周秀玲, 叢德毓, 張 野, 張紅石

（1. 長春中醫(yī)藥大學(xué)護理學(xué)院，吉林 長春 130117；2. 吉林省中醫(yī)院推拿科，吉林 長春 130021）

缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS） 是常見的腦血管疾病，其發(fā)病率占全部腦卒中患者的60%~80%［1］。IS 的發(fā)病機制較為復(fù)雜，主要是由于腦血管栓塞導(dǎo)致血氧供應(yīng)不足進而引起腦組織缺血性損傷，導(dǎo)致行為和感知等功能的缺損及障礙。腦血管內(nèi)皮細胞凋亡和重構(gòu)在IS 發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，而缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor，HIF）-1α 是上游通路中的關(guān)鍵因子［2］。

頭部針刺是基于《靈樞經(jīng)》中“頭有氣街”的理論，采用頭部針刺的方法對IS 進行治療?！敖帧笔侵溉梭w各部位中氣血聚集和通行的道路，也可稱為“氣街”，人體的胸、腹、頭和脛皆有氣街，因此《靈樞經(jīng)》 動輸篇中有“四街者，氣之路徑也”［3］。頭部的氣血與身體各經(jīng)脈有密切關(guān)聯(lián)，《靈樞經(jīng)》邪氣臟腑病形篇中記載“十二經(jīng)脈，三百六十五絡(luò)，其氣血皆上行于面而走空竅”，表明人體頭部氣血的正常運行與身體各項機能有密切關(guān)聯(lián)。頭部針刺理論將頭部劃分為頂區(qū)、頂前區(qū)、額區(qū)、枕區(qū)、枕下區(qū)、顳區(qū)和項區(qū)7 個治療分區(qū)，治療腦卒中主要選取頂區(qū)、頂前區(qū)和額區(qū)，并以頭部的重要經(jīng)脈督脈作為縱向維度基準，結(jié)合頭部分區(qū)理論并兼顧通督調(diào)神理念的頭部針刺療法，目前針灸在臨床腦卒中的治療過程中被廣泛應(yīng)用［4］。本研究探討頭部針刺對局灶性腦缺血大鼠模型神經(jīng)功能的影響，并闡明HIF-1α 和血管內(nèi)皮生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）促血管再生的機制，為頭部針刺治療腦卒中的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器40 只SPF 級SD大鼠購自吉林省長春市億斯實驗動物技術(shù)有限公司，雌雄各半，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（吉）-2018-0007，體質(zhì)量220~230 g，于長春中醫(yī)藥大學(xué)SPF 級實驗動物中心飼養(yǎng)。飼養(yǎng)間保持23 ℃、12 h/12 h 光照周期，濕度（55±10）%，并自由飲水。實驗過程符合實驗動物倫理要求，由長春中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會審批（20190151）。大鼠HIF-1α 酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（中國南京建成生物工程研究所）。華佗牌一次性針灸針（0.25×13 mm，蘇州醫(yī)療用品有限公司），Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)和視頻分析系統(tǒng)（型號Tracking Master V3.0，北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展責(zé)任有限公司）， 組織勻漿器（美國KONTES KIMBLE 公司），低溫高速離心機（德國Eprendorf公司），Biotek Synergy HTX 多功能微孔板檢測儀（美國寶特伯騰公司）。

1.2 大鼠局灶性腦缺血模型制備和實驗分組采用改良大腦中動脈栓塞法（middle cerebral artery occlusion，MCAO）造模［5］。40 只大鼠術(shù)前24 h 禁食但自由飲水，麻醉大鼠，大鼠仰臥位固定并于頸部正中剃毛和消毒。以手術(shù)刀縱向切口，止血鉗鈍性分離組織，玻璃分針分離左側(cè)頸內(nèi)動脈和頸外動脈，分別掛線備用，結(jié)扎頸外動脈和頸總動脈，夾閉頸內(nèi)動脈。于頸總動脈上距離分叉2 mm 處剪1 個斜口，插入線栓，松開頸內(nèi)動脈血管夾后迅速輕提掛頸內(nèi)動脈上的縫合線以防止出血過多，將線栓沿頸內(nèi)動脈穿過顱骨直至手下有明顯阻力時，實現(xiàn)大腦中動脈阻塞，導(dǎo)致腦缺血。結(jié)扎切口并固定線栓，剪斷多余部分縫合線和線栓，縫合傷口，注射20 萬單位青霉素，防止感染，并置于加熱墊上維持體溫恒定。術(shù)后采用《Zea-longa 評分標(biāo)準》［6］對大鼠神經(jīng)功能進行評定，判定大鼠局灶性腦缺血模型制備是否成功。無異常癥狀為0 分，鼠尾提起時前肢無法正常伸展為1 分，行走時偏向一側(cè)為2 分，行走困難且傾斜嚴重為3 分，有意識障礙且無法自發(fā)行走為 4 分，1~4 分視為造模成功。將術(shù)中意外死亡和造模未成功大鼠剔除實驗，并隨機選取大鼠補充。選取造模成功的20 只大鼠隨機分為模型組和治療組，每組10 只；另取10 只SD 大鼠作為假手術(shù)組，造模結(jié)束后次日，治療組大鼠進行頭部針刺治療；模型組大鼠同樣捆綁固定，但不進行治療；假手術(shù)組大鼠同樣麻醉后捆綁、分離頸部血管和結(jié)扎相應(yīng)血管，但不進行造模和治療，其余步驟與另外2 組相同。造模后24 h 后觀察并記錄各組大鼠神經(jīng)功能評分。

