盧香云　祖木熱提古麗?阿不來提　姚永坤　徐江

摘要： 目的 探討石河子地區(qū)轉(zhuǎn)錄因子SP1蛋白在口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）組織中的表達(dá)及其預(yù)后中的價值。方法 采用免疫組織化學(xué)染色法檢測122例OSCC和72例癌旁正常組織中SP1蛋白的表達(dá)情況，分析SP1蛋白的表達(dá)與OSCC患者臨床病理資料的關(guān)系，利用Kaplan-Meier生存分析，分析OSCC患者SP1蛋白表達(dá)在預(yù)后中的價值。結(jié)果 SP1蛋白的表達(dá)主要位于OSCC的細(xì)胞核，少量表達(dá)于細(xì)胞漿，其在OSCC中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織（P<0.001）。SP1蛋白的表達(dá)在腫瘤分化程度（P =0.002）、T分期（P=0.044）和TNM分期（P=0.046）有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。SP1蛋白預(yù)測OSCC 的ROC曲線下面積為 0. 958，診斷靈敏度為93.4%和特異性91.7%。Kaplan-Meier 生存分析顯示，SP1蛋白高表達(dá)患者預(yù)后相對較差（P=0.002 8）。運(yùn)用Cox風(fēng)險回歸模型分析影響OSCC 患者預(yù)后的因素，發(fā)現(xiàn)腫瘤T分期、SP1蛋白高表達(dá)為OSCC患者預(yù)后不良的危險因素（P＜0.05） 。結(jié)論 SP1蛋白在預(yù)測OSCC及預(yù)后的評估中具有重要意義，SP1蛋白是OSCC潛在的一種新型臨床診斷和預(yù)后評估的生物標(biāo)志物。

關(guān)鍵詞：SP1；OSCC；免疫組織化學(xué)；預(yù)后

中圖分類號：R739.8文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文獻(xiàn)標(biāo)識碼

Expression of transcription factor Sp1 protein in oral squamous cell carcinoma

and its relationship with prognosis in Shihezi area

LU? Xiangyun1，2， ABULAITI·Zumuretiguli3，YAO? Yongkun2，XU? Jiang1，2*

（1 School of Medicine，Shihezi University，Shihezi，Xinjiang 832000， China;2 The First Affiliated Hospital，School of Medicine，Shihezi University，Shihezi，Xinjiang 832000， China;3 Turpan Peoples Hospital， Turpan， Xinjiang 838000， China）

Abstract： ?Objective To investigate the expression of transcription factor SP1 in oral squamous cell carcinoma （OSCC）and its value in predicting OSCC and prognosis in Shihezi area．Methods 122 cases of OSCC and 72 cases of normal tissues adjacent to oral squamous cell carcinoma were detected SP1 expressed by immunohistochemical. The relationship between the expression of SP1 and clinicopathological features was analyzed， and the value of SP1 expression in predicting OSCC and prognosis were performed by Receiver operating characteristic（ROC） and Kaplan-Meier analysis. Results The expression of SP1 protein was mainly located in the nucleus of OSCC and a small amount of SP1 protein expression in the cytoplasm. The expression of SP1 protein in OSCC tissues was significantly higher than that in normal tissues （P<0.001）. The expression of SP1 protein was significantly different at differentiation （P =0.002），T stage（P=0. 044）， TNM stage （P=0. 046）. SP1 was an area under curve（AUC） of 0.958 with a sensitivity of 93.4% and a specificity of 91.7% for discriminating OSCC patients from healthy controls. Kaplan-Meier survival analysis showed that patients with high SP1 protein expression had relatively poor survival prognosis （P<0.05）. Cox regression hazard model was performed to analyze the prognostic factors of OSCC patients， the results suggested that T stage and SP1 protein over-expressed were risk factors for poor prognosis in OSCC patients（P<0.05）. Conclusion SP1 protein plays an important role in the diagnosis and prognosis evaluation of OSCC， and may be a potential biomarker for clinical diagnosis and prognostic evaluation of OSCC.

