黃少婷, 李 友, 吳釗淳, 何嘉文, 廖科棋, 李勝男

（1. 廣東醫(yī)科大學 廣東省衰老相關(guān)心腦疾病重點實驗室， 廣東 湛江 524002；2. 廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院神經(jīng)病學研究所， 廣東 湛江 524002）

動脈粥樣硬化是臨床常見的心腦血管疾病，其病變基礎(chǔ)是脂質(zhì)代謝障礙，可驅(qū)動脂質(zhì)導致慢性炎癥性疾病的發(fā)生。顱內(nèi)動脈粥樣硬化是全身動脈粥樣硬化的一部分。研究［16］表明：長鏈非編碼基因WDR59（long noncoding RNA WDR59，lncWDR59）表達可上調(diào)SOX17 表達，激活β-連接蛋白（β-catenin），減輕氧化修飾的低密度脂蛋白（oxidized-low density lipoprotein，ox-LDL）對內(nèi)皮細胞的損傷。lncWDR59 可減輕敲除載脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE） 小鼠動脈粥樣硬化和ox-LDL 誘導的內(nèi)皮細胞DNA 損傷，促進內(nèi)皮細胞增殖。本研究構(gòu)建SOX17 過表達慢病毒載體并包裝為慢病毒，使用SOX17 過表達慢病毒感染PC12 細胞并構(gòu)建穩(wěn)定過表達SOX17 的細胞系，為探討SOX17 在顱內(nèi)動脈粥樣硬化中的作用機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞、病毒、主要試劑和儀器大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12 細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司，人胚腎HEK 293T 細胞購自中國科學院上海細胞所。 慢病毒載體質(zhì)粒GV492 （Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin）、輔助質(zhì)粒Helper 1.0 和輔助質(zhì)粒Helper 2.0 均由上海吉凱基因公司提供。 大腸桿菌菌株DH5α 購自北京Solarbio 公司，限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ和AgeⅠ購自美國NEB 公司，Taq 聚合酶購自北京SinoBio公司，一步法克隆試劑盒（含DNA 連接酶）購自美國Vazyme 公司，HS 聚合酶和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京Takara Bio 公司，Lipofectamine 2000 和TRIzol 試劑購自美國Invitrogen 公司，實時熒光定量PCR （real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR） 染料預混液購自北京GenStar 公司，BCA 蛋白定量試劑盒購自美國Thermo Scientific 公司，DMEM、RPMI-1640 和Opti-MEM 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司，膠回收試劑盒、50×TAE 和質(zhì)粒抽提試劑盒由北京TIANGEN 公司提供，胰蛋白酶、瓊脂糖粉、酵母提取物和氯化鈉購自美國Vetec 公司，抗SOX17 抗體和抗GAPDH 抗體購自英國Abcam 公司，所用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。倒置光學顯微鏡和倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus 公司，RT-qPCR儀購自瑞士Roche 公司，電泳儀購自美國Bio-Rad公司，化學發(fā)光檢測儀購自美國Azure Biosystems公司。

1.2 細胞培養(yǎng)HEK 293T 細胞和PC12 細胞分別常規(guī)培養(yǎng)于含10% 胎牛血清和1% 青-鏈霉素DMEM 和RPMI-1640 培養(yǎng)基中， 置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔2~3 d 傳代1 次，細胞狀態(tài)良好及密度大于90%時采用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.3 PCR 引物設(shè)計和合成NCBI 數(shù)據(jù)庫搜索SOX17（Gene ID：64321） 序列，結(jié)合引物設(shè)計原則和載體GV492 閱讀框克隆位點，設(shè)計引物。引物序列：SOX17 上游引物 5′-AGGTCGACTCTAGAGGATCCCGCCACCATGAGCAGCCCGGA TGCGGGATAC-3′；SOX17 下游引物 5′-TCCTTGTAGTCCATACCGATGTCAGGGTAGTTGC AGTAGTAG-3′。設(shè)計并合成SOX17 PCR 鑒定引物： SOX17 上游引物5′-GCACATGGGCGCCCACTACC-3′； SOX17 下游引物 5′-CCTTATAGTCCTTATCATCGTC-3′。 設(shè) 計 并 合 成SOX17 RT-qPCR 引物：SOX17 上游引物5′-GTATAAGCCGGAGATGGGT-3′；SOX17 下游引物5′-CCGTCAGATGTCAGGGTAG-3′。 所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。將合成的基因引物通過PCR 擴增后得到DNA 片段，PCR 反應體系（50 μL）：10 μmol·L－1上、下游引物各1 μL，DNA 模板1 μL，2.5 mmol·L－1dNTP 4 μL，5×酶緩沖液10 μ L，HS 聚合酶 0.5 μL，加ddH2O 至50 μL。PCR 反應條件：98 ℃變性5 min，98 ℃、10 s，55 ℃、10 s，72 ℃、90 s，30 個循環(huán)；72 ℃繼續(xù)延伸8 min，4 ℃保存。

