劉程豪　卓怡呈　楊晨　喬世源　卜媛媛　吳向未

摘要：目的 探討E2F基因與肝癌患者的預后關系及其作為肝癌標志物的可能性。方法 GENT2 數(shù)據庫用于評估 E2F基因在肝癌中的表達。生存分析和 Cox 分析提示 E2F基因的預后價值。使用 STRING 數(shù)據庫構建包含 40 個最相似基因和 E2F1-8 的基因網絡。TIMER數(shù)據庫用于分析 E2F基因表達與免疫細胞浸潤之間的相關性。cBioPortal數(shù)據庫分析E2F1-8的基因突變情況。GEO數(shù)據集用于驗證 E2F5 的表達差異。UALCAN、MEXPRESS、GEO和TCGA數(shù)據庫中甲基化信息用于分析E2F5的表達與啟動子甲基化之間的相關性，并通過人類肝癌細胞系進行驗證。結果 E2F1-8在肝癌組織中均高表達。晚期肝癌患者E2F1-3 和E2F5-8的轉錄水平與總生存率（OS）呈正相關。多因素分析顯示，高水平的E2F5 表達是肝癌患者OS縮短的獨立預后因素。E2F5/7在肝癌中的表達與腫瘤誘導的免疫反應激活和免疫浸潤有關。E2F5在腫瘤組織中高表達與基因突變及啟動子甲基化水平相關。結論 E2F5是肝癌患者生存的獨立預后生物標志物。E2F家族成員在肝癌中的作用可能與其在細胞周期調節(jié)、免疫細胞浸潤或基因突變等方面的功能有關。

關鍵詞：肝癌；E2F基因家族；免疫浸潤；預后

中圖分類號：中圖分類號R285.5文獻標志碼：A文獻標識碼

Correlation between E2F expression and immune infiltrates and prognosis

of hepatocellular carcinoma

LIU? Chenghao1，ZHUO? Yicheng1，YANG? Chen1，QIAO? Shiyuan1，BU? Yuanyuan1，WU? Xiangwei1，2*

（1 School of Medicine，Shihezi University/NHC Key Laboratory of Prevention and Treatment of Central Asia High Incidence Diseases， Shihezi，Xinjiang 832000， China; 2 The First Affiliated Hospital， School of Medicine， Shihezi University，

Shihezi，Xinjiang 832000， China）

Abstract： ?Objective To explore the relationship between E2F gene and prognosis of patients with liver cancer and its potential as a marker of liver cancer. Methods The GENT2 databases were used to assess the expression of E2F1-8 in hepatocellular carcinoma and the association with individual cancer staging and tumor grading. Survival analysis and Cox analysis suggested the prognostic value of E2F. The STRING database was used to construct a gene network containing the 40 most similar genes and E2F1-8. The TIMER database was used to analyze the correlation between E2F expression and immune infiltrating cells. The cBioPortal database was analyzed for mutations in E2F. The GEO dataset was used to validate the expression differences of E2F5. Methylation information from the UALCAN， MEXPRESS， GEO and TCGA databases was used to analyze the correlation between E2F5 expression and promoter methylation， and validated by human hepatocellular carcinoma cell lines. Results E2F1-8 was highly expressed in all hepatocellular carcinoma tissues and correlated with tumor grade and pathological stage. The transcript levels of E2F1-3 and E2F5-8 were positively correlated with overall survival （OS） in hepatocellular carcinoma patients. Multifactorial analysis showed that high level of E2F5 mRNA was an independent prognostic factor for shortened OS in hepatocellular carcinoma patients. E2F5/7 expression in hepatocellular carcinoma was associated with tumor-induced activation of immune response and immune infiltration. High expression of E2F5 mRNA in tumor tissues correlated with gene mutation and promoter methylation levels. Conclusion E2F5 is an independent prognostic biomarker for survival in patients with hepatocellular carcinoma. The role of E2F family members in hepatocellular carcinoma may be related to their functions in cell cycle regulation， immune cell infiltration or gene mutation.

