魏麗娜，趙靜，羅倉學，劉娟，史長政

(陜西科技大學 食品與生物工程學院，陜西 西安,710021)

根皮素(phloretin)為具有二氫查爾酮結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物，具有多種生理活性。目前已探明的活性有抗氧化[1]、抑菌[2]、抑制腫瘤細胞增殖[3]、抑制酪氨酸酶活性[4]、抗炎[5]等活性，并且根皮素對人體安全無毒[6]，因此在食品、藥品、化妝品等領(lǐng)域中具有巨大的應(yīng)用前景。天然產(chǎn)物中根皮素大多以糖苷形式存在于蘋果樹體的根、莖、葉、樹皮、果實中，被看做是蘋果中的特征酚類物質(zhì)，可作為特征指紋用于蘋果汁的質(zhì)量控制和鑒偽[7]。目前研究發(fā)現(xiàn)，在多穗柯甜茶、荔枝果皮、海棠等植物中也發(fā)現(xiàn)了根皮素。人體攝入根皮苷后經(jīng)胃酸或葡萄糖苷酶水解生成根皮素，進入循環(huán)系統(tǒng)發(fā)揮藥效。研究者圍繞根皮素進行了大量的研究，但目前國內(nèi)外尚缺乏關(guān)于根皮素的綜述，本文較詳細地綜述了根皮素的制備、生物活性及結(jié)構(gòu)修飾研究現(xiàn)狀，以期為根皮素應(yīng)用及深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 根皮素的制備

1.1 天然產(chǎn)物中提取分離

從蘋果樹體及果皮中提取。法國化學家1835年就從蘋果樹皮中分離得到了根皮苷[8]，后來發(fā)現(xiàn)根皮素及根皮苷大量存在于蘋果樹的根皮、莖、嫩葉以及蘋果果實的各個部位[9]。采用有機溶劑(甲醇、乙醇等)從蘋果樹皮中進行提取，利用制備型高效液相色譜進行分離純化可得到根皮苷，通過酸(鹽酸或硫酸)水解可制得根皮素[10]。根皮苷在蘋果樹體各部位含量有所不同，其中蘋果樹皮含量最高，為64.32 mg/g，其次是樹葉含量40.30 mg/g，樹枝含量為30.43 mg/g[11]。從蘋果疏落果(幼果)中提取蘋果多酚，進而分離純化得到根皮苷，產(chǎn)品的得率為0.104%。純度可達97.52%[12]。在蘋果渣多酚類物質(zhì)中，主要成分為根皮苷、根皮素-低聚木糖苷、3-羥基根皮苷和3-羥基根皮素等[13]。一年中蘋果樹體根皮苷動態(tài)含量變化規(guī)律顯示，葉中根皮苷在9、10月含量最高，平均含量為16.31 mg/g，樹枝中根皮苷含量在6月最高，平均含量為11.93 mg/g，僅在蘋果葉中檢測到根皮素，5月份含量最高為2.541 mg/g[14]。研究發(fā)現(xiàn)蘋果品種對根皮素的含量也有較大影響[15]，用高效液相色譜-二極管陣列法測定不同蘋果品種果皮和果肉中的酚類化合物，結(jié)果表明，幾種蘋果果皮和果肉中根皮素衍生物含量均不相同，其在果皮中含量分別為：紅蘋果61～122 mg/kg，青蘋果29～31 mg/kg,金蘋果58～71 mg/kg；在果實中含量分別為：紅蘋果2～4 mg/kg,青蘋果7.00 mg/kg，金蘋果5～8 mg/kg。

從其他植物中提取。近年來，在其他植物中也提取分離得到了根皮苷及根皮素。采用微波輔助Ca(OH)2水溶液從多穗柯甜茶中提取多穗柯黃酮，提取物黃酮含量達到40%，其中根皮苷含量達到29.5%[16]。荔枝果皮中亦發(fā)現(xiàn)含有根皮苷，可采用乙醇溶液超聲波浸提法及熱回流法提取獲得[17]。

表1 自然界植物中根皮素及其衍生物結(jié)構(gòu)式Table 1 Phloretin derivatives described from nature plants