1.4 SOX17 慢病毒載體構(gòu)建采用BamH Ⅰ和AgeⅠ限制性內(nèi)切酶對GV492 進行雙酶切，酶切體系（50 μL）：10×酶緩沖液 5 μL，1 g·L－1GV492 DNA 2 μL，BamH Ⅰ 1 μL，AgeⅠ 1 μL， 加ddH2O 至總體積為50 μL。吹打混勻離心后，置于37 ℃反應3 h 或過夜。采用酶切回收試劑盒初膠回收GV492 載體質(zhì)粒。

采用一步法克隆試劑盒將PCR 擴增的SOX17產(chǎn)物連接至攜gcGFP/Puromycin 的慢病毒GV492載體，重組后載體見圖1。反應體系（10 μL）：5×酶緩沖液 2 μL，酶切后GV492 DNA 2.5 μL，純化后PCR 產(chǎn)物片段1 μL，DNA 連接酶 1 μL，加入ddH2O 至總體積為10 μL。該反應體系于冰水浴中配制，吹打混勻離心后，37 ℃反應30 min，冰浴冷卻5 min。

圖1 SOX17 過表達慢病毒載體構(gòu)建圖Fig. 1 Diagram of construction of SOX17 over-expression lentiviral vector

將10 μL GV492 空載質(zhì)粒和GV492-SOX17 過表達重組質(zhì)粒分別加入至100 μL 感受態(tài)細胞DH5α中混勻，冰上反應30 min 后，42 ℃熱激1.5 min，冰浴2 min。加入500 μL LB 培養(yǎng)基，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)60 min。取適量培養(yǎng)后菌液，將其均勻涂布于含100 mg·L－1氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)平板上，倒置平板于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12~16 h。次日待平板上長出菌落，挑取適量菌落于3 mL 含100 mg·L－1氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基中，37 ℃搖床振蕩過夜，吸取適量菌液采用甘油保菌，剩余菌液進行PCR 和瓊脂糖凝膠電泳鑒定。鑒定體系（20 μL）：Taq 聚合酶 10 μL，10 μmol·L－1PCR上、下游引物各0.4 μL，適量甘油菌液，加入ddH2O 至總體積為20 μL。PCR 反應條件：94 ℃變性3 min，94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、30 s，22 個循環(huán)，72 ℃延伸5 min，于4 ℃保存。于基因片段長度為744 bp 附近出現(xiàn)目的條帶，提示該重組子為攜帶GV492-SOX17 過表達重組質(zhì)粒的陽性菌。鑒定陽性菌經(jīng)克隆后由生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序成功的陽性菌通過質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒，所得質(zhì)粒即可用于后續(xù)實驗。

1.5 SOX17 慢病毒包裝和滴度測定轉(zhuǎn)染前1 d，將生長狀態(tài)良好的HEK 293T 細胞鋪至100 mm 細胞培養(yǎng)皿中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞密度生長至80%~90% 時進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染體系：Mixture A，GV492 空載質(zhì)粒或GV492-SOX17 過表達重組質(zhì)粒 10 μ g， Helper 1.0 型 5 μg，Helper 2.0 型5 μg，Opti-MEM 750 μL；Mixture B，Lipofactamine 2000 15 μL，Opti-MEM 750 μL。分別混勻Mixtue A 和Mixtue B 體系，避光室溫靜置5 min，后將二者混勻，避光室溫孵育20 min。將Mixtue A 和Mixtue B 混合液加入至含3 mL Opti-MEM 的100 mm 培養(yǎng)皿中，37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)轉(zhuǎn)染4~6 h，后更換為正常生長培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率約為90%時，收集培養(yǎng)皿上清液，采用0.45 μm 濾膜過濾，低溫超高速離心后棄上清液，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）溶解病毒沉淀。轉(zhuǎn)染GV492 空載質(zhì)粒后收集的慢病毒為GV492 對照慢病毒，轉(zhuǎn)染GV492-SOX17 過表達重組質(zhì)粒后收集的慢病毒即為GV492-SOX17 過表達慢病毒。

