徐子悟，朱政清，梁文萱，李 霞，李云耀，周穎倩，劉碧源，孟 蕾*

1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南大學，湖南 長沙 410012；3.湖南省人民醫(yī)院，湖南 長沙 410005；4.湖南交通工程學院，湖南 衡陽 421001

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是最常見的肝癌， 約占所有原發(fā)性肝臟惡性腫瘤的80%，其發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)均在增加[1]。 盡管目前在HCC 篩查和治療方面取得新進展，但大多數(shù)HCC 患者在診斷時仍處于晚期[2]。 因此，尋找一種新的靈敏且可靠的預后模型，準確預測患者生存率并合理指導治療方案至關(guān)重要。

氧化應激是HCC 發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵因素，參與HCC 的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移[3]。 目前，已有試驗將氧化應激生物標志物用于臨床治療HCC 和預測術(shù)后HCC 復發(fā)[4]。 研究表明，許多傳統(tǒng)中藥都含有抗氧化活性的成分，參與調(diào)節(jié)氧化應激[5]。 在現(xiàn)代臨床治療中，傳統(tǒng)中藥因其低毒性和良好的臨床療效，已被納入許多疾病的治療方案[6]。

本文擬構(gòu)建可以精確預測HCC 患者的氧化應激相關(guān)基因預后模型，并預測作用模型中樞基因的中藥單體成分，以期為治療HCC的靶向中藥研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集和預處理

從TCGA 數(shù)據(jù)庫（https://portal.gdc.cancer.gov）下載LIHC 隊列的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)、體細胞突變數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)。此外，在GEO 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）補充以GSE14520、GSE62232、GSE74656 HCC 患者轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)集。 氧化應激相關(guān)基因通過Genecards 數(shù)據(jù)庫檢索“氧化應激”，以相關(guān)評分≥7 分作為篩選條件獲得。

1.2 轉(zhuǎn)錄組差異分析

利用R 語言“DESeq2”包對TCGA-LIHC 原始Counts 數(shù)據(jù)進行差異分析。GEO 數(shù)據(jù)庫的GSE14520、GSE62232、GSE74656 使用“l(fā)imma”包分析差異表達基因。

1.3 氧化應激相關(guān)基因預后模型構(gòu)建

TCGA-LIHC 與GSE62165、GSE62452、GSE28735的共同差異基因（differential genes, DEGs）與獲得的1 399 個氧化應激相關(guān)基因取交集，獲得差異表達的氧化應激相關(guān)基因。 通過單/多變量Cox 回歸、Lasso 回歸分析預后特征基因。 通過生存分析和ROC 分析，以驗證模型可靠性。

1.4 免疫組織化學圖像分析

從人類蛋白質(zhì)圖譜（https://www.proteinatlas.org/）獲得人類健康組織和HCC 患者組織的免疫組織化學圖像，用于在蛋白質(zhì)水平上驗證。

1.5 功能相關(guān)中藥預測

通過Coremine Medical 數(shù)據(jù)庫（https://coremine.com/medical/），以P<0.05 作為篩選標準，預測對模型關(guān)鍵基因有潛在調(diào)控作用的中藥。藥物的性味、歸經(jīng)通過2020 版《中華人民共和國藥典》進行搜集。 使用TCMSP、HERB、ETCM、TCMID 數(shù)據(jù)庫檢索中藥成分，使用SwissADME（www.swissadme.ch）以MW<500、Hdon<5、Hacc<10、LogP<5 為篩選條件篩選中藥成分。 最終基于Autodock vina[7]軟件對篩選后的中藥成分進行分子對接。

1.6 中藥水提物制備

中藥材于80 ℃水中熬煮6 h，水提3 次。 提取液過濾，去除殘渣后，將提取液放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成浸膏，噴霧干燥獲得藥物干粉，用于后續(xù)實驗。

1.7 細胞培養(yǎng)及處理

用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)Hep3B 細胞，培養(yǎng)基每2～3 d 更換1 次。 當細胞匯合度約為90%時，用0.25%胰蛋白酶溶液進行傳代培養(yǎng)。

1.8 細胞活力評估

Hep3B 細胞以5×103個/孔接種于96 孔板，分別使用不同濃度馬錢子水提物和龍葵水提物（0、0.390 625、0.781 25、1.562 5、3.125、6.25、12.5、25、50、100 mg·mL-1）干預HepG2 細胞48 h 和72 h 后，每孔加入100 μL 10% MTT 溶液，4 h 后用酶標儀測定490 nm 處吸光度（A），計算細胞存活率。 細胞存活率=（A 加藥－A 空白）/A 空白×100%。

