xì)胞增殖實驗 使用Apolo488體外成像試劑盒進(jìn)行EdU細(xì)胞增殖檢測。用10 μmol/L的EdU試劑孵育Bel-7404和Hep3B細(xì)胞2 h,用4%多聚甲醛室溫固定30 min,再用 0.3% Triton X-100透化并配合EdU試劑染色。細(xì)胞核用5 μg/mL 的4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)染色10 min。在熒光顯微鏡下,計數(shù)5個隨機(jī)視野中EdU陽性細(xì)胞的數(shù)量并進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.2.7 免疫熒光染色 將Hep3B細(xì)胞以1×105個/孔密度接種在24孔板內(nèi)的玻璃蓋玻片上。過夜培養(yǎng)后,用PBS洗滌細(xì)胞3次,并在室溫下以4%多聚甲醛固定20 min。洗滌3次后,加入0.1% Triton X-100 室溫下靜置15 min。洗滌3次后,再加入5% BSA 37 ℃ 孵育30 min。加一抗在4 ℃下孵育16 h。復(fù)溫洗滌3 次后,再加入二抗37 ℃ 孵育 1 h。最后使用DAPI染細(xì)胞核,封片。采用Olympus FV10i-W共焦顯微鏡觀察并拍攝圖片。

1.2.8 Western-blot實驗 4 ℃條件下提取細(xì)胞蛋白,加入蛋白裂解液30 min后超聲碎裂細(xì)胞,離心(12 000×g,4 ℃,15 min)后轉(zhuǎn)移上清,測蛋白濃度。加入1/4體積的loading buffer,沸水浴10 min后自然冷卻。配置10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離蛋白,濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜,5% BSA中室溫下封閉1 h,后用相應(yīng)一抗4 ℃孵育過夜(GAPDH稀釋比例為1∶2 000,NOX4、NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β稀釋比例均為1∶1 000),洗滌后用相應(yīng)二抗(稀釋比例為1∶10 000)室溫下孵育1 h。最后用電化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯影,以GAPDH 作為對照內(nèi)參進(jìn)行半定量分析。

1.2.9 qRT-PCR實驗 加入1 mL TRIzol裂解細(xì)胞,提取總RNA。采用TakaRa Prime script RT reagent kit 進(jìn)行cDNA逆轉(zhuǎn)錄操作。采用TAKARA試劑盒及實時熒光定量PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR分析。使用2-△△Ct計算目的基因的相對表達(dá)量。引物序列如下：

NOX4：

正向TCCATTGAAAGCACTGTGTCG

反向CACATGCACGCCTGAGAAAA

GAPDH：

正向CTGCACCACCAACTGCTTAG

反向GTCTTCTGGGTGGCAGTGAT

1.2.10 H2O2檢測 收集貼壁細(xì)胞并裂解,離心收集上清液。向避光的96孔板每個孔中加入待測樣品或標(biāo)準(zhǔn)品50 μL,再加入H2O2檢測試劑100 μL,室溫條件下孵育30 min;孵育完成后用酶標(biāo)儀在560 nm波長條件下測定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出相應(yīng)樣品內(nèi)H2O2的濃度。

1.2.11 細(xì)胞活性氧(reactive oxygen species, ROS)檢測 消化貼壁細(xì)胞,800 r/min離心3 min,用PBS洗滌 2 次后重懸,將細(xì)胞密度調(diào)整為5×104mL-1。把細(xì)胞懸液依次加入96孔板內(nèi),每孔 100 μL,孵育過夜。裝載探針,使用無血清的DMEM培養(yǎng)基按1∶1 000的比例稀釋2′,7′-二氫二氯熒光素二乙酸酯(2,7-Dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA),直至終濃度為10 μmol/L。洗滌樣品2遍后,向每孔樣品中加入稀釋后的DCFH-DA工作液200 μL,37 ℃條件下孵育30 min。孵育完成再洗滌 3 次后行熒光檢測,采用酶標(biāo)儀檢測熒光值,在480 nm的激發(fā)波長和525 nm 的發(fā)射波長下定量DCFH-DA熒光。