表2所示數(shù)據(jù)是在混合汽修正過程中截取的，發(fā)動機運行一段時間后，混合汽很快就修正到表1所示的數(shù)據(jù)。在筆者進行學習值清除后，混合汽長期修正值和短期修正值又都歸零，噴油時間變成了1ms，但氧傳感器λ值居然變成了0.6，此時發(fā)動機抖動加劇。但是，很快ECU又開始參與混合汽修正，短期修正值從0變成了-25%，同時噴油脈寬也變成了0.8ms，氧傳感器λ值變成了0.8，此時，雖然發(fā)動機仍然有些抖動，但比之前要平穩(wěn)了許多。隨后，ECU繼續(xù)對混合汽進行修正，長期修正值也開始從0逐漸變成了-35%，噴油脈寬變?yōu)?.6ms，發(fā)動機運轉(zhuǎn)趨于基本平穩(wěn)，此時調(diào)節(jié)過程已達到極限，氧傳感器λ值維持在0.99。

慢病毒滴度測定前1 d，將HEK 293T 細胞分為101μL 病毒溶液、100μL 病毒溶液和10－1μL 病毒溶液組，以每孔4×104個的細胞密度接種至96 孔細胞培養(yǎng)板中。棄培養(yǎng)基，各組分別加入相應濃度病毒溶液，37 ℃培養(yǎng)24 h 后，加入100 μL完全培養(yǎng)基，待4 d 后于熒光顯微鏡下觀察各組病毒熒光表達情況。

1.6 PC12 細胞感染和細胞系構(gòu)建將PC12 細胞鋪于12 孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞密度達到70%~80%時，按最佳感染復數(shù)100 取相應病毒量進行慢病毒感染實驗。將PC12 細胞分為將空白組、GV492 對照組和GV492-SOX17 組，空白組不作處理，GV492 對照組和GV492-SOX17 組分別采用GV492 對照慢病毒和GV492-SOX17 過表達慢病毒感染PC12 細胞，慢病毒感染24 h 后換液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，加入10 mg·L－1嘌呤霉素篩選，1 d 后換液，后維持嘌呤霉素濃度于5 mg·L－12 周。熒光顯微鏡下觀察，若PC12 細胞生長狀態(tài)良好且表達綠色熒光，則提示細胞系構(gòu)建成功。

1.7 RT-qPCR 法檢測各組PC12 細胞中SOX17 mRNA 表達水平采用TRIzol 法提取各組RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進行RT-qPCR 法檢測。反應體系（10 μL）：染料預混液5 μL，10 μmol·L－1PCR 上、下游引物各0.2 μL，cDNA 1 μL，加入ddH2O 至10 μL。PCR 擴增條件：95 ℃、10 s，55 ℃、20 s，72 ℃、15 s，共40 個循環(huán)，PCR 熔解條件：65 ℃、60 s，95 ℃、1 s。以GAPDH 為內(nèi)參，采用2－△△Ct法計算目的基因表達水平。

1.8 Western blotting 法檢測各組PC12 細胞中SOX17 蛋白表達水平收集各組細胞，采用BCA蛋白定量法進行蛋白定量，恒壓60 V、30 min 和恒壓100 V、90 min 電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)模，快速封閉液封閉30 min，30 min 后TBST 緩沖液洗膜3 次，每次10 min。加入對應一抗，4 ℃孵育過夜，回收后洗膜3 次，室溫孵育二抗60 min，洗膜3 次，采用化學發(fā)光劑使條帶顯影。以GAPDH 為內(nèi)參，采用Image J 軟件分析條帶灰度值，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1.9 統(tǒng)計學分析采用Graphpad Prism 6.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。各組細胞中SOX17 mRNA和蛋白表達水平均符合正態(tài)分布，以xˉ±s 表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 SOX17 過表達慢病毒載體的鑒定結(jié)果GV492-SOX17 過表達重組質(zhì)粒的基因片段長度約為744 bp，與預期一致。見圖2。將測序成功的GV492-SOX17 質(zhì)粒DNA 序列與設(shè)計的SOX17序列比較，二者DNA 序列完全匹配，表明SOX17序列成功連接至GV492 載體中，PCR 產(chǎn)物鑒定和測序結(jié)果提示成功構(gòu)建GV492-SOX17 慢病毒載體。見圖3。

圖2 GV492-SOX17 過表達重組質(zhì)粒鑒定電泳圖Fig. 2 Electrophoregram of identification of GV492-SOX17 over-expression recombinant plasmids