1.9 Westorn blot 檢測

使用IP 裂解緩沖液制備來自Hep3B 細胞系的全蛋白裂解物，然后進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白質(zhì)印跡。 所用抗體及其稀釋濃度如下：SLC7A11（1∶2 000）、β-Actin（1∶2 500）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號分別為AA128、AF7992）。

2 結(jié)果

2.1 HCC 患者基本信息

本研究數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)錄組來源TCGA 數(shù)據(jù)庫，TCGA臨床數(shù)據(jù)見表1。

表1 TCGA 列隊基線資料表

2.2 篩選差異氧化應激相關(guān)基因

對TCGA 數(shù)據(jù)庫和GSE14520、GSE62232、GSE-74656 數(shù)據(jù)集進行差異分析，分別有4 531、1 222、1 442 和972 個基因被鑒定為DEGs（圖1A—D）。4 個數(shù)據(jù)集共有356 個交集DEGs（圖1E），其中47 個基因被識別為氧化應激相關(guān)DEGs（圖1F）。

圖1 HCC 氧化應激相關(guān)基因鑒定

2.3 預測模型的構(gòu)建與評價

單變量Cox 回歸鑒定31 個預后相關(guān)基因（圖2A），Lasso 回歸篩選進一步篩選出7 個基因（圖2B—C）。 多變量Cox 回歸以SLC7A11（P=0.047）和EZH2（P=0.016）構(gòu)建預后相關(guān)基因模型（圖2D）。 ROC 曲線顯示模型可以靈敏地預測患者的生存狀況 （圖2E）。 高風險組相較低風險組平均生存年數(shù)更低（圖2F），生存率顯著低于低風險組（P<0.001）（圖2G）。

圖2 HCC 氧化應激相關(guān)關(guān)鍵基因患者預后模型及其預后效能

2.4 關(guān)鍵基因的生存分析與表達驗證

TCGA 和GEO 數(shù)據(jù)庫配對樣本數(shù)據(jù)集表明，EZH2 和SLC7A11 的表達在HCC 患者中均有顯著增加（P<0.001）（圖3A—B），并且與與預后相關(guān)（P<0.001）（圖3C—D）。為了進一步驗證，本研究團隊使用從Human Protein Atlas 公共數(shù)據(jù)庫獲得到肝癌患者組織和健康肝組織中IHC 圖像，可見肝癌組織中的EZH2 主要定位于細胞核內(nèi)，且蛋白表達增加（圖3E）。

圖3 關(guān)鍵HCC 氧化應激相關(guān)基因表達水平

2.5 相關(guān)中藥網(wǎng)絡和分子對接

通過Coremine Medical 醫(yī)學數(shù)據(jù)檢索到作用模型基因EZH2 中藥24 味，SLC7A11 潛在中藥9 味（表2）。 灰色底色為Affinity>-7.0，藍色底色為Affinity<-7.0，深藍色底色為中藥成分，紅色底色為關(guān)鍵基因的蛋白靶點（圖4A）。 對中藥進行性味、歸經(jīng)分析，大部分中藥具有性寒、味苦特點，肝經(jīng)為主要富集的經(jīng)絡（圖4B—D）。在對中藥成分與相應模型蛋白的對接結(jié)果中，丹參、白芷、馬錢子等中藥成分與模型蛋白有較好親和力（圖4E）。其中，龍葵的5'-甲氧基松脂素和馬錢子的馬錢子N-氧化物（brucine Noxide, BNO）Affinity<-10.0，分別作用SLC7A11 的247號丙氨酸和198 號賴氨酸（圖4F）。

圖4 HCC 氧化應激相關(guān)中藥成分網(wǎng)絡以及對接結(jié)果

表2 關(guān)鍵基因的中藥預測

2.6 關(guān)鍵藥物抑制Hep3B 細胞的增殖和SLC7A11蛋白表達

以梯度濃度龍葵和馬錢子水提液分別干預Hep3B 細胞，結(jié)果顯示藥物對Hep3B 細胞的抑制能力呈時間和劑量依賴性（圖5A）。以48 h 條件下藥物的1/2×IC50藥物濃度干預細胞后檢測SLC7A11 靶點表達情況顯示，龍葵和馬錢子水提液能夠抑制SLC7A11 蛋白的表達（圖5B）。