1.2.12 ELISA法檢測IL-1β使用IL-1βELISA檢測試劑盒進(jìn)行檢測。裂解細(xì)胞后,離心收集上清液。在反應(yīng)板中每孔各加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100 μL,充分混勻后于37 ℃放置120 min。用洗滌液充分洗滌4～6 次后,再往每孔中加入一抗工作液100 μL充分混勻,37 ℃靜置60 min。每次洗板后,按先后順序分別往每孔加酶標(biāo)抗體工作液100 μL(37 ℃,30 min)、酶標(biāo)抗體工作液100 μL(37 ℃,30 min)和底物工作液100 μL(37 ℃暗處反應(yīng)15 min)。最后每孔加入100 μL終止液混勻,立即用酶標(biāo)儀在450 nm處測OD值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算相應(yīng)樣品內(nèi)IL-1β的實際濃度。

1.2.13 ELISA法檢測IL-18 使用IL-18 ELISA檢測試劑盒進(jìn)行檢測。裂解細(xì)胞后,離心收集上清液。在酶標(biāo)板中每孔各加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100 μL,37 ℃孵育90 min。棄去液體甩干后,每孔加入抗體工作液100 μL,37 ℃孵育60 min。洗板后,每孔再加入酶結(jié)合物工作液100 μL,37 ℃ 孵育30 min。再次洗板后,每孔加入底物溶液90 μL,37 ℃避光孵育15 min。最后每孔加入 50 μL 終止液混勻,立即用酶標(biāo)儀在450 nm處測OD值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算相應(yīng)樣品內(nèi)IL-18的實際濃度。

2 結(jié) 果

2.1 PTE對肝細(xì)胞和HCC生存能力的影響 采用MTT實驗測定PTE對正常人肝細(xì)胞系LO2和4種人HCC細(xì)胞系(Hep3B、HepG2、Bel-7402和Bel-7404)生存能力的影響。將細(xì)胞置于不同濃度的PTE或不同刺激時間下進(jìn)行培養(yǎng),可見PTE抑制Hep3B、HepG2、Bel-7402和Bel-7404細(xì)胞的生存能力,且有濃度依賴性。其中,50%有效抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)分別為(53.16±3.49)、(60.30±2.19)、(61.85±4.15)、(51.61±2.80) μmol/L。然而,在相同濃度或者相同刺激時間的PTE作用下,永生化人肝細(xì)胞LO2的存活率所受影響較小,IC50為(92.65±8.15) μmol/L。選取濃度為60 μmol/L的PTE進(jìn)行進(jìn)一步實驗,發(fā)現(xiàn)該濃度的PTE刺激可以有效抑制HCC細(xì)胞的生存能力,并呈明顯的時間依賴性。96 h 培養(yǎng)時間內(nèi),PTE對正常人肝細(xì)胞系LO2僅顯示出輕微的抑制作用(LO2組與 Hep3B、HepG2、Bel-7402和Bel-7404 組比較,差別有統(tǒng)計學(xué)意義,t值分別為3.43、2.85、3.01和3.45,P<0.01)。上述結(jié)果表明,在體外實驗中PTE能夠降低HCC細(xì)胞的生存能力(圖1A)。

PTE：紫檀芪;CCND1：周期蛋白-D1;MTT：3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽;DAPI：4′,6-二脒基-2-苯基吲哚;EdU：5-乙炔基-2′-脫氧尿苷。A：細(xì)胞存活率;B：MTT實驗;C：平板克隆實驗;D：EdU實驗;E：Western-blot實驗(PTE組：60 μmol/L濃度的PTE刺激48 h)。與0 μmol/L組或control組比較,△：P<0.05;與50 μmol/L組比較,#：P<0.05。