藏藥俄色葉(薔薇科蘋果屬植物變?nèi)~海棠及花葉海棠)中也分離得到了根皮苷及根皮素，俄色葉中根皮苷平均含量為22.11%，根皮素平均含量為0.51%[18]。采用超聲輔助甲醇提取山荊子(薔薇科蘋果屬)鮮葉、莖皮和果實中根皮苷的含量分別為(12.00±3.60)，(21.60±6.10)和(1.18±0.15)mg/g[19]。研究發(fā)現(xiàn)，杜梨葉中也含有豐富的根皮苷，且經(jīng)日曬夜露傳統(tǒng)制法的杜梨葉中根皮苷含量為1.01%，遠高于經(jīng)渥堆變紅后曬干的杜梨葉中根皮苷含量(0.41%)[20]。采用超聲輔助甲醇提取鎖陽中根皮苷，結(jié)果表明，11個不同產(chǎn)地鎖陽中均含有根皮苷，且內(nèi)蒙古巴盟鎖陽根皮苷含量最高，為0.046 mg/g[21]。據(jù)報道，在菊科萵苣；杜鵑花科馬醉木、越桔；豆科佛來明豆；殼斗科石櫟；百合科萱草、矮牽牛；石榴科石榴；薔薇科草莓、希爾特鳳梨、平邑藻及薔薇；虎耳草科；山礬科山礬；山茶科山茶；馬鞭草科過江天竺葵等植物中均含有根皮素及其衍生物[22]。

綜上所述，根皮素及其衍生物在多種植物中均存在，而以蘋果屬植物(Malusspecies)中含量最多，不僅蘋果樹體含有豐富的根皮素，且果實、果渣等均可作為提取根皮素的來源。在不同蘋果品種、樹體不同部位及不同生長時間，根皮苷及根皮素的含量均有不同?？捎梦⒉ɑ虺暡ㄝo助有機溶劑回流浸提法提取根皮苷，進而水解獲得根皮素；可應(yīng)用硅膠柱色譜、大孔吸附樹脂法、高效離心分配色譜(HPCCC)等對根皮苷(素)進行純化；酸、酶水解可以將根皮苷轉(zhuǎn)化為根皮素；薄層色譜、高效液相色譜、毛細管電泳法等色譜方法可以作為方便快捷的檢測方法。

1.2 化學法制備根皮素

由于根皮素在天然植物中的含量相對較低、提取成本高，因此研究人員嘗試以化學法進行半合成及全合成制備根皮素。

1.2.1 半合成制備

利用根皮苷經(jīng)酸(通常是鹽酸或硫酸)水解或酶(葡萄糖苷水解酶)水解制備根皮素如圖1所示。

圖1 根皮苷水解制備根皮素Fig.1 Preparation of phloretin from hydrolysis of phlorizin

柚皮苷經(jīng)兩步法制取根皮素[23]：柚皮苷廣泛存在于蕓香科葡萄柚、橘、橙的果皮和果肉中，自然界中含量較為豐富。以柚皮苷為原料，催化氫化反應(yīng)得柚皮苷二氫查爾酮，再在酸性條件下水解制得根皮素，反應(yīng)過程如圖2所示，此法可為根皮素的制備開辟新的途徑。

圖2 以柚皮苷為原料制備根皮素Fig.2 Preparation of phloretin from naringin

1.2.2 全合成制備

以間苯三酚、羥基苯丙酸為原料，在BF3·Et2O為催化劑的條件下合成根皮素[24]。合成路線如圖3所示。

圖3 由間苯三酚和對羥基苯丙酸制備根皮素Fig.3 Preparation of phloretin from phloroglucinol and hydroxyphenyl propionate

以2’-羥基-4’,6’-雙(甲氧甲氧基)苯乙酮和對甲氧基苯甲醛為原料經(jīng)羥醛縮合，催化氫化，脫羥基保護基得到根皮素[25]。合成路線如圖4所示。

圖4 由苯乙酮和對甲氧基苯甲醛制備根皮素Fig.4 Preparation of phloretin from acetophenone and methoxy benzene formaldehyde