Key words： hepatocellular carcinoma;E2F gene family;immune infiltration;prognosis

肝癌，主要是肝細胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC），是世界范圍內高發(fā)的一種預后較差的惡性消耗性疾病［1-2］。肝癌的特點是復發(fā)及轉移率較高，在可治愈期的檢出率極低，且治療無效［3］。因此，明確參與肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機制和識別準確的預后生物標志物，有助于為肝癌的早期診斷和治療提供可靠的理論依據以及治療靶點。

E2F蛋白最初被認定是啟動腺病毒 E2 基因的激活因子，可誘導宿主細胞發(fā)生增殖［4-5］。目前已確定的E2F轉錄因子家族成員共有8名，即E2F1-8［6］。家族中各成員的生物學功能不盡相同，主要通過激活特定的下游靶基因來調控細胞增殖和細胞周期進程［4］。目前在不同類型的癌癥中可普遍觀察到 E2F 家族基因表達水平的異常升高。例如，研究發(fā)現(xiàn)E2F1 和 E2F3 在肝癌中表達升高，而 E2F1/E2F3 的過表達可促進小鼠自發(fā)性肝癌的惡性進展［7］。由于其結構和功能的復雜性，先前對 E2F 家族基因的研究僅局限在單個 E2F 基因與肝癌之間的相關性。

本研究全面分析了E2F家族成員在肝癌不同病理階段中的表達水平。通過Cox 分析探索E2F基因表達水平在肝癌中的預后價值 。通過評估E2F表達與免疫微環(huán)境表型的相關性來挖掘潛在的抗腫瘤機制。本研究中的大部分數(shù)據來自TCGA和GEO數(shù)據庫，有助于更好的理解E2F家族基因在肝癌中的功能。最終表明 E2F 家族基因可作為肝癌治療研究的潛在生物標志物。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

E2F5引物（F：5′-TGATACTTTGGCTGTGAGGCA-3′；R：5′-CAGCACCTACACCTTTCCACTG-3′ 購自上海生工生物有限公司），內參引物（F：5′-AACCGCGAGAAGATGACCCAG-3′；R：5′-GGATAGCACAGCCTGGATAGCAA-3′ 購自上海生工生物有限公司），特異性DNA甲基化轉移酶抑制劑地西他濱（北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 GENT2數(shù)據庫

GENT2數(shù)據庫（http：//gent2.appex.kr/gent2/）是一個可對公共基因表達數(shù)據集中正常和腫瘤組織的基因表達模式進行編譯的搜索平臺，可用于研究基于腫瘤亞型的差異表達及預后意義［8］。本研究以P<0.05作為納入標準。通過two-sample t 檢驗比較表達的差異。

1.2.2 TCGA數(shù)據庫

癌癥基因組圖譜（The cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據庫是一個包括30多種人類癌癥的測序和臨床信息的數(shù)據分析平臺［9］。TCGA-LIHC數(shù)據集中下載的mRNA表達數(shù)據及與之配對的臨床參數(shù)可通過R軟件中 Limma 軟件包進行預處理，剔除缺乏隨訪數(shù)據或E2F基因表達缺失的樣本，分析肝癌組織中E2F1-8的mRNA表達及與臨床參數(shù)的關系。使用Survival軟件包分析目的基因表達量與患者OS之間的相關性。通過Students t檢驗比較目的基因表達差異，Cox分析比較生存相關性。

1.2.3 UALCAN數(shù)據庫

UALCAN（http：//ualcan.path.uab.edu）可對TCGA中的RNA-seq數(shù)據和31種癌癥類型的臨床數(shù)據進行深入分析［10］。在本研究中，UALCAN用于分析E2F5在肝癌組織中的甲基化程度。通過Students t檢驗比較轉錄表達的差異。