2.2 PTE對HCC增殖能力的影響 MTT實驗結(jié)果顯示,隨著PTE刺激濃度增加,Hep3B和Bel-7404 細(xì)胞增殖曲線逐漸趨于平緩(Hep3B細(xì)胞組間比較,F=9.02,P<0.01;Bel-740細(xì)胞組間比較,F=10.09,P<0.01),說明PTE可降低Hep3B和Bel-7404細(xì)胞的增殖速度且具有濃度依賴性(圖1B)。平板克隆形成實驗結(jié)果顯示,隨著PTE刺激濃度的增加,細(xì)胞集落形成數(shù)量呈明顯下降(Bel-7404細(xì)胞3組間比較,F=9.02,P<0.01;Hep3B細(xì)胞3組間比較,F=10.09,P<0.01,圖1C)。EdU細(xì)胞增殖實驗結(jié)果提示,PTE刺激后Hep3B和Bel-7404細(xì)胞增殖能力減弱,表現(xiàn)為S期細(xì)胞核紅色染色(陽性細(xì)胞數(shù))比例減少,與0 μmol/L組比較,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(Bel-7404細(xì)胞3組間比較,F=62.56,P<0.01;Hep3B細(xì)胞3組間比較,F=30.66,P<0.01,圖1D)。Western-blot實驗結(jié)果提示,PTE(60 μmol/L)刺激后Bel-7404和Hep3B細(xì)胞中CCND1蛋白水平下調(diào)(Bel-7404：t=5.09,P<0.01;Hep3B：t=9.21,P<0.01,圖1E)。以上體外實驗結(jié)果表明,PTE降低了HCC細(xì)胞的增殖能力。

2.3 PTE對HCC體外遷移能力的影響 采用不同濃度的PTE(50和60 μmol/L)刺激Bel-7404和Hep3B細(xì)胞48 h。細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果表明,與0 h組比較,48 h后PTE組的細(xì)胞遷移能力降低,并顯示出濃度依賴性。不同濃度PTE作用48 h后,與0 μmol/L組比較,Hep3B細(xì)胞殘余劃痕面積的差別均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);Bel-7404細(xì)胞殘余劃痕面積亦存在差別(P<0.01,圖2A)。Transwell實驗結(jié)果證實,Bel-7404和Hep3B細(xì)胞的遷移數(shù)目也被PTE抑制,并顯示出濃度依賴性(Bel-7404細(xì)胞組間比較,F=52.34,P<0.01;Hep3B細(xì)胞組間比較,F=39.28,P<0.01,圖2B)。Western-blot 實驗結(jié)果提示,PTE(60 μmol/L)刺激后Hep3B和Bel-7404細(xì)胞中的E-cadherin蛋白水平上調(diào)及N-cadherin 蛋白水平下調(diào)(圖2C)。以上體外實驗結(jié)果表明,PTE可以抑制HCC細(xì)胞的遷移能力。

PTE：紫檀芪;E-cadherin：E-鈣黏蛋白;N-cadherin：N-鈣黏蛋白;GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶。A：細(xì)胞劃痕實驗;B：Transwell 實驗;C：Western-blot實驗(PTE組：60 μmol/L濃度的PTE刺激48 h)。與0 μmol/L組或control組比較,△：P<0.05;與50 μmol/L組比較,#：P<0.05。

2.4 PTE對Hep3B細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 PTE能下調(diào)Hep3B細(xì)胞中H2O2的水平,具有明顯的劑量依賴性(F=105.02,P<0.01,圖3A)。PTE亦能下調(diào)Hep3B細(xì)胞中ROS的水平,該效應(yīng)同樣具有劑量依賴性(F=247.92,P<0.01,圖3B)。以上結(jié)果證實,PTE可以抑制Hep3B細(xì)胞中的氧化應(yīng)激水平。

