王倩鈺,郭 嬡,王文強,凡思華,黃柳燕,張 強,王景濤

(1. 佳木斯大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007;2. 廣東石油化工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,廣東 茂名 525000)

秦皮素(fraxetin)是一種從中草藥秦皮中提取的天然香豆素化合物。目前研究表明,秦皮素具有多種藥理活性,如抗菌、抗炎、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)作用等[1～4]。人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)是人體內(nèi)最豐富的血漿蛋白,濃度達(dá)到40 mg/mL,約占血漿總蛋白的60%[5, 6]。HSA可與許多內(nèi)源性和外源性化合物結(jié)合,在藥物吸收、分布、排泄和代謝中發(fā)揮重要作用[7,8]。因此,研究秦皮素與HSA的相互作用,有助于深入認(rèn)識秦皮素在體內(nèi)轉(zhuǎn)運輸送的效率及其對HSA結(jié)構(gòu)和功能的影響,為明確其潛在的毒性作用提供依據(jù)。本研究應(yīng)用熒光光譜法,在模擬人體生理酸度(pH 7.4)下,研究秦皮素與HSA互作的特征,從分子水平上揭示二者結(jié)合的機(jī)制,為秦皮素的安全應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

HSA(北京索萊寶科技有限公司);秦皮素(純度≥99%,上海笛柏生物科技有限公司);8-苯胺-1-萘磺酸(ANS,純度96%,上海麥克林生化科技股份有限公司);布洛芬(純度≥98%,上海麥克林生化科技股份有限公司);華法林鈉(純度≥98%,上海麥克林生化科技股份有限公司);氯化血紅素(純度98%,上海麥克林生化科技股份有限公司);洋地黃苷(純度≥98%,上海麥克林生化科技股份有限公司);實驗中使用的其他試劑均為分析純。

1.2 樣品溶液的制備

采用PBS(pH 7.4)配置HSA,濃度為5×10-6mol/L。秦皮素溶解于二甲亞砜(DMSO),母液濃度為4×10-2molL-1。

1.3 熒光光譜測量

向1.0mL HSA(5×10-6mol/L)溶液中,連續(xù)滴加5×10-3mol L-1的秦皮素溶液,使其濃度保持在0～5×10-6mol/L。采用F97XP熒光分光光度計(上海,中國)測定含或不含秦皮素、十二烷基硫酸鈉(SDS)和尿素的HSA溶液的熒光光譜。激發(fā)波長為280 nm。發(fā)射掃描記錄范圍為200～500nm,掃描速度為1000nm/min。激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均固定在10nm。熒光測量分別在四種溫度(298 K、303 K、310 K、313K)下進(jìn)行。

1.3.1 熒光猝滅機(jī)理的測定

熒光猝滅是指由各種分子相互作用,如激發(fā)態(tài)反應(yīng)、能量轉(zhuǎn)移、基態(tài)復(fù)合物形成和碰撞猝滅,導(dǎo)致熒光團(tuán)的熒光量子產(chǎn)率降低。藥物分子可以通過動態(tài)或靜態(tài)猝滅機(jī)制與人HSA相互作用,通過使用下面的Stern-Volmer方程(方程①)可闡明熒光猝滅機(jī)制。

F0/F=1+Kq·τ0·Q=1+KSV·Q

①

其中F0和F分別代表沒有和有猝滅劑(秦皮素)時HSA的熒光強度,Kq是雙分子猝滅常數(shù),τ0是熒光團(tuán)在沒有猝滅劑(τ0=10-8s)的情況下的壽命,Q是猝滅劑的濃度,Ksv是動態(tài)猝滅常數(shù)。

1.3.2 表觀結(jié)合常數(shù)和位點數(shù)的測定

在靜態(tài)淬滅中,結(jié)合常數(shù)(K)和結(jié)合位點(n)可以根據(jù)雙對數(shù)方程②獲得。

lg[(F0-F)/F] = lgKa + n·lgQ

②

其中F0和F分別為有無秦皮素存在時的穩(wěn)態(tài)熒光強度,Ka為結(jié)合常數(shù),n為結(jié)合位點數(shù),Q為猝滅劑濃度。

1.3.3 表觀熱力學(xué)參數(shù)的測定

基于范特霍夫方程(方程③)和熱力學(xué)方程(方程④)計算了秦皮素與HSA相互作用的焓變化、自由能變化和熵變化。

ln Ka=H/(RT)+S/R

③

ΔG=RTlnKa=ΔH-TΔS

④

其中Ka是結(jié)合常數(shù),T是絕對溫度,R是氣體常數(shù)(8.314J/mol·K)。通常,小分子化合物和生物大分子之間存在四種代表性的相互作用力,即疏水力、氫鍵相互作用、范德華力和靜電相互作用。當(dāng)ΔH>0和ΔS>0時,主要的結(jié)合力是疏水相互作用。當(dāng)ΔH<0和ΔS<0時,主要的結(jié)合力是范德華或氫鍵相互作用。當(dāng)ΔH<0和ΔS>0時,結(jié)合過程中發(fā)生氫鍵和疏水相互作用。