圖5 龍葵（LK）和馬錢子（MZQ）水提液對Hep3B 細胞增殖和SLC7A11 蛋白表達的影響

3 討論

HCC 是全球第三大致死癌癥類型，需要有效的治療和診斷策略來預防其發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移氧化應激顯著影響各種功能和過程，如細胞增殖、分化、血管生成和代謝，并與各種疾病的病理生理學有關(guān)[4]。肝臟是ROS 攻擊的主要器官，伴隨著過量的ROS，氧化應激和細胞代謝受損參與肝損傷的發(fā)生和發(fā)展[8]。 有研究證明，氧化應激會促進非酒精脂肪肝發(fā)生各類病理性變化，并將進一步促進肝癌發(fā)生[9]。

本文基于氧化應激相關(guān)基因成功地篩選出EZH2、SLC7A11，并以此構(gòu)建了HCC 中的氧化應激相關(guān)基因的預后模型，其有效性在Kaplan-Meier 曲線和時間依賴ROC 曲線得以證明，尤其是在第5 年時AUC 為0.650，說明該模型具有良好的預測能力。通過分析模型基因的表達情況，發(fā)現(xiàn)高表達EZH2或SLC7A11 的HCC 患者，其預后情況較差，這與目前研究一致[10]。中藥已經(jīng)發(fā)展了數(shù)千年，雖然中藥配方中的化學成分復雜，但中藥的這一特點與腫瘤的全系統(tǒng)、多靶點治療相適應[11]。本研究預測了預后模型中關(guān)鍵基因的潛在治療中藥。 BNO 是馬錢子在炮制過程中由毒性成分馬錢子堿轉(zhuǎn)化而來的一種特殊生物堿[12]，具有引發(fā)線粒體凋亡途徑誘導HCC 凋亡的功能[13]。而目前在癌癥治療方面尚無有關(guān)5'-甲氧基松脂素的研究。 本文研究中預測到馬錢子中的BNO 與SLC7A11 的賴氨酸具有很強的親和力。此外，作用模型關(guān)鍵基因的中藥主要富集于肝經(jīng)，性寒味苦也是歸肝經(jīng)中藥的特點[14]，表明在HCC 中EZH2和SLC7A11 積極的治療潛力。

研究進一步通過MTT 法檢測馬錢子以及龍葵水提物對Hep3B 肝癌細胞系增殖的影響，結(jié)果展示出細胞存活率隨著藥物濃度和處理時間的增加而下降，說明兩味中藥具有抑制Hep3B 細胞增殖的能力。此外，通過檢測細胞中SLC7A11 蛋白表達，發(fā)現(xiàn)在馬錢子以及龍葵水提物處理細胞后，Hep3B 細胞的SLC7A11 蛋白表達水平下降，說明兩位中藥能夠下調(diào)SLC7A11 水平。

EZH2 是一種組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，能三甲基化組蛋白H3 的27 位賴氨酸（H3K27me3）。EZH2 的活化有助于表觀遺傳轉(zhuǎn)錄沉默，而非突變表觀遺傳重編程已經(jīng)被認為是癌癥新的重要特征之一[15]。 EZH2可通過T 細胞功能障礙和T 細胞排斥促進腫瘤免疫逃逸[16]。 SLC7A11 是溶質(zhì)載體（Solute Carrier, SLC），屬于胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運蛋白，主要負責質(zhì)膜上氨基酸的轉(zhuǎn)運[17]。 SLC7A11 在鐵死亡中扮演著關(guān)鍵調(diào)控者的角色。 鐵死亡作為一種非凋亡性細胞死亡過程，已成為腫瘤治療的新靶向策略[18]。SLC7A11 還是作為控制Treg 細胞增殖潛能的關(guān)鍵決定因素[19]。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了一個基于氧化應激相關(guān)基因EZH2 和SLC7A11 的HCC 預后模型，該模型能夠敏感地預測患者的生存狀況。 此外，通過對模型相關(guān)基因的分析，本研究豐富了傳統(tǒng)中藥對于模型中關(guān)鍵基因治療的理解。 同時，模型中的關(guān)鍵基因在腫瘤治療方面也具有重要的研究價值，有望成為潛在的治療靶點。