PTE：紫檀芪;H2O2：過氧化氫;NAC：N-乙酰半胱氨酸;NOX4：尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4;GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶;DCFH-DA：2′,7′-二氫二氯熒光素二乙酸酯。A和C：過氧化氫濃度測定;B、D和G：ROS活性檢測;E：Western-blot實驗;F：qRT-PCR實驗測定NOX4的 mRNA表達(dá)水平。與0 μmol/L組或control組比較,△：P<0.05;與50 μmol/L組比較,#：P<0.05;與H2O2組比較,▲：P<0.05;與PTE組比較,◆：P<0.05;與VAS2870組比較,★：P<0.05。

給予經(jīng)典的ROS誘導(dǎo)劑H2O2(100 mmol/L)刺激2 h后,Hep3B細(xì)胞中的H2O2水平明顯升高,但這一變化可被PTE(60 μmol/L)所抑制(圖3C);其中,PTE組、H2O2組分別與control組比較,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(PTE組vscontrol組,t=15.04,P<0.01;H2O2組vscontrol組,t=7.89,P<0.01),PTE+H2O2組與PTE組比較,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.24,P<0.01)。PTE(60 μmol/L)與過氧化物抑制劑NAC的聯(lián)合應(yīng)用對ROS的抑制作用產(chǎn)生疊加效應(yīng)(PTE組vscontrol組,t=11.97,P<0.01;NAC組vs control組,t=21.21,P<0.01;PTE+NAC組vsPTE組,t=6.49,P<0.01)(圖3D)。

2.5 PTE對Hep3B細(xì)胞NOX4表達(dá)的影響 PTE刺激48 h后,Hep3B中細(xì)胞NOX4蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào),并呈現(xiàn)出劑量依賴性(F=323.40,P<0.01,圖3E)。同樣予PTE處理后,Hep3B中細(xì)胞NOX4 mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào),并呈現(xiàn)劑量依賴性(F=271.10,P<0.01,圖3F)。上述實驗結(jié)果表明,PTE對ROS的抑制作用可能與其調(diào)控NOX4相關(guān)。PTE和VAS2870的聯(lián)合應(yīng)用對ROS的抑制作用產(chǎn)生疊加效應(yīng)(圖3G)。以上結(jié)果表明,PTE對Hep3B細(xì)胞增殖和遷移能力的抑制,可能是通過下調(diào)細(xì)胞內(nèi)NOX4來源的ROS水平實現(xiàn)。

2.6 PTE對Hep3B細(xì)胞NLRP3炎癥小體活化的影響 PTE刺激48 h后,Hep3B細(xì)胞中NLRP3、ASC、Caspase-1(p10)和IL-1β的蛋白表達(dá)水平呈現(xiàn)出劑量依賴性下調(diào)(圖4A)。免疫熒光染色結(jié)果顯示,與control組比較,LPS組中NLRP3、ASC、Caspase-1(p10)和IL-1β表達(dá)明顯增多;而予PTE(60 μmol/L)處理后,LPS+PTE組中NLRP3、ASC、Caspase-1(p10)和IL-1β蛋白表達(dá)水平較LPS組下降。以上結(jié)果表明,LPS誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體復(fù)合物的組裝被PTE所抑制(圖4B)。

PTE：紫檀芪;H2O2：過氧化氫;LPS：脂多糖;NAC：N-乙酰半胱氨酸;IL-1β：白細(xì)胞介素1β;IL-18：白細(xì)胞介素18;NLRP3：核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)域樣受體蛋白3;ASC：凋亡相關(guān)的斑點樣蛋白;Caspase-1：含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1;Merge：融合;DAPI：4′,6-二脒基-2-苯基吲哚;GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶。A和C：Western-blot實驗測定NLRP3、ASC、Caspase-1(p10)和IL-1β的蛋白表達(dá)水平;B：NLRP3 炎癥小體組裝圖(細(xì)胞免疫熒光染色);D：IL-1β濃度測定;E：IL-18濃度測定。與0 μmol/L組或control組比較,△：P<0.05;與50 μmol/L 組比較,#：P<0.05;與LPS組比較,▲：P<0.05;與H2O2組比較,◆：P<0.05。