1.3 頭部針刺操作方法頭部針刺干預(yù)前大鼠麻醉固定，結(jié)合《大鼠穴位圖譜》［7］，在頂骨正中的百會穴及旁開5 mm 處進行定位取穴。頭部針刺治療先取百會穴，以0.25×13 mm 針灸針向前斜刺10 mm，再于百會穴兩側(cè)旁開約5 mm 處沿皮朝鼻尖向前斜刺10 mm，進針后以捻轉(zhuǎn)方式快速行針30 s，以5 mm×10 mm 小塊醫(yī)用膠布固定，采用叢刺法和長留針的方式，將大鼠放入無墊料籠中，配合帶針運動，留針6~8 h，每日1次，每周針刺7 次，持續(xù)2 周。

1.4 Morris 水迷宮實驗檢測各組大鼠學(xué)習(xí)記憶功能Morris 水迷宮試驗用于測試大鼠的復(fù)雜記憶和空間定位能力［8］。Morris 水迷宮由1 個直徑為160 cm 的圓形水池和圖像采集分析系統(tǒng)構(gòu)成，周圍有遮光布，減少外界干擾。清水高度為距離站臺臺面約2 cm，將每只大鼠抓住尾巴頭朝池壁，分別由站臺對面象限放入水池，記錄各組大鼠尋找平臺時間，每次時間限制為120 s，若120 s 內(nèi)未找到站臺則誘導(dǎo)其在站臺上站立15 s，每只大鼠4 次訓(xùn)練結(jié)束，毛巾擦干水分。以各組大鼠尋找平臺時間代表大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。

1.5 ELISA 法檢測各組大鼠血清和腦組織中HIF-1α水平在治療周期結(jié)束后，分別將各組大鼠麻醉，剪開腹腔，腹主動脈取血5 mL，并將血液樣本于2 000 g、4 ℃離心15 min，離心后獲取上層血清。大鼠處于麻醉狀態(tài)，取血后斷頭處死，立即剝離腦組織，腦樣本按質(zhì)量體積比1 g ：9 mL 的比例加入9 倍體積pH 7.4 的磷酸鹽緩沖液，手工或勻漿器充分勻漿，2 000 g、4 ℃離心15 min，收集上清液備用。實驗均嚴格按照試劑盒說明書進行，檢測各組大鼠血清和腦組織中HIF-1α 水平。

1.6 Western blotting 法檢測各組大鼠腦組織中HIF-1α 和VEGFR2 蛋白表達水平剪取腦組織約0.1 g，加入細胞裂解液1 000 μL，離心5 min，取上清液，將蛋白樣品按1∶4 加入蛋白上樣緩沖液，每孔加10 μL 樣品，90 V 濃縮30 min， 120 V 分離1 h，轉(zhuǎn)膜并封閉，參考一抗說明書配制一抗稀釋液，室溫下孵育2 h， TBST 緩沖液洗滌3 次，每次5 min，參考二抗說明書配制二抗稀釋液，室溫孵育1.5 h，TBST 緩沖液洗滌3 次，每次5 min，采用ECL 發(fā)光底物試劑盒檢測蛋白條帶，采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin 為內(nèi)參，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 24.0 和GraphPad Prism 8 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。各組大鼠神經(jīng)功能評分、尋找平臺時間、血清和腦組織中HIF-1α水平及各組大鼠腦組織中HIF-1α 和VEGFR2 蛋白表達水平均符合正態(tài)分布，以x±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用獨立樣本t檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠術(shù)后神經(jīng)功能評分假手術(shù)組大鼠未見神經(jīng)功能缺陷。與假手術(shù)組比較，模型組和治療組大鼠神經(jīng)功能評分升高（P<0.05）。模型組和治療組大鼠神經(jīng)功能評分比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分Tab. 1 Neural function scores of rats in various groups(n=10，x±s）

2.2 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶功能與假手術(shù)組比較，模型組大鼠尋找平臺時間增加（P<0.05）。與模型組比較，治療組大鼠尋找平臺時間減少（P<0.05）。見表2。

表2 各組大鼠尋找平臺時間Tab. 2 Time of finding platform of rats in various groups(n=10，x±s）

2.3 各組大鼠血清和腦組織中HIF-1α 水平與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清和腦組織中HIF-1α水平均升高（P<0.05）。與模型組比較，治療組大鼠血清和腦組織中HIF-1α 水平均升高（P<0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血清和腦組織中HIF-1α 水平Tab. 3 Levels of HIF-1α in serum and brain tissue of rats in various groups [n=10,x±s,ρB/（ng·L－1）]