1.4 同步熒光光譜學(xué)

互作體系與熒光光譜測量相同。激發(fā)波長和發(fā)射波長(Δλ)之間的差異穩(wěn)定在15nm或60nm,電壓為650V,激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均設(shè)置為5.0nm。

1.5 疏水探針

互作體系中HSA濃度為5.0×10-6mol/L,秦皮素/ANS濃度在5～45×10-6M之間變化,測定HSA熒光(ex=280 nm,em=340nm)。另一組互作體系中,將秦皮素加入到等摩爾濃度比的HSA-ANS(二者濃度為5.0×10-6mol/L)溶液中,秦皮素的濃度在5～45×10-6mol/L之間,測定ANS熒光(ex=370nm,em=465nm)。

2 結(jié)果

2.1 熒光猝滅分析

圖1A顯示,HSA溶液中秦皮素濃度逐漸增加時,HSA的熒光強度值逐漸降低,表明秦皮素對HSA具有熒光淬滅作用。在此過程中,HSA的最大發(fā)射熒光峰發(fā)生藍(lán)移,表明秦皮素與HSA結(jié)合形成了復(fù)合物,引起熒光光譜特征發(fā)生改變。由Stern-Volmer方程擬合得到的圖1B顯示,在秦皮素濃度5～45×10-6mol/L范圍內(nèi),F0/F與[D]線性關(guān)系良好,且由表1可知,各溫度下秦皮素對HSA熒光淬滅速率常數(shù)Kq均大于最大動態(tài)熒光淬滅速率常數(shù)2.0×1010L/mol·s,表明秦皮素對HSA熒光的淬滅作用是由復(fù)合物形成而引起,即靜態(tài)淬滅,這與熒光淬滅圖譜顯示結(jié)果(圖1A)相符。

表1 不同溫度下秦皮素與HSA作用的淬滅速率常數(shù)(Ksv)和雙分子猝滅速率常數(shù)(Kq)

A:不同濃度秦皮素對HSA熒光光譜影響;B:Stern-Volmer分析圖;C:雙對數(shù)分析圖。A作用溫度298K,B和C作用溫度298K、303K、310K和313K,HSA濃度為5μmol/L,秦皮素濃度為0、5、10、15、20、25、30、35、40μmol/L(從1到9)。

通過進(jìn)一步分析,以lg[(F0-F)/F]對應(yīng)lgQ作圖得到圖1C,由曲線的截距和斜率計算秦皮素與HSA作用的結(jié)合常數(shù)Ka及結(jié)合位點n。如表2所示,秦皮素與HSA的結(jié)合常數(shù)Ka隨溫度升高而增大,說明在一定程度上升高溫度能夠促進(jìn)二者結(jié)合。同時,結(jié)合位n隨溫度增加逐漸接近1,說明秦皮素與HSA結(jié)合的飽和位點個數(shù)為1。

表2 不同溫度下秦皮素與HSA相互作用的表觀結(jié)合常數(shù)(Ka)、結(jié)合位點(n)以及三個表觀熱力學(xué)參數(shù)

表2中,各溫度下秦皮素與HSA相互作用的自由能G值分別為-25.1、-26.5、-28.5和-29.4kJ/mol,表明二者相互作用是一個自發(fā)的非共價結(jié)合過程。同時,秦皮素與HSA相互作用的焓變ΔH和熵變ΔS均>0,表明在生理條件下,二者相互作用以疏水力為主。

2.2 同步熒光分析

秦皮素與HSA相互作用的同步熒光光譜分析結(jié)果如圖2所示。Δλ=15 nm和Δλ=60nm條件下,增加秦皮素濃度,均可引起HSA特征熒光吸收峰連續(xù)猝滅,并且表現(xiàn)藍(lán)移趨勢特征,進(jìn)一步驗證秦皮素與HSA主要通過疏水力產(chǎn)生相互作用。

A:Δλ=15 nm同步熒光光譜;B:Δλ=60nm同步熒光光譜。作用溫度298K,HSA濃度為5μmol/L,秦皮素濃度為0、5、10、15、20、25、30、35、40μmol/L(從1到9)。