使用經(jīng)典的炎癥誘導(dǎo)因子LPS或ROS誘導(dǎo)劑H2O2刺激Hep3B細(xì)胞后,明顯上調(diào)NLRP3、ASC、Caspase-1(p10)和IL-1β的蛋白表達(dá)水平,但PTE干預(yù)后下調(diào)NLRP3、ASC、Caspase-1(p10)和IL-1β的表達(dá)水平(圖4C)。檢測Hep3B細(xì)胞中IL-1β和IL-18的水平：LPS或H2O2刺激Hep3B細(xì)胞后,明顯上調(diào)Hep3B細(xì)胞中IL-1β和IL-18水平,但PTE干預(yù)后下調(diào)了IL-1β和IL-18水平(圖4D、E)。上述結(jié)果證實,PTE可以抑制Hep3B細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的活化,并下調(diào)下游IL-1β和IL-18的表達(dá)水平。

2.7 PTE通過調(diào)控氧化應(yīng)激和NLRP3炎癥小體抑制HCC的增殖和遷移 MTT實驗結(jié)果提示,LPS或H2O2刺激后可明顯增強(qiáng)Hep3B細(xì)胞的增殖能力(control組vsLPS組,t=3.73,P=0.015;control 組vsH2O2組,t=2.69,P=0.035),而PTE干預(yù)后(60 μmol/L)可抵消上述刺激的變化(圖5A)。Transwell 實驗證實,LPS或H2O2刺激可明顯增強(qiáng)Hep3B細(xì)胞的遷移能力(control組vsLPS組,t=5.41,P<0.01;control組vsH2O2組,t=3.44,P=0.026),加入PTE干預(yù)后上述趨勢發(fā)生逆轉(zhuǎn)(圖5B)。上述結(jié)果再次驗證,PTE可通過抑制氧化應(yīng)激和NLRP3炎癥小體,從而抑制HCC的增殖與遷移能力(圖5C)。

PTE：紫檀芪;H2O2：過氧化氫;LPS：脂多糖;IL-1β：白細(xì)胞介素1β;IL-18：白細(xì)胞介素18;NLRP3：核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)域樣受體蛋白3;ASC：凋亡相關(guān)的斑點樣蛋白;Caspase-1：含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1;NOX4：尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4;ROS：細(xì)胞活性氧;MTT：3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽;HCC：肝細(xì)胞癌。A：MTT實驗;B：Transwell實驗;C：研究機(jī)制示意圖。與0 μmol/L組或control組比較,△：P<0.05;與LPS組比較,▲：P<0.05;與H2O2組比較,◆：P<0.05。

3 討 論

我國是肝癌高發(fā)地區(qū),每年全球約50%的新發(fā)肝癌病例發(fā)生在中國。此外,我國每年肝癌死亡病例數(shù)占全球的50%,且大多數(shù)HCC的患者被確診時通常已處于晚期[10]。中國HCC患者的 5 a 總生存率為12%,中位死亡時間為23個月[10]。目前臨床上對晚期HCC的治療手段有限且效果欠佳。既往文獻(xiàn)[3]也證實,PTE在人體內(nèi)毒性小,可以被迅速吸收且廣泛分布,具有較好的代謝穩(wěn)定性和生物利用度。本研究比較了4種HCC與正常肝細(xì)胞LO2在PTE刺激下存活率的差別,結(jié)果提示,在相同濃度和刺激時間下,PTE對于正常肝細(xì)胞僅有輕微毒性,從而間接證明了PTE治療的安全性,與既往的研究[3]結(jié)果一致。因此,PTE可以作為一種天然、安全和有效的肝癌治療輔助藥物。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),PTE可以有效抑制HCC細(xì)胞的增殖能力和集落形成能力。在多種腫瘤中,細(xì)胞周期蛋白CCND1的過度表達(dá)并伴隨細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases,CDK)活性的失調(diào),引發(fā)腫瘤細(xì)胞異常增殖[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn),PTE刺激后Hep3B和Bel-7404細(xì)胞中CCND1蛋白的表達(dá)明顯減少。此外,細(xì)胞劃痕實驗和Transwell 實驗結(jié)果均證實,PTE具有抑制HCC細(xì)胞遷移的作用。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)信號在腫瘤細(xì)胞遷移表型中起重要調(diào)控作用[13-14]。本研究證明,PTE刺激后HCC中EMT信號受到抑制,具體表現(xiàn)為E-cadherin的表達(dá)增加和N-cadherin的表達(dá)降低。綜上,PTE在體外能夠有效抑制HCC細(xì)胞的增殖和遷移。

