朱文豪, 劉天一, 何 川, 張曉宇, 辛 強, 王海峰

（吉林大學第一醫(yī)院神經(jīng)創(chuàng)傷外科，吉林 長春 130021）

目前普遍認為中樞神經(jīng)元在人出生后短時間便會失去再生能力，成人神經(jīng)細胞一旦受損死亡便無法更新［1］。研究［2］顯示：成年哺乳動物的側腦室下層和海馬齒狀回區(qū)仍可以不斷產(chǎn)生新的神經(jīng)干細胞（neural stem cells，NSCs），并且這種細胞可以通過遷移對損傷腦組織進行替代和修復。因此，基于神經(jīng)干細胞移植的治療方法成為研究熱點［3-5］。細胞療法通過在損傷處移植NSCs，實現(xiàn)外源性神經(jīng)替代。同時移植的NSCs 能夠釋放多種營養(yǎng)因子調(diào)節(jié)宿主微環(huán)境，促進神經(jīng)再生并減少繼發(fā)性損傷，限制宿主星形膠質(zhì)細胞活化以減少神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕形成［4，6-7］。研究［8-10］顯示：NSCs 在傳代培養(yǎng)后的活性受培養(yǎng)基成分、生長因子濃度、消化時長和吹打力度等方面的影響，但傳代的細胞密度和傳代時神經(jīng)球大小對NSCs 活性影響及其作用效果尚未完全闡明。本研究在原代培養(yǎng)NSCs 的基礎上，探討傳代的細胞密度和神經(jīng)球大小對神經(jīng)干細胞活性的影響，為優(yōu)化NSCs 的體外培養(yǎng)條件提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器孕12~14 d SPF級SD 大鼠，無特定病原體動物，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號： SCXK （京） 2021-0006。 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）、DMEM/F12 培養(yǎng)基、1%青-鏈霉素混合液、谷氨酰胺和非必需氨基酸（北京索萊寶科技有限公司），B27 神經(jīng)干細胞培養(yǎng)補充劑、Accutase 消化酶和鈣黃綠素Calcein-AM（美國Gibco 公司），表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）和堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor， bFGF） （美國Peprotech 公司），無血清細胞凍存液（蘇州新賽美生物科技有限公司），4%多聚甲醛溶液、兔抗鼠巢蛋白Nestin 抗體和A488 標記的山羊抗兔免疫球蛋白G （immunoglobulin G，IgG） 二抗（英國Abcam 公司）、碘化丙啶（propidium iodide，PI）和Hoechst 33342 （上海碧云天生物技術有限公司）。40 μm 和70 μm 無菌尼龍細胞濾網(wǎng)及CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司），激光共聚焦顯微鏡（日本尼康公司），正置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 胎鼠NSCs 原代培養(yǎng)胎鼠NSCs 原代分離培養(yǎng)方法參考相關文獻［9，11］并進行改良。采用DMEM/F12 培養(yǎng)基、20 μg·L－1EGF、20 μg·L－1bFGF、2% B27、1%青-鏈霉素、1%非必需氨基酸和1%谷氨酰胺配制NSCs 增殖培養(yǎng)基。取材應用的手術器械洗凈后高壓蒸汽滅菌，然后置于65 ℃烘箱中干燥備用。孕12~14 d SD 大鼠頸椎脫位法處死后采用75%酒精浸泡消毒20 min。將消毒后的大鼠置于相對潔凈的手術臺中剖腹，取出胚胎后轉(zhuǎn)移至無菌超凈臺中。去除胎膜，剪下胎鼠頭部后PBS 緩沖液洗凈置于冰上備用。以顯微彎鑷插入胎鼠眼眶處固定頭部，顯微剪沿大腦中線剪開新生的薄層顱骨，再用小彎鑷將胎鼠神經(jīng)節(jié)擠壓出，置于盛有PBS 緩沖液的培養(yǎng)皿中。將腦組織表面的雜質(zhì)洗凈，顯微鑷小心剝離腦組織表面的微血管。全部胚胎處理結束后，將收集的腦組織使用顯微剪剪碎，巴氏管吹打20~30 下，1 mL 移液槍吹打5~10下。將制得的懸液依次過40 μm 和70 μm 細胞篩網(wǎng)。收集細胞懸液于離心管中，1 500 r·min－1室溫離心5 min，加培養(yǎng)基重懸細胞并計數(shù)，以1~1.6×105·mL－1的細胞密度接種于T25 或T75 培養(yǎng)瓶中。取培養(yǎng)48~72 h 的細胞， 收集培養(yǎng)液1 500 r·min－1室溫離心5 min， 加入2 mL 的Accutase 消化酶并轉(zhuǎn)入3.5 cm 培養(yǎng)皿中，于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中消化5~10 min。每隔2 min 取出培養(yǎng)皿于光學顯微鏡下觀察細胞消化情況，直至NSCs 消化完全并均勻分散，加入4 mL 培養(yǎng)基終止消化。收集懸液1 500 r·min－1室溫離心5 min。傳代的細胞加培養(yǎng)基重懸、計數(shù)并接種細胞。凍存的細胞加入1 mL 無血清細胞凍存液，重懸后于－80 ℃冰箱凍存，長期保存需轉(zhuǎn)移至液氮。