2.3 三維熒光光譜分析

三維熒光光譜技術(shù)可以完整呈現(xiàn)樣品的熒光信息,能夠同時描述熒光強度隨激發(fā)和發(fā)射波長變化而出現(xiàn)的光譜信息。如圖3所示,HSA三維熒光光譜主要有Peak A和PeaK B兩個峰,Peak A(λex = 280 nm,λem= 340 nm左右)主要反映Trp和Tyr殘基的光譜特征。PeaK B是瑞利散射峰(λex = λem)。秦皮素與HSA共同存在時,Peak A相對熒光強度急劇下降,并出現(xiàn)新峰Peak 1(見圖3B),表明秦皮素與HSA相互作用改變了HSA的結(jié)構(gòu)、氨基酸殘基的微環(huán)境以及熒光發(fā)射峰強度。三維熒光光譜結(jié)果進(jìn)一步驗證了熒光光譜和同步熒光光譜的結(jié)果。

A:HSA(5μmol/L)三維熒光光譜;B:秦皮素(25μmol/L)+HSA(5μmol/L)三維熒光光譜。A和B作用溫度均為298 K。

2.4 疏水探針

熒光染料8-苯胺-1-萘磺酸(ANS)對微環(huán)境的變化敏感,可以檢測蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化。游離ANS表現(xiàn)出輕微或沒有熒光,當(dāng)與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域結(jié)合時,其熒光值顯著增高。以相對熒光強度(F/F0)對秦皮素濃度[Ligand]作圖,如圖4所示。隨著秦皮素逐步加入,ANS的相對熒光強度逐漸降低,表明秦皮素能夠與ANS競爭結(jié)合HSA的同一疏水區(qū)域。

圖4 秦皮素與HSA相互作用的疏水探針分析

3 討論

熒光光譜法可以分析蛋白質(zhì)中色氨酸殘基和酪氨酸殘基的微環(huán)境改變,具有用量少、損耗小和儀器靈敏度高、分析成本低的優(yōu)點[9]。如果某藥物能夠與蛋白質(zhì)相互作用,蛋白分子的內(nèi)源性熒光會發(fā)生猝滅,可以通過研究熒光猝滅機(jī)制獲得這一藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù),如結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)、焓變和熵變等[10],確定它們之間主要作用力類型,考察蛋白質(zhì)氨基酸殘基所處微環(huán)境和二級結(jié)構(gòu)的變化,探究分子間的相互作用形式及作用位點,從而為闡明藥物分子與蛋白質(zhì)之間的作用機(jī)理提供重要信息。

蛋白質(zhì)的熒光主要由Trp殘基,Tyr殘基以及Phe殘基的發(fā)色團(tuán)產(chǎn)生,其中Trp殘基和Tyr殘基在280nm處共同被激發(fā),在340nm處有一個特征發(fā)射峰[11]。在本研究中,秦皮素能夠淬滅HSA熒光,表明其很可能對疏水性Trp殘基和Tyr殘基具有影響。同時,秦皮素對HSA的熒光猝滅方式為靜態(tài)猝滅,其結(jié)合過程是自發(fā)放熱反應(yīng)。藥物與蛋白質(zhì)相互作用的兩個關(guān)鍵非共價作用力是氫鍵和疏水相互作用[12]。通過同步熒光光譜的掃描檢測可以得到特定熒光光色基團(tuán)的周圍微環(huán)境信息[13]。當(dāng)λem與λex的波長差Δλ=60nm時,同步熒光光譜法結(jié)果主要表現(xiàn)為色氨酸(Trp)殘基的光譜信息;當(dāng)激發(fā)和發(fā)射波長差Δλ=15nm時,表現(xiàn)為酪氨酸(Tyr)殘基的微環(huán)境光譜特性[14]。藥物與蛋白結(jié)合前后,最大發(fā)射波長的峰位變化可以反映出蛋白分子中發(fā)光基團(tuán)微環(huán)境的極性變化,峰位紅移說明氨基酸附近微環(huán)境極性增強,肽鏈伸展,結(jié)構(gòu)疏松;峰位藍(lán)移則表示發(fā)色基團(tuán)微環(huán)境極性減弱,疏水性增加[15]。秦皮素與HSA的同步熒光光譜如圖2所示,其中Δλ=60nm的猝滅程度明顯大于Δλ=15nm,這說明秦皮素與HSA分子中的Trp殘基結(jié)合程度更強,Trp殘基的光譜峰位置發(fā)生了明顯的藍(lán)移,也就是說隨著秦皮素的加入,氨基酸附近微環(huán)境極性減弱,疏水性增加。

綜上所述,本研究采用熒光光譜法證明了秦皮素能夠與HSA結(jié)合,并揭示了二者相互作用的分子特征及作用力。此項研究為闡明秦皮素在人體內(nèi)轉(zhuǎn)運及分布提供重要信息,也為今后秦皮素藥效學(xué)、藥代學(xué)以及毒理學(xué)研究提供參考。