氧化應(yīng)激系指體內(nèi)氧化和抗氧化這2個拮抗體系的失衡所引起的機(jī)體生化、生理過程異常。其中,ROS是最重要的氧化劑;在氧化應(yīng)激條件下,過量的ROS會激活各種轉(zhuǎn)錄因子,導(dǎo)致炎癥、腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和血管生成等[15]。研究[15]表明,ROS在肝癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制中發(fā)揮著雙重作用：一方面ROS可促進(jìn)DNA損傷,導(dǎo)致潛在致癌突變的發(fā)生;ROS還可以作為信號分子來驅(qū)動腫瘤細(xì)胞增殖、遷移,包括增強(qiáng)EMT、癌細(xì)胞的遷移和侵襲以及與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附作用;ROS能通過改變表觀遺傳調(diào)控促進(jìn)肝癌發(fā)生、發(fā)展;ROS還被證明在HCC細(xì)胞中激活TGF-β1/Smad3/Xct通路,增強(qiáng)肝癌的脂質(zhì)過氧化作用[16]。另一方面,過量的ROS增加氧化損傷、細(xì)胞衰老,增強(qiáng)ROS依賴性的死亡方式比如凋亡、焦亡和鐵死亡等,從而限制腫瘤的進(jìn)展[15]。本研究發(fā)現(xiàn),PTE抑制了Hep3B細(xì)胞中ROS和 H2O2水平;而用經(jīng)典的ROS誘導(dǎo)劑H2O2刺激Hep3B細(xì)胞后,細(xì)胞中的ROS水平升高,但這一變化可被PTE所抑制。PTE聯(lián)合過氧化物抑制劑NAC能夠進(jìn)一步下調(diào)細(xì)胞內(nèi)ROS和H2O2水平。

NOX是一類以生成活性氧類物質(zhì)為主要功能的蛋白復(fù)合體,NOX的多種蛋白亞基如NOX1、NOX2及NOX4等均參與HCC的發(fā)生、發(fā)展過程[17-19];其中,既往文獻(xiàn)[18-21]已證實NOX4的高表達(dá)與HCC的預(yù)后密切相關(guān),它能通過調(diào)控EMT、癌細(xì)胞死亡方式以及巨噬細(xì)胞分化等過程,參與HCC的發(fā)生、發(fā)展。因此,NOX4已經(jīng)成為抗腫瘤治療的一個重要靶點。生理狀態(tài)下,NOX4能持續(xù)產(chǎn)生低水平H2O2,且NOX4主要通過自身mRNA水平調(diào)節(jié)ROS生成;NOX4作為ROS的主要來源之一,病理狀態(tài)下NOX4過表達(dá)會引起ROS生成明顯增多,體內(nèi)氧化應(yīng)激平衡被打破[22]。在腫瘤微環(huán)境中,NOX4是能量代謝的感受器,當(dāng)線粒體ATP下降時,NOX4活性增強(qiáng),ROS產(chǎn)生增多,從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡被抑制[23]。本研究結(jié)果證實,PTE在體外實驗中顯著降低Hep3B細(xì)胞中NOX4轉(zhuǎn)錄和翻譯的表達(dá)水平;PTE與NOX4特異性阻斷劑VAS2870的聯(lián)合應(yīng)用對HCC中ROS和H2O2的抑制作用產(chǎn)生了疊加效應(yīng)。以上結(jié)果說明,PTE通過調(diào)控NOX4這個關(guān)鍵分子,影響Hep3B細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平,進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖和遷移能力。因此,可以推斷PTE對ROS的抑制作用與其下調(diào)NOX4的表達(dá)相關(guān),通過阻斷細(xì)胞內(nèi)NOX4來源的ROS生成是PTE抑制Hep3B細(xì)胞增殖、遷移作用的可能機(jī)制之一。