以丙二酸二乙酯為原料，先合成中間物對甲氧基苯丙酸；通過?；磻?yīng)和酯化反應(yīng)，合成出目標中間體三對甲氧基丙酸均三酚酯；再以AlCl3為催化劑，硝基苯為溶劑，通過Fries重排反應(yīng)合成根皮素[26]。主要合成路線如圖5所示。

圖5 由丙二酸二乙酯為原料制備根皮素Fig.5 Preparation of phloretin from diethyl malonate

1.3 根皮素及根皮苷的生物合成

與其他合成方法相比，有關(guān)根皮素及根皮苷生物合成方法的相關(guān)研究報道目前還很少。有研究者用重組酶和植物蛋白提取物研究了根皮素及根皮苷的生物合成方法[27]。蘋果屬植物體內(nèi)根皮素的生物合成的2種前體物質(zhì)分別為：丙二酸單酰輔酶A(1)(Malonyl-CoA)、p-香豆酰-輔酶A(2)(p-coumaroyl-CoA)。合成途徑如圖6所示。

圖6 根皮苷及根皮素的生物合成Fig.6 Biosynthesis of phlorizin and phloretin

首先，對p-香豆酰-輔酶A (2)(p-coumaroyl-CoA)在還原型輔酶ⅱ(NADPH)的作用下生成p-二氫香豆酰輔酶A(4)(p-dihydrocoumaroyl-CoA)；丙二酰輔酶A(1)(Malonyl-CoA)和p-香豆酰-輔酶A(2)(p-coumaroyl-CoA)在查爾酮合成酶的作用下生成柚皮素查爾酮(3)(naringenin chalcone)進而生成黃酮類化合物(flavonoids)；而丙二酰輔酶A(1)(Malonyl-CoA)和p-二氫香豆酰輔酶A(4)(p-dihydrocoumaroyl-CoA)在查爾酮合成酶作用下生成根皮素(5)(phloretin)，進而在P2’GT及UDP-glucose(根皮素-2’-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶)作用下生成根皮苷(6)(phloridzin)[27]。研究發(fā)現(xiàn)烯酰還原酶類似基因ENRL-3和ENRL-5很有可能是促成根皮苷合成的關(guān)鍵基因[28]。

2 根皮素分子結(jié)構(gòu)修飾

分子結(jié)構(gòu)尤其是空間構(gòu)象是化合物生理活性的決定性因素。根皮素雖然生物活性卓著，但是由于其分子間形成“磚塵”結(jié)構(gòu)，分子間氫鍵作用力強，因此極難溶于水，根皮素在水中的溶解度僅為20 μg/mL。而藥物要發(fā)揮生理活性需要具備適當?shù)乃苄?，一般認為其水溶性應(yīng)該達到100 μg/mL[29]。極差的水溶性大大地制約了根皮素的應(yīng)用范圍?？蓪Ωに剡M行化學修飾以提高水溶性，使其更好發(fā)揮生物活性，拓展其應(yīng)用范圍。目前國內(nèi)外開展根皮素的化學修飾的研究較少，僅有的研究主要圍繞改善其水溶性，提高抗氧化活性等。方法主要包括醚化、縮合、酯化等。

2.1 酯化反應(yīng)

根皮素乙酰阿魏酸酯：阿魏酸和根皮素酯化合成根皮素乙酰阿魏酸酯，其抗氧化活性顯著優(yōu)于根皮素[30]。合成途徑如圖7所示。

圖7 根皮素乙酰阿魏酸酯的合成路線Fig.7 Synthesis of phloretin acetylferulic acid esters

2.2 縮合反應(yīng)

根皮素縮氨基硫脲類希夫堿：根皮素與氨基硫脲及其衍生物縮合得到縮氨基硫脲類席夫堿。根皮素縮氨基硫脲的水溶性比根皮素有較大提高；且抗氧化能力及抑制酪氨酸酶活性均比根皮素強[31]。合成途徑如圖8所示。

