文曉東, 王春玲, 蔣媛靜, 周欣梅, 張 藝, 伍 媛

（1. 廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院腦病一區(qū)，廣西 南寧 530011； 2. 廣西中醫(yī)藥大學藥學院藥理教研室，廣西 南寧 530200）

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是一種常見的慢性神經(jīng)退行性疾病，由黑質多巴胺能神經(jīng)元的進行性丟失引起，并產(chǎn)生運動癥狀和非運動癥狀［1］。研究［2］顯示：線粒體功能障礙會影響多巴胺能神經(jīng)元功能，干擾PD 相關通路的基因表達，導致細胞死亡，是PD 發(fā)病機制之一。線粒體自噬是細胞隔離并清除受損線粒體的主要方式，對細胞功能和生存維持至關重要［3］。研究［4］顯示：特發(fā)性PD 患者的線粒體自噬減少，刺激線粒體自噬以維持線粒體健康是延緩PD 患者神經(jīng)退行性過程的有效方法。

微小RNA （microRNA，miRNA） 作為神經(jīng)退行性疾病的調節(jié)因子，參與調控多種神經(jīng)性疾病的發(fā)生發(fā)展。其中，miR-145-3p 可靶向多發(fā)性骨髓瘤細胞中的組蛋白去乙?；? 觸發(fā)自噬過程，在唾液中還可作為PD 的輔助生物標記［5-6］。目前采用中草藥輔助治療的PD 患者占全部患者的25.7%~76.0%［7］。中草藥中的黃酮類成分可以保護細胞線粒體功能，避免結構損傷，保護PD 模型動物的神經(jīng)功能［8］。 烏梅總黃酮（fructus mume total flavone，F(xiàn)MF） 是烏梅主要有效成分，本課題組前期研究［9-10］顯示：FMF 可對多巴胺能毒素1-甲基-4- 苯基吡啶（dopaminergic toxin 1-methyl-4-phenylpyridinium，MPP＋） 誘導的SH-SY5Y 細胞損傷發(fā)揮保護作用，并證實FMF 可通過影響線粒體呼吸鏈酶復合物的活性防治PD。但FMF 靶向線粒體對MPP+誘導的SH-SY5Y 細胞損傷發(fā)揮保護作用的具體機制尚未完全闡明。因此，本研究構建PD 細胞模型，探討FMF 調控miR-145-3p 對MPP+誘導的SH-SY5Y 細胞損傷的保護作用，為深入研究PD 的發(fā)病機制和尋找新的治療靶點提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器SH-SY5Y 人神經(jīng)母細胞瘤購自中國科學院細胞庫。FMF 純度為95%（貨號13057-72-2，西安賽奧生物科技公司），MPP＋（貨號N137206，上海阿拉丁試劑有限公司），CCK-8、RIPA（強）組織細胞快速裂解液和BCA 蛋白濃度測定試劑盒（貨號CA1210、R0010和PC0020，北京索萊寶生物有限公司），Opti-MEM和胎牛血清（貨號31985-062 和10270-106， 美國Gibco 公司），Lipofectamine?RNAiMAX （貨號13778030， 美國Invitrogen 公司） Annexin Ⅴ-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒（貨號556547，美國BD公司），聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF） 和化學發(fā)光試劑（貨號IPVH00010 和WBKLS0500，美國Millipore 公司），醋酸鈾（西安鼎天化工公司），枸櫞酸鉛（貨號GA10701，北京中鏡科儀公司），兔抗Beclin-1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和 GAPDH 單克隆抗體 （ 貨號 PAB35215、PAB34124、 PAB30656 和 PAB36269， 武 漢Bioswamp 公司）。311 型CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司），AMR-100 型酶標儀（杭州奧盛儀器有限公司），DMIL LED 型倒置熒光顯微鏡（德國Leica 公司），NovoCyte 型流式細胞儀（天津艾森生物有限公司），Tanon-5200 型全自動化學發(fā)光分析儀（上海天能公司），mini protean3 cell 型電泳槽（美國BIO-RAD 公司），HT7700 型透射電鏡（日本日立公司）。