2.2 SOX17 過表達慢病毒感染PC12 細胞鑒定結(jié)果細胞轉(zhuǎn)染48 h 后觀察可見熒光表達強烈，生長狀態(tài)良好，慢病毒包裝成功。GV492 對照慢病毒和GV492-SOX17 過表達慢病毒滴度均為2.5×108TU·mL－1。熒光顯微鏡下觀察結(jié)果顯示PC12細胞生長狀態(tài)良好且表達綠色熒光，表明穩(wěn)定細胞系初步構(gòu)建成功。見圖4。

圖4 熒光顯微鏡觀察慢病毒感染PC12 細胞中熒光表達情況（×4）Fig. 4 Expression of fluorescence in PC12 cells infected with lentivirus observed by fluorescence microscope(×4)

2.3 各組PC12 細胞中SOX17 mRNA 表達水平與空白組（1.174±0.124） 和GV492 對照組（2.635±0.370） 比較，GV492-SOX17 組PC12 細胞中SOX17 mRNA 表達水平（6.525±0.277） 明顯升高（P<0.01）。

2.4 各組PC12 細胞中SOX17 蛋白表達水平各組細胞在相對分子質(zhì)量44 000 處出現(xiàn)特異性條帶，提示PC12 細胞中SOX17 蛋白成功表達。與空白組（1.000±0.065） 和 GV492 對照組 （1.571±0.088） 比較， GV492-SOX17 組PC12 細胞中SOX17 蛋白表達水平（2.078±0.140）升高（P<0.05）。見圖5。

圖5 各組PC12 細胞中SOX17 蛋白表達電泳圖Fig. 5 Electrophoregram of expression of SOX17 protein in PC12 cells in various groups

3 討 論

顱內(nèi)動脈粥樣硬化是全身動脈粥樣硬化的一部分，可引起暫時性腦缺血發(fā)作、腦卒中和血管性癡呆等腦血管疾病。盡管不同部位的動脈粥樣硬化病變程度并不平行，但晚期顱內(nèi)動脈粥樣硬化的病變程度與顱外動脈粥樣硬化的病變程度較為相似［17］。研究［18］顯示：電負性低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）可通過促進炎癥反應、誘導細胞凋亡、促進血栓形成和刺激LDL 顆粒的聚集融合等方式促進動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。電負性LDL 由L1~L5 共分為5 個亞組分，其中L5 是帶負電最多的亞組分。研究［19］顯示：L5 對神經(jīng)元樣PC12 細胞具有直接細胞毒性。此外，動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展還與Wnt/β-catenin 和Notch 信號通路炎癥反應相關(guān)通路的激活及內(nèi)皮功能障礙有關(guān)［20-23］。

SOX17 可維持血管穩(wěn)態(tài)，與Wnt/β-catenin 和Notch 信號通路存在調(diào)控關(guān)系。研究［7-8］顯示：SOX17 作為SOX 家族的一員，參與血管的發(fā)育。研究［8，12］顯示：SOX17 可通過Wnt/β-catenin 和Notch信號通路維持血管穩(wěn)定性。NATARELLI等［16］研究顯示：lncWDR59 通過Notch1 介導的SOX17表達激活β-catenin。經(jīng)ox-LDL 處理的主動脈內(nèi)皮細胞中SOX17 的表達下調(diào)，但lncWDR59 可促進SOX17 的表達，促進Notch1 激活和增加β-catenin活性，通過減少細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2α調(diào)整細胞周期和修復DNA 損傷，減少微核DNA 損傷［16］。lncWDR59 可減輕ApoE 小鼠動脈粥樣硬化和ox-LDL 誘導的內(nèi)皮細胞DNA 損傷，促進內(nèi)皮細胞增殖［16］。提示SOX17 在顱內(nèi)動脈粥樣硬化的形成過程中發(fā)揮重要作用。

PC12 細胞是具有神經(jīng)細胞特性的細胞，生長繁殖速度快，被廣泛用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究。本研究結(jié)果顯示：GV492-SOX17 慢病毒表達載體成功構(gòu)建，感染PC12 細胞后可在熒光顯微鏡下觀察到熒光表達，并證實PC12 細胞中SOX17 mRNA 和蛋白成功表達。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了GV492-SOX17慢病毒表達載體， 建立了穩(wěn)定過表達GV492-SOX17 的PC12 細胞， 為進一步探討SOX17 在顱內(nèi)動脈粥樣硬化中的作用機制提供參考。