圖8 根皮素縮氨基硫脲類席夫堿的合成路線Fig.8 Synthesis of the phloretin thiosemicarbazones

根皮素腙類化合物：根皮素與異煙肼合成根皮素異煙?；?，結(jié)果表明根皮素異煙?；甑目寡趸钚燥@著優(yōu)于根皮素[32]。合成途徑如圖9所示。

圖9 根皮素異煙?；甑暮铣陕肪€Fig.9 Synthesis of phloretin isonicotinyl hydrazone

2.3 醚化修飾

通過引入親水集團，對天然產(chǎn)物分子進行修飾從而提高其水溶性，是藥物化學中的常用手段。本實驗室通過對根皮素分子與溴乙胺氫溴酸鹽進行醚化反應(yīng)[33]，對根皮素分子引入親水性集團乙胺基，合成途徑如圖10所示。研究表明，根皮素溶解度達到9 163 μg/mL，較根皮素提高了430倍，極大提高了水溶液中使用效果。同時對單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、熒光假單胞菌、鼠傷寒沙門氏菌都有較強的抑制作用，最小抑菌濃度可達到90、90、40、600、900、1 000 μg/mL。對DPPH、ABTS自由基具有較強的清除能力，對AAPH引發(fā)的pbr322質(zhì)粒損傷具有明顯的保護效果，IC50分別為78.00、48.20、230 μmol/L。這為根皮素在食品、藥品及化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

圖10 根皮素胺乙基醚的合成Fig.10 Synthesis of aminoethyl-phloretin

3 根皮素的生物活性及其作用機制

3.1 抗氧化活性

根皮素強抗氧化活性得益于其獨特的二氫查爾酮活性結(jié)構(gòu)，A環(huán)2′位及6′位的羥基對其抗氧化活性有重要的貢獻。測定根皮素、根皮苷、間苯二酚、間苯三酚等10種與根皮素結(jié)構(gòu)單元相近的化合物的抗氧化能力，發(fā)現(xiàn)根皮素的抗氧化特性取決于其結(jié)構(gòu)中獨特的2′,6′-二羥基苯乙酮結(jié)構(gòu)，而根皮苷由于其6′位羥基被葡萄糖苷基取代，因而抗氧化活性大大降低(較之根皮素降低了18倍)[34]。研究發(fā)現(xiàn)二氫查爾酮類化合物均比與其擁有相應(yīng)結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物具有更好的抗氧化活性。1H NMR分析發(fā)現(xiàn)，活性二氫查爾酮類化合物都擁有“時間平均”(time-average)的構(gòu)象，芳環(huán)A環(huán)和C骨架垂直正交，而沒有活性的二氫查爾酮化合物如2′-O-甲基根皮素，其分子中有強的酚羥基氫鍵作用，呈共面構(gòu)像；A環(huán)2′位的羥基，即黃酮骨架C環(huán)開環(huán)形成的羥基，是抗氧化活性重要的活性基團[35]。

3.2 抑菌活性

根皮素對細菌及植物病原真菌都有抑菌作用。根皮素對革蘭氏陽性菌的抑制作用明顯強于陰性菌。根皮苷對微生物同樣有抗菌性，其效果一般取決于物質(zhì)的濃度和微生物對該物質(zhì)的敏感性[36]。由于根皮苷抑制糖在腎臟部位的吸收，主要是發(fā)揮了腺苷酸參與的氧化磷酸化作用，因此，根皮素的抑菌作用可能是阻止了菌體細胞對磷的攝入[37]。根皮素對真菌也有抑制活性，對稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)引起的稻瘟病、馬鈴薯晚疫病菌(Phytophthorainfestans)引起的番茄晚疫病等9種植物病原菌都有抑菌作用[38]。根皮素可以抑制EscherichiacoliO157∶H7生物膜的形成，大大降低了E.coliO157∶H7對于人結(jié)腸上皮細胞的黏附性，轉(zhuǎn)錄組學研究發(fā)現(xiàn)，根皮素抑制了毒性表達基因hlyE和stx2及自引導前體基因lsrACDBF及csgA、csgB的表達，同時大大刺激了噬菌體基因的表達[39]。根皮素可降低金黃色葡萄球菌細胞代謝關(guān)鍵酶—乳酸脫氫酶(LDH)及異檸檬酸脫氫酶(IDH)的活性，抑制了金黃色葡萄球菌的能量代謝，從而起到抑菌作用[40]。