1.2 MPP+誘導SH-SY5Y 細胞損傷模型的構建調整SH-SY5Y 細胞懸液濃度，37 ℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)使細胞貼壁。將MPP＋稀釋為0、125、250、500、1 000 和2 000 μmol·L－1后處理細胞，繼續(xù)培養(yǎng)12、24 和48 h。每孔加入10 μL CCK-8 溶液，培養(yǎng)4 h，采用酶標儀于波長450 nm 處檢測吸光度（A）值。以A值代表SH-SY5Y 細胞增殖活性，A 值降低代表細胞增殖活性受損，SH-SY5Y細胞損傷模型構建成功。采用Graphpad Prism 9 軟件計算MMP+干預SH-SY5Y 細胞12，24 和48 h 的半抑制濃度（50% inhibiting concentration，IC50），計算細胞存活率。細胞存活率=（測量孔A 值－空白孔A值）/（對照孔A值－空白孔A值）×100%。

1.3 FMF 最佳作用時間和干預濃度將正常培養(yǎng)的SH-SY5Y 細胞分別給予0、0.031 25、0.062 50、0.125 00、0.250 00、0.500 00 和1.000 00 g·L－1FMF 干預處理，分別干預12、24和48 h，CCK-8 法檢測細胞增殖能力，以波長490 nm 處A 值變化情況確定FMF 最佳作用時間。 將正常培養(yǎng)的SH-SY5Y 細胞隨機分為正常培養(yǎng)組、MPP＋誘導組（500 μmol·L－1MPP＋作用24 h） 和MPP＋+不同劑量FMF 組（500 μmol·L－1MPP＋作用24 h+0.125 00、0.250 00、0.500 00 和1.000 00 g·L－1FMF 干預24 h）。采用CCK-8 法檢測各組細胞增殖能力，與MPP＋誘導組比較，以波長490 nm處A 值增加最明顯的FMF 作用濃度為FMF 最佳干預濃度。

1.4 細胞分組和CCK-8 法檢測各組細胞增殖能力根據(jù)miR-145-3p基因序列設計合成miR-145-3p引物，將目的片段與載體重組獲得重組質粒，并將miR-145-3p 的mimics 及對應的NC 質粒轉入MPP＋誘導的PD 細胞模型中。將細胞分為對照組（未經(jīng)處理）、模型組（500 μmol·L－1MPP＋作用24 h）、MPP＋+mimics 組（轉染miR-145-3p mimics）、MPP＋+NC 組（轉染miR-145-3p NC）、MPP＋+FMF 組（0.25 g·L－1FMF 作用24 h）、MPP＋+mimics+FMF 組 （ 轉染 miR-145-3p mimics 后0.25 g·L－1FMF 作用24 h） 和MPP＋+NC+FMF組（轉染miR-145-3p NC 后0.25 g·L－1FMF 作用24 h）。除對照組外，其余各組均經(jīng)500 μmol·L－1MPP＋作用SH-SY5Y 細胞24 h 后再進行相應處理。加入CCK-8 試劑，檢測各組細胞于波長490 nm 處A 值，以A（490）值代表各組細胞增殖能力。

1.5 AnnexinⅤ-FITC/PI 染色法檢測各組細胞凋亡率收集各組細胞調整濃度，取1×106個細胞，400 g、4 ℃離心5 min，棄上清。加入預冷的PBS緩沖液與細胞混勻，再次離心。細胞重懸，加入10 μL AnnexinⅤ-FITC 和PI，輕輕混勻，4 ℃避光孵育30 min 后加入PBS 緩沖液，流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。細胞凋亡率=（早期凋亡細胞數(shù)+晚期凋亡細胞數(shù)）/細胞總數(shù)×100%。