Key words： SP1;OSCC;immunohistochemistry;prognosis

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC） 是全球第六大常見惡性腫瘤，是頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中最常見的腫瘤類型［1］。雖然現(xiàn)有醫(yī)療技術(shù)明顯提升，OSCC早期診斷生物學(xué)標(biāo)志物和相關(guān)治療靶點等方面研究已取得較大的進(jìn)展，患者能通過多種治療方法如手術(shù)、化療及靶向治療提高療效，但OSCC患者的預(yù)后仍不盡如意［2-3］。因此，積極尋求OSCC患者診斷及預(yù)后的新型標(biāo)志物和有效的治療靶點，對進(jìn)一步提高OSCC患者的生存率有重要意義。轉(zhuǎn)錄因子SP1廣泛存在于細(xì)胞核中，是SP/KLF轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，其在腫瘤中的功能近年來受到廣泛關(guān)注，本文旨在探討SP1蛋白在OSCC組織中表達(dá)及其在預(yù)測OSCC及預(yù)后中價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2004年至2020 年石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科OSCC患者（石河子地區(qū)）的石蠟包埋組織。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者年齡>18 歲；患者術(shù)前均未接受過放療或化療；患者均已確診為OSCC；均具有完整的相關(guān)臨床病理信息。排除標(biāo)準(zhǔn)：并發(fā)其它惡性疾病，如肺癌、腸癌、宮頸癌等；合并有全身系統(tǒng)性疾病；患者術(shù)前接受過各種治療。共收集OSCC組織122例，癌旁正常組織72例，其中有完整隨訪信息的有78例，男性40例，女性 38例，平均年齡 66.51歲（66.51歲±12.47歲），所有研究樣本的病理診斷和分期，由兩名資深病理醫(yī)生根據(jù)WHO頭頸部腫瘤2017版對 HE 切片進(jìn)行復(fù)片，并參照第八版 UICC TNM 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期。所有納入患者的癌組織及癌旁正常組織均經(jīng)過病理學(xué)驗證，經(jīng)石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)與人體臨床試驗委員會批準(zhǔn)（KJ2020-073-01），并獲得所有參與者的知情同意。收集患者的年齡、性別、族別、腫瘤部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期等相關(guān)臨床資料，后期隨訪采用電話、查找醫(yī)院患者病歷或其它方法，隨訪截止時間為2020年8月或死亡日期。

1.2 組織芯片的制備

首先對選取HE 切片進(jìn)行病理診斷核對，由病理醫(yī)師在顯微鏡下標(biāo)記HE 切片上典型的病變區(qū)，然后該區(qū)域?qū)?yīng)在蠟塊上準(zhǔn)確標(biāo)記，為制備組織芯片的取材位點。采用組織芯片制作儀（Mitogen公司，MiniCore），制作組織芯片，3～4μm厚度，連續(xù)切片，備用。

1.3 免疫組織化學(xué)染色和結(jié)果判定

采用EnVision兩步法對SP1進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色（Immunohistochemistry，IHC）。已制備組織芯片，置于65 ℃烘箱烘烤30 min，常規(guī)脫蠟后，置于EDTA抗原修復(fù)緩沖液中，高溫高壓修復(fù)8 min，待自然冷卻冷卻至40 ℃取出；PBS 溶液沖洗3次，每次5 min；吸干 PBS 后，加3%雙氧水，避光，室溫靜止10 min；滴加一抗SP1兔多抗（1∶1 000， 21962-1-AP， 武漢三鷹公司）覆蓋組織，4 ℃孵育過夜。次日置于 37 ℃溫箱，復(fù)溫 30 min；PBS溶液沖洗3次，每次5 min；吸干 PBS 后，滴加通用型生物素化二抗，37 ℃孵育30 min：PBS 洗3次，每次5 min；滴加DAB 顯色，反應(yīng)5min，顯微鏡連續(xù)觀察，適時終止顯色；蘇木素復(fù)染2 min，酸酒精分化5 s，脫水、烘干、滴加中性樹脂、封片。根據(jù)抗體說明書陽性組織做陽性對照，滴加PBS 溶液替代一抗為陰性對照，不滴加一抗為空白對照組。