3.3 抑制腫瘤細胞增殖

根皮素對多種惡性腫瘤細胞增殖具有抑制作用。根皮素(0～100 mol/L)可顯著減少HT-29結(jié)腸癌細胞的存活數(shù)量并以劑量依賴的方式誘導細胞凋亡。根皮素能抑制ICAM-1蛋白和mRNA的表達，并且還能抑制單核細胞黏附炎性HaCaT細胞的能力[41]。根皮素可影響人肝癌細胞系SMMC-7721細胞形態(tài)分化，將細胞凋亡周期捕獲在G0-G1期，同時降低細胞線粒體跨膜電位，干擾細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，從而顯著地抑制了腫瘤細胞增殖。根皮素可抑制人乳腺癌細胞MCF10A增殖，通過JNK及p38促分裂原活化蛋白激酶信號傳導激活P53蛋白誘導乳腺癌細胞凋亡[42]。

3.4 抑制酪氨酸酶活性

根皮素具有顯著的抑制酪氨酸酶活性能力。根皮素對酪氨酸酶抑制率優(yōu)于曲酸和熊果苷[43]，與曲酸和熊果苷復配，抑制率可達到100%。構(gòu)效關(guān)系表明，對于查耳酮類化合物來說，芳環(huán)上羥基的位置對酪氨酸酶抑制活性影響最大；與A環(huán)相比較，B環(huán)被2′,4′-間苯二酚羥基取代對抑制活性有重要影響，A環(huán)和B環(huán)都被間苯二酚羥基取代，活性可以進一步增強。如2,4,2′,4′-四羥基查耳酮，其在A環(huán)的2位和4位，B環(huán)的2′位和4′位被羥基取代，是目前得到的活性最好的化合物[44]。由此可見，根皮素具有良好的抑制酪氨酸酶活性與其結(jié)構(gòu)中的4個酚羥基息息相關(guān)。

3.5 免疫抑制及抗炎

根皮素具有出色的免疫抑制及抗炎作用。在對脂多糖刺激小鼠巨噬細胞RAW264.7的研究中發(fā)現(xiàn)，根皮素能顯著抑制氧化氮，前列腺素E2、IL-6、TNF-α及iNOS和COX-2的水平，同時抑制NF-JB亞基p65蛋白的核轉(zhuǎn)位，而在MAPK途徑降低磷酸化，而根皮苷并沒有以上抑制作用。因此，根皮素可有效降低促炎癥因子在巨噬細胞RAW264.7中的水平而發(fā)揮抗炎作用[45]。在大鼠模型中，根皮素可抑制TNF-α誘導的結(jié)腸上皮細胞炎性反應(yīng)，從而改善大鼠結(jié)腸炎的炎癥。根皮素在體外對小鼠T淋巴細胞增殖、活化、周期和巨噬細胞NO釋放、吞噬功能均有影響，同時可抑制T淋巴細胞增殖及CD69和CD25的表達。根皮素作用下巨噬細胞的NO釋放量、吞噬率明顯下降，表明根皮素通過抑制巨噬細胞功能來發(fā)揮抗炎作用[46]。

3.6 心血管保護作用

根皮素具有明顯的心血管保護作用。對狗冠狀動脈舒張影響機制研究表明，根皮素在離體冠脈血管環(huán)的舒張效應(yīng)主要是通過抑制電壓依賴性鈣通道實現(xiàn)的，具有非內(nèi)皮依賴性的舒血管效應(yīng)。由于根皮素對血管具有直接作用，即可抑制VDCC[47]。根皮素可影響家兔離體主動脈收縮反應(yīng)，對于家兔離體主動脈收縮反應(yīng)具有直接的放松作用，根皮素能起到主動脈血管張力的調(diào)節(jié)作用，從而有利于血管保護。