1.6 透射電鏡觀察各組細胞中線粒體自噬超微結構表現(xiàn)收集各組細胞，經(jīng)戊二醛和鋨酸固定，丙酮和環(huán)氧樹脂浸透，采用特制的塑料包埋板加入包埋劑，置入聚合包埋箱聚合。去除組織周圍的包埋介質，半薄切片后移至滴加0.5%甲苯胺藍染色液的載玻片上，染色后切片。醋酸鈾避光染色、水洗，再用枸櫞酸鉛避光染色、水洗、濾紙吸干，于透射電鏡下觀察并拍照。

1.7 實時熒光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR， RT-qPCR）法檢測各組細胞中miR-145-3p 表達水平TRIzol 法提取各組細胞總RNA，逆轉錄獲得cDNA，進行擴增。反應條件：95 ℃預變性3 min，擴增95 ℃、5 s，56 ℃、10 s，72 ℃、25 s，共40 個循環(huán)，最后65 ℃~95 ℃制備熔解曲線。引物序列為miR-145-3p F：5′-GGGGTCCAGTTTTCCC-3′，miR-145-3p R：5′-CTGGTGTCGTGGAGTCGG-3′；U6 F：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′； U6 R： 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。以U6 為內(nèi)參，采用2－ΔΔCt法計算各組細胞中miR-145-3p 表達水平。

1.8 Western blotting 法檢測各組細胞中Beclin-1蛋白表達水平和LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ比值將細胞組織剪碎，加入強裂解液，勻漿直至完全裂解。離心電泳后濕法轉膜，加入5%的脫脂奶粉室溫封閉4 ℃過夜。根據(jù)說明書稀釋一抗（1∶1 000），與膜室溫孵育1 h。PBST 緩沖液洗滌后，加入HRP 標記的二抗（1∶2 000），與膜室溫孵育1 h。ECL 發(fā)光液充分與膜接觸后，全自動化學發(fā)光分析儀分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH 為內(nèi)參，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1.9 統(tǒng)計學分析采用GraphPad Prism 9.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。FMF 最佳干預濃度、細胞增殖能力、細胞凋亡率、各組細胞中miR-145-3p表達水平和Beclin-1蛋白表達水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用Student’st檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 MPP+誘導SH-SY5Y 細胞損傷的最佳作用濃度和時間不同濃度的MPP＋作用SH-SY5Y 細胞后，細胞增殖能力明顯降低（P<0.01），提示PD細胞模型構建成功，且細胞增殖能力降低呈作用濃度和作用時間依賴性。干預12、24 和48 h， MPP＋誘導SH-SY5Y細胞IC50值分別為（986.23±42.53）、（550.93±13.97）和（358.30±21.57）μmol·L－1，500 μmol·L－1MPP＋干預24 h 作用效果最佳，此時細胞存活率為（53.67±0.64）%。見圖1。

圖1 MPP＋作用濃度和時間Fig. 1 Concentration and duration of MPP+ action

2.2 FMF最佳干預濃度和作用時間0、0.031 25、0.062 50、0.125 00 和0.250 00 g·L－1FMF 對SH-SY5Y 細胞增殖能力無明顯影響；0.500 00 和1.000 00 g·L－1FMF 對SH-SY5Y 細胞增殖能力影響較小。與正常培養(yǎng)組比較，MPP＋誘導組細胞增殖能力明顯降低（P<0.01）。與MPP＋誘導組比較，MPP＋+不同劑量FMF 組細胞增殖能力均明顯升高（P<0.01）， 且MPP＋+0.250 00 g·L－1FMF 組細胞增殖能力升高最明顯。因此，F(xiàn)MF最佳干預濃度為0.250 00 g·L－1，最佳干預時間為24 h。見圖2。

圖2 不同作用時間（A）和干預濃度（B）FMF 作用后各組細胞增殖能力Fig. 2 Proliferation abilities of cells in various groups after treated with FMF for different time (A) and different intervention concentrations (B) of FMF