2.4 各組大鼠腦組織中HIF-1α 和VEGFR2 蛋白表達水平與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中HIF-1α 和VEGFR2 蛋白表達水平均升高（P<0.05）。與模型組比較，治療組大鼠腦組織中HIF-1α 和VEGFR2 蛋白表達水平均升高（P<0.05）。見圖1 和表4。

圖1 Western blotting 法檢測各組大鼠腦組織中HIF-1α 和VEGFR2 蛋白表達電泳圖Fig. 1 Electrophoregram of expressions of HIF-1α and VEGFR2 proteins in brain tissue of rats in various groups detected by Western blotting method

表4 各組大鼠血腦組織中HIF-1α 和VEGFR2 蛋白表達水平Tab. 4 Expression levels of HIF-1α and VEGFR2 proteins in brain tissue of rats in various groups(n=3，x±s）

3 討 論

局灶性腦缺血是一種嚴重威脅人類生命和健康的疾病，其發(fā)病迅速且預(yù)后極差，可能會造成認知障礙或肢體痙攣等嚴重后果，在臨床治療過程中，頭部針刺療法安全可靠且無不良反應(yīng)，在腦卒中的治療中具有良好的效果［9］。

HIF-1α 是受缺氧條件誘導(dǎo)的細胞因子，多在哺乳動物體內(nèi)表達，隨著體內(nèi)氧濃度變化而合成分泌。研究［10-11］顯示：缺氧狀態(tài)誘導(dǎo)生成的HIF-1α可通過促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）或血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF） 等促進血管生成， 并可影響Notch、Wnt 和Shh 等通路向機體組織供氧。研究［12］顯示：腦卒中患者在供氧量不足時，HIF-1α水平變化較為明顯，其與腦卒中的發(fā)展及患者預(yù)后有密切關(guān)聯(lián)。缺氧誘導(dǎo)HIF-1α 水平變化的具體機制尚未完全闡明。AMINOVA 等［13］認為：大鼠海馬細胞中HIF-1α 水平對于不同程度的刺激損傷表現(xiàn)出促進細胞活性和促進細胞凋亡的雙重作用。HIF-1α 水平升高可能反映腦組織損傷加重。研究［14］顯示：腦卒中大鼠模型中血腦屏障的通透性增加或發(fā)生腦水腫時，HIF-1α 水平升高。在頭部針刺治療腦卒中急性期患者，即使及時治療也存在部分癥狀繼續(xù)加重，表明在應(yīng)激栓塞初期一段時間內(nèi)，腦動脈細胞和神經(jīng)的壞死會持續(xù)發(fā)生［15］。本研究結(jié)果顯示：造模后模型組大鼠血清和腦組織中HIF-1α 水平升高，而經(jīng)過治療后，治療組大鼠腦組織中HIF-1α 水平繼續(xù)升高，與上述研究結(jié)論一致。HIF-1α 對腦組織損傷具有修復(fù)作用，研究［16-17］顯示：HIF-1α 抑制劑2-甲氧基雌二醇（2-methoxyestradiol，2ME2） 在降低腦缺血大鼠HIF-1α 水平的同時降低了神經(jīng)元的存活率，表明HIF-1α 可調(diào)節(jié)神經(jīng)元活性。BARANOVA 等［18］將小鼠神經(jīng)元中HIF 基因特異性敲除，加重腦缺血模型中腦組織損傷，并降低細胞存活率。急性腦缺血通過HIF-1α 上調(diào)激活內(nèi)源性組織型纖溶酶原激活物，從而破壞血腦屏障［19］。HIF-1α 水平升高可促進VEGF 表達升高， VEGF 主要通過作用于VEGFR2 促進血管內(nèi)皮細胞的遷移并在缺氧缺血的區(qū)域增殖分化，進而發(fā)揮促進血管再生的功能。研究［20］顯示：HIF/VEGFR2 通路在局灶性腦缺血后血氧不足條件下表達增加，從而減少腦梗死面積和保護神經(jīng)功能。HIF-1α 在N-乙酰半胱氨酸介導(dǎo)的神經(jīng)保護中起重要作用，并為抗氧化劑在IS 的神經(jīng)保護作用提供分子機制［21］。本研究結(jié)果顯示：造模后模型組和治療組大鼠腦組織中VEGFR2 蛋白表達水平均升高，HIF-1α 對血管內(nèi)皮再生激活和腦組織損傷后修復(fù)起關(guān)鍵作用，而頭部針刺促進腦組織中HIF-1α 水平升高，增強腦組織損傷后的修復(fù)。

綜上所述，頭部針刺可能通過調(diào)控腦組織中HIF-1α 和VEGFR2 水平升高激活HIF/VEGFR2 血管再生通路，修復(fù)局灶性腦缺血大鼠腦組織功能，為進一步研究頭部針刺對局灶性腦缺血的血管內(nèi)皮再生機制提供參考。