3.7 細胞保護作用

根皮素對正常細胞具有保護作用。在丙烯醛毒性誘導實驗中，根皮素強烈抑制了FDP-lysine(一種典型的丙烯醛賴氨酸加合物)的形成，并且阻止了FDP-lysine其余的親電子集團。此外，根皮素可以直接捕獲丙烯醛，從而抑制羰基結(jié)合BSA及RNase A的寡聚化反應(yīng)；Western blotting結(jié)果表明，根皮素可以抑制神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞在丙烯醛誘導下細胞蛋白羰基化水平，并對LDH泄漏具有明顯的抑制作用。因此，根皮素在丙烯醛引起的人類疾病的預防和治療中有應(yīng)用價值[48]。根皮素是葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(GLUT1)的抑制劑，而GLUT1是葡萄糖通過血-視網(wǎng)膜屏障的唯一載體，因此，根皮素可通過抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白轉(zhuǎn)運葡萄糖進入視網(wǎng)膜，限制視網(wǎng)膜局部含糖量，從而對光感受器視桿細胞的功能和形態(tài)均產(chǎn)生保護作用，在預防糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)中具有應(yīng)用潛力[49]。

4 根皮素開發(fā)存在的問題及展望

根皮素具有廣泛的生物活性，在食品、醫(yī)藥及化妝品領(lǐng)域都有極強的市場前景。在食品領(lǐng)域，根皮素無論是作為功能性食品還是食品添加劑都具有巨大潛力。在食品安全形勢日益嚴峻的情況下，食品防腐劑安全問題也日益凸顯，當下市場上防腐劑主要為分為三類[50]：(1)有抑菌作用而對人體有一定的潛在危害，如化學防腐劑。(2)有抑菌作用而且對人體無害，如生物防腐劑乳酸鏈球菌素，溶菌酶等。(3)有抑菌作用，對人體非但無毒而且有益作用，如植物源天然產(chǎn)物類防腐劑。而根皮素符合第三種防腐劑的要求，具有極強抗氧化性、抑菌性和寬廣的抑菌譜，非但無毒且兼具對人體有益的生物活性，如將其開發(fā)為天然食品防腐劑，必將大有前景。同時，利用根皮素對酪氨酸酶極強的抑制能力，可將其開發(fā)為果蔬褐變保護劑加以利用。根皮素抑制癌細胞凋亡能力、抗炎及免疫抑制作用及心血管保護作用使其在臨床用藥方面有著巨大的應(yīng)用潛力。目前，根皮素以其極強的酪氨酸酶抑制能力，已經(jīng)作為新型天然美白劑在化妝品行業(yè)得以廣泛應(yīng)用,而根皮苷現(xiàn)已作為抗氧化劑被應(yīng)用于食品中。

現(xiàn)今，學者們圍繞根皮素開展了豐富的研究，但是根皮素的應(yīng)用仍然存在諸多問題，主要有：(1)根皮素水溶性極差，在食品，藥品領(lǐng)域應(yīng)用時存在嚴重問題；(2)根皮素抗癌、抗心血管疾病等生物活性仍缺乏實驗數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)的支持；根皮素抑菌機理仍需要進行深入探討。(3)根皮素的安全性及生物利用度有待于深入研究。

根據(jù)根皮素研究現(xiàn)狀，對于其開發(fā)主要應(yīng)關(guān)注以下幾個方面：(1)在正確認識其成分和結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，如何進一步提高根皮素功效和拓展其應(yīng)用范圍，是當前的研究熱點?；瘜W結(jié)構(gòu)修飾方法技術(shù)多樣，簡便可靠，但目前有實效的化學修飾方法的研究還不多，應(yīng)加強其化學修飾方面的研究，得到生理活性更強、實用價值更大的根皮素衍生物，同時注重對特殊功效修飾產(chǎn)物的開發(fā)。(2)通過對根皮素構(gòu)效關(guān)系研究，深入探討其抑菌、抑制腫瘤細胞增殖及抑制酪氨酸酶的機理，從而有針對性地進行防腐保鮮及果蔬制品防褐變產(chǎn)品開發(fā)。(3)開展體內(nèi)實驗研究，深入研究根皮素的生物利用度及在動物體內(nèi)的代謝。為其安全性評價提供支持。

總之，隨著各個學科交叉領(lǐng)域研究的不斷深入，根皮素在食品、藥品及化妝品領(lǐng)域中將會有巨大的應(yīng)用前景。