2.3 各組細胞增殖能力與對照組比較，模型組細胞增殖能力明顯降低（P<0.01）。與模型組比較，MPP＋+mimics 組和MPP＋+FMF 組細胞增殖能力均明顯升高（P<0.01）。與MPP＋+FMF 組比較，MPP＋+mimics+FMF 組細胞增殖能力明顯升高（P<0.01）。見圖3。

圖3 各組細胞增殖能力Fig. 3 Proliferation abilities of cells in various groups

2.4 各組細胞凋亡率與對照組比較，模型組細胞凋亡率明顯升高（P<0.01）。與模型組比較，MPP＋+mimics 組和MPP＋+FMF 組細胞凋亡率均明顯降低（P<0.01）。與MPP＋+FMF 組比較，MPP＋+mimics+FMF組細胞凋亡率明顯降低（P<0.01）。見圖4 和5。

圖4 AnnexinⅤ-FITC/PI 染色法檢測各組細胞凋亡率Fig. 4 Apoptotic rates of cells in various groups detected by AnnexinV-FITC/PI staining method

圖5 各組細胞凋亡率Fig. 5 Apoptotic rates of cells in various groups

2.5 各組細胞線粒體自噬超微結構表現(xiàn)對照組細胞線粒體形態(tài)均勻，結構完整；模型組細胞線粒體體積變大，結構不規(guī)則，出現(xiàn)空化現(xiàn)象。與模型組比較，MPP＋+mimics 組和MPP＋+FMF 組細胞線粒體結構改善，自噬小體數(shù)量增加。與MPP＋+FMF 組比較，MPP＋+mimics+FMF 組細胞線粒體結構較為完整，自噬小體數(shù)量進一步增加。見圖6。

圖6 透射電鏡觀察各組細胞中線粒體自噬超微結構表現(xiàn)（×12 000）Fig. 6 Ultrastructural morphology of mitochondrial autophagy in cells in various groups observed under transmission electron microscope(×12 000)

2.6 各組細胞中miR-145-3p 表達水平與對照組比較，模型組細胞中miR-145-3p 表達水平明顯降低（P<0.01）。與模型組比較，MPP＋+mimics 組和MPP＋+FMF 組細胞中miR-145-3p 表達水平均明顯升高（P<0.01）。與MPP＋+FMF 組比較，MPP＋+mimics+FMF 組細胞中miR-145-3p 表達水平明顯升高（P<0.01）。見圖7。

圖7 RT-qPCR 法檢測各組細胞中miR-145-3p 表達水平Fig. 7 Expression levels of miR-145-3p in cells in various groups detected by RT-qPCR method

2.7 各組細胞中Beclin-1 蛋白表達水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值與對照組比較，模型組細胞中Beclin-1 蛋白表達水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均降低（P<0.05）。與模型組比較，MPP＋+mimics 組和MPP＋+FMF 組細胞中Beclin-1 蛋白表達水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明顯升高（P<0.01）。與MPP＋+FMF 組比較，MPP＋+mimics+FMF 組細胞中Beclin-1 蛋白表達水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明顯升高（P<0.01）。見圖8。

圖8 Western blotting 法檢測各組細胞中Beclin-1 蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值（C）Fig. 8 Electrophoregram(A) and histograms(B) of expression of Beclin-1 protein and ratios of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ(C) in cells in various groups detected by Western blotting method

3 討 論

全球約2%的60 歲以上人群受PD 影響，引發(fā)快速眼動睡眠行為障礙、嗅覺減退、便秘、特征性運動困難和心理或認知問題，對患者日常生活造成較大負擔。但目前PD 的發(fā)病機制尚未完全闡明。研究［11-12］顯示：MPP+結構類似于百草枯神經(jīng)毒劑，會損害黑質紋狀體系統(tǒng)的多巴胺能神經(jīng)元，其積聚于線粒體中抑制線粒體復合物Ⅰ活性，導致腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）合成不足，線粒體膜極性喪失，線粒體損傷嚴重。MPP+造成線粒體功能障礙，使線粒體突變并導致其功能和裂變?nèi)诤蠙C制及中樞神經(jīng)系統(tǒng)退化，是PD 發(fā)生的主要誘因［13］。本研究結果顯示：MPP+干預SH-SY5Y 細胞后，SH-SY5Y 細胞的增殖能力、自噬小體數(shù)量和線粒體自噬相關蛋白Beclin-1蛋白表達水平及LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值明顯低于正常培養(yǎng)的細胞，表明MPP+造成SH-SY5Y 細胞線粒體自噬損傷，并導致SH-SY5Y 細胞異常凋亡。