IHC染色評分采用雙盲法，由兩位高年資病理醫(yī)師評定。SP1主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)，顯示棕黃色或棕色顆粒為陽性。根據(jù)細(xì)胞著色強(qiáng)度評分從0～3分，即為：0分（無著色）、1分（黃色）、2分（棕黃色）、3分（棕色）。按腫瘤細(xì)胞陽性細(xì)胞的百分比記分0～4分，即 0分（0～5%）、1分（6%～25%）、 2分（26%～50% ）、3分（51%～75%）、4分（≥76%）。兩項記分相乘為SP1的表達(dá)強(qiáng)度，總分<8分記為低表達(dá)，≥8分記為高表達(dá)。若兩病理醫(yī)師對某結(jié)果存在分歧，由第三位高年資的病理醫(yī)師進(jìn)一步評定。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

利用SPSS 25. 0 統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。用 χ2 檢驗分析SP1表達(dá)在臨床特征間表達(dá)情況。ROC曲線分析SP1表達(dá)預(yù)測OSCC 的價值及其特異性和靈敏性。Kaplan-Meier 生存分析進(jìn)行OSCC患者 SP1蛋白的表達(dá)與其生存間的關(guān)系，使用Cox 風(fēng)險模型進(jìn)行OSCC患者預(yù)后危險因素分析。采用雙側(cè)檢驗，P < 0. 05 差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OSCC組織中 SP1蛋白的表達(dá)

組織芯片免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)SP1蛋白主要表達(dá)在細(xì)胞核中，少量在細(xì)胞質(zhì)中，其于癌旁正常組織中多呈低表達(dá)，而在OSCC組織中多為高表達(dá)如圖1所示。SP1蛋白在癌旁正常組織和OSCC組織中高表達(dá)率分別為2.8%和52.5%，其在OSCC組織中表達(dá)的水平高于癌旁正常組織（P<0.001），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

2.2 OSCC 中SP1蛋白的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

OSCC 中SP1蛋白的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系見表2。

根據(jù)SP1蛋白免疫組化評分，分為低表達(dá)組（＜8）和高表達(dá)組（≥8）。SP1蛋白的表達(dá)水平在腫瘤分化程度（P =0.002）、T分期（P=0.044）和TNM（P=0.046）有統(tǒng)計學(xué)意義。而SP1蛋白的表達(dá)在患者不同性別（P=0.585）、年齡（P=0.453）、民族（P=0.168）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P = 0.628）等臨床病理參數(shù)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表2）。

2.3 SP1蛋白表達(dá)診斷OSCC的診斷價值分析

采用受試者工作特征曲線（Receiver operating characteristic curve，ROC）分析SP1蛋白在 OSCC 中的診斷價值。結(jié)果顯示，SP1蛋白表達(dá)在 OSCC的ROC曲線下面積（AUC）值為 0.958（95% CI： 0.927～0.988），診斷拐點即臨界值時（cutoff 為5）區(qū)分OSCC和正常患者的靈敏度為93.4%和特異性91.7%，結(jié)果見圖2。

2.4 SP1蛋白表達(dá)與 OSCC 患者預(yù)后的關(guān)系

78 例OSCC患者具有完整的臨床隨訪信息，利用Kaplan-Meier 生存分析分析OSCC患者 SP1蛋白的表達(dá)與其生存時間的關(guān)系，結(jié)果顯示 SP1蛋白高

表達(dá)患者的生存時間低于 SP1蛋白低表達(dá)患者生存時間（P=0.002 8），差異有統(tǒng)計學(xué)意義，并且SP1蛋白高表達(dá)組患者隨著時間的延長生存率下降，結(jié)果見圖3。

2.5 Cox比例風(fēng)險回歸模型分析OSCC 患者預(yù)后影響因素

采用Cox比例風(fēng)險回歸模型分析OSCC患者的腫瘤的分化程度、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和SP1蛋白表達(dá)是否影響OSCC患者預(yù)后，結(jié)果顯示，腫瘤T分期 、SP1蛋白高表達(dá)為OSCC患者預(yù)后不良的危險因素（P＜0.05） ，見表3。