1.3 巢蛋白免疫熒光染色鑒定NSCs多聚賴氨酸包被細胞爬片，將24 孔細胞爬片浸泡于多聚賴氨酸溶液中，5~10 min 后用PBS 緩沖液洗滌3 次，超凈臺中室溫晾干備用。取傳代后培養(yǎng)48 h 的NSCs，接種于預先包被多聚賴氨酸細胞爬片的24 孔細胞培養(yǎng)板中，孵育2 h 使細胞貼壁。于培養(yǎng)板中將爬片采用4%多聚甲醛溶液固定30 min 以上，PBS 緩沖液洗滌3 次。0.5% Triton X-100 溶液室溫打孔30 min，PBS 緩沖液洗滌3 次。5%牛血清白蛋白溶液室溫下封閉1 h 后，滴加兔抗鼠巢蛋白單克隆抗體（1∶100）孵育過夜。PBS 緩沖液洗滌3 次后加入A488 標記山羊抗兔二抗，室溫避光孵育2 h，PBS 緩沖液洗滌3 次。采用含DAPI 的抗熒光淬滅封片劑封片，正置熒光顯微鏡下觀察NSCs 并進行圖像采集。

1.4 神經(jīng)球直徑測定取培養(yǎng)第3 代的NSCs，以1.0×104、2.0×104、6.0×104、1.0×105、1.6×105和2.0×105mL－1的細胞密度接種于6 孔細胞培養(yǎng)板中，每孔2 mL 培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h 后形成神經(jīng)球。采用光學顯微鏡觀察神經(jīng)球形態(tài)表現(xiàn)并進行圖像采集。每個傳代密度重復3個復孔，每個孔內(nèi)選取隨機3個視野成像。采用Image J 1.47v軟件分析神經(jīng)球直徑。

1.5 活死細胞染色法檢測神經(jīng)球中NSCs 存活率取傳代后72 h 的神經(jīng)球，培養(yǎng)液中加入終濃度5 μmol·L－1鈣黃綠素AM、0.5 g·L－1PI 和5 mg·L－1Hoechst 33342，于室溫靜置10 min。采用倒置熒光顯微鏡觀察并調(diào)整焦距后對神經(jīng)球最大直徑視野進行圖像采集。采用Image J 1.47v 軟件分別對神經(jīng)球的直徑、該視野下總細胞面積和死細胞面積進行定量分析，計算細胞存活率。細胞存活率=（總細胞面積－死細胞面積）/總細胞面積×100%。