在神經(jīng)退行性疾病中，線粒體參與ATP 產(chǎn)生、Ca2+穩(wěn)態(tài)和神經(jīng)遞質代謝，維持神經(jīng)元穩(wěn)態(tài)［14］。作為清除細胞受損線粒體的主要手段，線粒體自噬對于細胞功能和生存至關重要［15］。XU 等［16］發(fā)現(xiàn)：肉桂苷A 可降低MPP+誘導的神經(jīng)元和線粒體膜電位降低并促進自噬體激活，加速受損線粒體降解，減少氧化應激，保護PD 多巴胺能神經(jīng)元。因此，靶向SH-SY5Y 細胞線粒體自噬損傷在PD 治療中具有關鍵作用。PD 治療多以西藥為主，但西藥的不良反應對其治療效果影響較大。類黃酮可激活靶向線粒體功能障礙并誘導神經(jīng)營養(yǎng)因子的抗凋亡途徑，進而表現(xiàn)神經(jīng)保護作用，是預防PD 的天然產(chǎn)物［17］。烏梅中黃酮含量豐富，其可誘導癌癥細胞凋亡，發(fā)揮抗炎和抗癌作用［18］。本研究結果顯示：FMF 干預SH-SY5Y 細胞損傷模型后，細胞增殖能力恢復，線粒體自噬小體數(shù)量和自噬相關蛋白Beclin-1 蛋白表達水平及LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值均升高，細胞凋亡率降低。在線粒體自噬過程中，內(nèi)質網(wǎng)膜包裹受損的線粒體形成自噬體，隨后將LC3 Ⅰ蛋白修飾為LC3 Ⅱ蛋白，促進其與溶酶體融合，線粒體自噬作用增強時，自噬標志物LC3 Ⅱ和Beclin-1 蛋白表達均上調［19］。因此，本研究結果進一步證實FMF 可抑制MPP+誘導的SH-SY5Y 細胞凋亡，促進自噬，減輕線粒體損傷。

研究［20-21］顯示： miR-145-5p 和miR-145-3p 是新的miRNA 分子，參與調控細胞侵襲、轉移、增殖和凋亡等過程，在多種病理和生理過程中發(fā)揮重要作用。LIU 等［22］研究表明：在腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）介導的炎癥損傷中，下調miR-145 表達可逆轉對線粒體活性的抑制，增加SH-SY5Y 細胞存活率。miR-145 表達上調可促進SH-SY5Y 細胞自噬，沉默miR-145 能夠逆轉SH-SY5Y 細胞自噬的促進作用［20-21］。本研究結果顯示：miR-145-3p 在MPP＋誘導PD 細胞模型中表達下調，F(xiàn)MF干預后表達明顯上調，SH-SY5Y細胞增殖能力增強，線粒體自噬小體數(shù)量和自噬相關蛋白Beclin-1 蛋白表達水平及LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值均升高，細胞凋亡率降低。FMF 與miR-145-3p mimics 協(xié)同作用時，細胞增殖和自噬能力增加，細胞凋亡率降低。FMF 可上調miR-145-3p 表達，促進受損線粒體自噬作用，從而增強對MPP＋誘導損傷的SH-SY5Y 細胞的保護作用。

綜上所述，F(xiàn)MF 可通過調控miR-145-3p 抑制線粒體功能障礙，明顯減輕MPP+誘導的SH-SY5Y細胞損傷，本文結果為深入研究PD 的發(fā)病機制及尋找新的治療靶點提供了參考。