NLRP3炎癥小體復(fù)合物是目前結(jié)構(gòu)和功能最明確的一種炎癥小體,主要由模式識別受體NLRP3,銜接分子ASC和效應(yīng)分子前體Caspase-1組成[24]。炎癥小體能夠識別病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)或者內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式(damage associated molecular patterns,DAMPs),募集和激活促炎癥蛋白酶Caspase-1;活化的Caspase-1切割I(lǐng)L-1β和IL-18 的前體,產(chǎn)生成熟的IL-1β和IL-18,發(fā)揮促炎作用[24]。既往研究[25-27]已證實,NLRP3炎癥小體能介導(dǎo)各種促炎細(xì)胞因子分泌,與HCC的增殖、侵襲、血管生產(chǎn)和遷移等各個階段的進(jìn)展均有密切相關(guān)。ROS被認(rèn)為是驅(qū)動NLRP3炎癥小體活化的主要因素之一[24];ROS可以觸發(fā)NLRP3炎癥小體激活,進(jìn)而抑制癌細(xì)胞的增殖和遷移[6,25,28-29]。本研究發(fā)現(xiàn),PTE明顯下調(diào)了Hep3B細(xì)胞中NLRP3炎癥小體組分NLRP3、ASC和Caspase-1(p10)的表達(dá)水平,進(jìn)而抑制了炎癥小體的活化組裝。此外,使用經(jīng)典的炎癥誘導(dǎo)因子LPS或者ROS誘導(dǎo)劑H2O2刺激Hep3B細(xì)胞可以上調(diào)NLRP3炎癥小體組分的表達(dá),但這一效應(yīng)亦能被PTE所抑制。PTE對NLRP3炎癥小體的抑制作用也進(jìn)一步下調(diào)了其下游的IL-1β和IL-18分泌水平,從而抑制炎癥反應(yīng)。以上結(jié)果表明,PTE抑制ROS誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體激活,可能是PTE抑制Hep3B細(xì)胞增殖和遷移產(chǎn)生的分子機(jī)制之一。此外,核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB) 信號通路的激活被認(rèn)為是NLRP3炎癥小體活化啟動階段的重要標(biāo)志[24]。已有研究[30-31]報道,柴胡皂苷D及延齡草提取物可以通過ROS/NF-κB/NLRP3/GSDMD信號軸調(diào)控肺癌的增殖和遷移。同時,既往多數(shù)文獻(xiàn)[32-33]證實,PTE對NF-κB信號通路活化起到抑制作用,可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移;在肝癌中PTE對NF-κB 信號通路的作用值得進(jìn)一步深入探討。

本研究存在以下不足之處：PTE對NLRP3炎癥小體活化的具體機(jī)制缺乏進(jìn)一步探討,后續(xù)的研究將結(jié)合NF-κB信號通路進(jìn)行更深入的探討。同時,本研究缺乏PTE在體內(nèi)實驗方面抑制HCC增殖、遷移的相關(guān)數(shù)據(jù),在后續(xù)研究中可以采用原位種植方法在裸鼠肝包膜下接種熒光標(biāo)記的HCC,采用體外動態(tài)顯影方式追蹤細(xì)胞遷移情況。