1.6 統(tǒng)計學分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，GraphPad Prism 8.0 軟件繪制圖像。各細胞傳代密度下神經(jīng)球直徑和細胞存活率均符合正態(tài)分布且方差齊，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 神經(jīng)球中NSCs 鑒定培養(yǎng)的NSCs 呈巢蛋白陽性，且直徑約40 μm 神經(jīng)球中心部分巢蛋白的表達量最高。有少量散在的單個細胞呈巢蛋白陽性，偶爾可見呈巢蛋白陰性的細胞，考慮是由于傳代過程中發(fā)生凋亡或貼壁后細胞迅速失去干性所導致的。因此，培養(yǎng)的細胞呈較強的巢蛋白表達，提示培養(yǎng)出的細胞為NSCs。見圖1。

圖1 巢蛋白抗體免疫熒光染色法鑒定神經(jīng)球中NSCsFig. 1 NSCs in neurospheres identificated by nestin antibody immunofluorescence staining method

2.2 傳代NSCs 形態(tài)表現(xiàn)傳代48 h 后NSCs 呈聚集生長趨勢，形成神經(jīng)球。細胞球大小不均一，直徑為76.41~306.79 μm，平均直徑為（152.72±47.52）μm。NSCs 生長方式呈牢固細胞間黏附聚集模式，球與球之間少有單獨的細胞散在。大部分NSCs 聚集呈圓球形或橢圓球形，也有部分因球與球之間的粘連呈串珠狀。神經(jīng)球中細胞間連接緊密且縫隙較小，形成緊密的球形結構。見圖2 和3。

圖2 倒置顯微鏡觀察NSCs 傳代培養(yǎng)48 h 后神經(jīng)球形態(tài)表現(xiàn)Fig. 2 Morphology of neurospheres after 48 h of subculture of NSCs observed by inverted microscope

圖3 共聚焦顯微鏡觀察活死細胞染色神經(jīng)球的形態(tài)表現(xiàn)(Bar=20 μm)Fig. 3 Morphology of neurospheres with live-death cell staining observed by confocal microscope(Bar=20 μm)

2.3 不同傳代密度神經(jīng)球直徑與2.0×104mL－1傳代密度（39.01 μm±12.37 μm） 比較，6.0×104mL－1和1.0×105mL－1傳代密度的神經(jīng)球直徑（61.99 μm±22.87 μm 和79.72 μm±25.31 μm）增加（P<0.05）；1.0×105mL－1、1.6×105mL－1（86.11 μm±30.00 μm）和2.0×105mL－1（79.69 μm±18.43 μm） 傳代密度的神經(jīng)球直徑比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖4。

圖4 光學顯微鏡觀察不同傳代密度神經(jīng)球直徑(Bar=200 μm)Fig. 4 Neurosphere diameters at different transmission densities observed by light microscope(Bar=200 μm)

2.4 不同直徑神經(jīng)球中NSCs 存活率0~40 μm（91.92%±9.69%）、 40~60 μm （87.25%±8.27%）、60~80 μm （78.98%±5.79%） 和80~100 μm 神經(jīng)球（80.24%±4.93%） 中NSCs 存活率比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與0~40 μm、60~80 μ m 和80~100 μ m 神經(jīng)球比較，100~200 μm 神經(jīng)球中 NSCs 存活率 （65.12%±5.20%）降低（P<0.05）。見圖5。

圖5 不同直徑神經(jīng)球中NSCs 活性(活死細胞染色，Bar=100 μm)Fig. 5 Activity of NSCs in neurospheres with different diameters(Live-dead cell staining，Bar=100 μm)