3 討論

多種研究表明［4-6］，SP1 可通過調(diào)節(jié)PTEN，PFKFB4及NF-κB等多種轉(zhuǎn)錄因子，參與胚胎的發(fā)育、細(xì)胞周期、血管形成、炎癥、衰老等病理生理過程。此外，SP1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，近年來也被學(xué)者廣泛探討。已有相關(guān)［7-9］文獻(xiàn)報道，SP1蛋白在多種腫瘤中特異性高表達(dá)，且其上調(diào)表達(dá)能促進(jìn)腫瘤增殖、遷移和侵襲。OSCC是由多種因素共同作用形成的惡性腫瘤，而其中主要影響因素包括病毒感染、局部刺激、飲食習(xí)慣、吸煙等［10-11］。石河子地區(qū)屬于新疆兵團(tuán)城市，是多民族大雜居的地區(qū)，環(huán)境、飲食等與內(nèi)陸地區(qū)多有不同，SP1蛋白表達(dá)在石河子地區(qū)OSCC的中的診斷及預(yù)后中的價值有待研究。

為探索SP1蛋白在石河子地區(qū)OSCC中表達(dá)及其在預(yù)后中的價值，本研究運(yùn)用免疫組化的技術(shù)在OSCC組織中檢測SP1蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，在OSCC組織中，SP1蛋白特異性高表達(dá)。分析OSCC組織中SP1蛋白表達(dá)與OSCC患者臨床病理相關(guān)參數(shù)的關(guān)系，表明SP1蛋白表達(dá)水平在腫瘤分化程度、T分期和TNM分期上，有統(tǒng)計學(xué)差異。有研究報道［12］，體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞時，敲低SP1的表達(dá)，可抑制細(xì)胞的惡性增殖和遷移，同時降低腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子SP1通過調(diào)控FAM107A促進(jìn)結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移［13］。因此，SP1可能通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，進(jìn)而影響腫瘤的分期。ROC曲線是較為實用、便捷的方法確定診斷試驗的診斷價值，其AUC在0.9～1.0之間時，具有較高的診斷價值。本研究進(jìn)行ROC曲線分析，其AUC 值為 0.958，表明SP1蛋白在區(qū)分OSCC和非OSCC具有較高診斷效能，此時診斷的靈敏度93.4%。提示 SP1蛋白是協(xié)助OSCC患者臨床診斷潛在的一種新型生物學(xué)標(biāo)志物。

本實驗進(jìn)一步分析SP1蛋白的表達(dá)與OSCC患者生存間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn) SP1蛋白高表達(dá)患者的生存時間明顯低于SP1蛋白低表達(dá)患者的生存時間。進(jìn)行Cox比例風(fēng)險回歸模型分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤T分期、SP1蛋白高表達(dá)等因素為OSCC患者預(yù)后不良的危險因素，進(jìn)一步證實SP1可能為促進(jìn)OSCC患者的腫瘤進(jìn)展的重要分子之一。研究報道，SP1通過miRNA-130a-3p調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移［14］。SP1能夠與c-Met基因啟動子結(jié)合，激活c-Met-ERK通路，促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞增殖、抑制其細(xì)胞凋亡，而敲低SP1，可抑制肺腺癌細(xì)胞增殖［15］。因此，下調(diào)SP1表達(dá)是治療OSCC的潛在策略，但在OSCC中，SP1調(diào)節(jié)OSCC發(fā)展的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，SP1 在OSCC組織中特異性高表達(dá)，其表達(dá)水平與腫瘤分化、腫瘤T分期及TNM分期密切相關(guān)，SP1在預(yù)測OSCC及其患者的預(yù)后中具有重要意義。因此，SP1是OSCC 潛在的一種新型的診斷和預(yù)后評估的生物學(xué)標(biāo)志物。

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（責(zé)任編輯：編輯唐慧）

收稿日期：中文收稿日期2022-07-21

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（82160572）

作者簡介：盧香云（1987—），女，碩士研究生，專業(yè)方向為腫瘤病理學(xué)。

*通信作者：徐江（1964—），男，教授，主任醫(yī)師，從事口腔頜面部腫瘤治療及預(yù)防研究，e-mail：1437759520@qq.com。