3 討 論

原代提取的NSCs 質(zhì)量受胎鼠的成熟度、干細胞提取分離方法和傳代擴增條件等多個方面的影響，其中首要影響因素為胎鼠發(fā)育情況［12］。研究［12-13］顯示：發(fā)育早期小鼠的螺旋神經(jīng)節(jié)較發(fā)育晚期小鼠含有更多的有絲分裂干細胞，同時在孕10.5~14.5 d 的大鼠宮內(nèi)提取的胎鼠NSCs 細胞活性增加并達到高峰，并于發(fā)育后期細胞活性逐漸減弱。因此，NSCs 原代提取的時機對于保持干細胞活性尤為關鍵。本研究結果顯示：采用孕11~14 d的胎鼠可獲得能夠穩(wěn)定快速擴增的NSCs，不足孕11 d 胎鼠提取NSCs過少且擴增效率低，超過孕14 d的胎鼠由于發(fā)育成熟度較高使獲取的NSCs 聚球和增殖活性較差。此外，在NSCs 提取分離過程中有效地分離出單細胞是提升NSCs 質(zhì)量的關鍵。研究［9］顯示：采用1 mL 槍頭反復吹打可以使腦組織迅速分散，但過度吹打易使細胞增殖活性減弱。本研究結果顯示：巴氏管吹打20~30 下后1 mL 移液槍吹打5~10 下的分離條件可以在不影響細胞活性前提下高效分離NSCs。

傳代的細胞密度較大程度上決定NSCs 的擴增效率，關于傳代密度的條件尚未完全統(tǒng)一。有學者［10-11，13-15］采用1×105mL－1和2×105mL－1的傳代密度培養(yǎng)5~7 d 消化傳代； 研究［16-17］采用5×105mL－1的傳代密度培養(yǎng)7 d 消化傳代；也有研究［18-19］采用1×106mL－1的傳代密度以機械切割分離球的方式傳代。NSCs 屬于聚團成簇生長類型細胞，細胞在生長過程中會不斷分泌營養(yǎng)物質(zhì)以保持自身生長的環(huán)境。因此，細胞傳代密度會較大地影響NSCs 的生長環(huán)境，過少的細胞會在培養(yǎng)過程中因自身營養(yǎng)物質(zhì)分泌不足而導致生長遲緩，過量的細胞則會因營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏而導致生長受限［20］。本研究結果顯示：當傳代密度大于1×105mL－1時，NSCs 神經(jīng)球直徑不再隨傳代密度的升高而增加。傳代密度過大時，由于過量細胞導致培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的競爭耗竭，可能出現(xiàn)神經(jīng)球形成速度減慢的現(xiàn)象。因此，以1×105mL－1的傳代密度進行培養(yǎng)是保持NSCs 活性的最佳傳代培養(yǎng)條件。

神經(jīng)球直徑是維持干細胞活性的重要方面。NSCs 呈聚集生長的狀態(tài)，細胞聚球之后，內(nèi)部的細胞與外界養(yǎng)分及氣體交換減弱，較大地影響了神經(jīng)球內(nèi)部細胞活性。隨著培養(yǎng)時間的延長，神經(jīng)球內(nèi)部缺乏氧氣和營養(yǎng)的細胞將大量死亡［9，11，16］。因此，傳代時神經(jīng)球的直徑直接決定了NSCs 的活性和培養(yǎng)效率。研究［16-17，21］顯示：直徑為100~150 μm、100~200 μm 或200 μm 的神經(jīng)球可進行細胞傳代。當神經(jīng)球直徑為150~200 μm 時，神經(jīng)球球心會出現(xiàn)大量壞死細胞［11］。本研究結果顯示：神經(jīng)球直徑大于100 μm 時，神經(jīng)球中心部位會出現(xiàn)細胞死亡的情況。因此，神經(jīng)球直徑為80~100 μm是傳代的最佳時機，既可以最大程度延長培養(yǎng)時間又不會出現(xiàn)明顯的細胞死亡。

綜上所述，胎鼠的孕期和腦組織吹打分離細胞的方式是高活性NSCs 原代提取的重要因素。傳代的細胞密度和傳代時機直接影響體外培養(yǎng)NSCs 的細胞活性。因此，選擇以1×105mL－1的傳代密度進行種板和傳代時神經(jīng)球直徑為80~100 μm，可以有效地提高NSCs 傳代培養(yǎng)效率和細胞活性。