1.2.4 cBioPortal數(shù)據庫

cBioPortal （www.cbioportal.org） 數(shù)據庫可從多維度對癌癥基因組學數(shù)據進行分析和可視化［11］。本實驗中分析了E2F1-8的基因組圖譜，包括來自GISTIC和mRNA表達z評分（RNASeq V2 RSEM）的突變，z評分閾值±1.8。E2F的基因突變及其與OS，肝癌患者的無病生存期 （DFS）、無進展生存期（PFS）和疾病特異性生存期（DSS）之間的相關性并通過KM圖展示。通過Log-rank test統(tǒng)計生存曲線之間的差異。

1.2.5 免疫評分

ESTIMATE算法可通過基因表達特征來預測腫瘤樣本中基質細胞和免疫細胞的比率。TCGA數(shù)據庫中肝癌患者的免疫評分可從http：//bioinformatics.mdanderson.org/estimate下載［12］。本實驗中根據免疫評分的中位值將肝癌病例分為高低兩組，判斷目的基因在各組中的表達情況。

腫瘤免疫評估資源（Tumor immune estimation resource，TIMER）數(shù)據庫是一個綜合分析腫瘤浸潤免疫細胞的網絡資源（https：//cistrome.shinyapps.io/timer/）［13］。免疫細胞浸潤程度可通過基因表達譜進行統(tǒng)計評估，并通過病理學評估進一步驗證。通過“Correlation”模塊評估肝癌中 E2F的表達與免疫浸潤細胞基因標志物之間的Spearman 相關性和統(tǒng)計學意義。

1.2.6 GEPIA2和STRING數(shù)據庫

基因表達譜交互分析2（Gene Expression Profiling Interactive Analysis 2，GEPIA2）網絡服務器是基于 TCGA 和 GTEx 數(shù)據庫中腫瘤和正常樣本的基因表達分析平臺［14］。通過 “Similar Gene Detection” 模塊（http：//gepia2.cancer-pku.cn/#similar）來識別與E2F1-8最相似的5個基因。STRING 數(shù)據庫可以收集、評分和整合各蛋白質之間相互作用關系［15］。使用蛋白質相互作用模塊，構建E2F1-8 及40個相似基因的相互作用網絡，通過本地工具Cytoscape（version 3.8.2）按degree算法評分對該網絡進行可視化。

1.2.7 GO富集分析

通過基因本體論（Gene Ontology，GO）富集分析工具分析E2F潛在的生物學功能。GO富集分析主要包括細胞成分（Cellular Component，CC）、分子功能（Molecular Function，MF）和生物過程（Biological Process，BP），由工具包（WebGestalt， http：//www.webgestalt.org/）［16］通過在線基因集進行分析，設定各組間差異統(tǒng)計學意義顯著的標準為P和FDR值均<0.05。

1.2.8 GEO數(shù)據集

數(shù)據集 GSE14520、GSE62232和GSE76427均由 Gene Expression Omnibus （GEO， https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/） 獲得。

1.2.9 細胞培養(yǎng)

MHCC97H和HuH-7細胞系均由中國科學院細胞庫購買。細胞在添加10%胎牛血清（Gibco）的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃，5% CO2，實驗所用細胞均無支原體污染。

1.2.10 RNA的提取和qRT-PCR分析

使用RNA提取試劑盒提取經預先處理好細胞的總RNA。利用RevertAid First Strand cDNA提取試劑盒（Thermo Fisher Scientifi）將提取的總RNA中逆轉錄成cDNA?；虮磉_在CFX96觸控實時PCR檢測系統(tǒng)（Bio-Rad）上進行定量。

1.2.11 統(tǒng)計學處理

通過R 3.6.1 軟件用 Cox 回歸分析對 E2F 基因的表達與患者存活率之間的關聯(lián)性進行評估。使用非配對 t 檢驗比較高、低免疫評分組之間E2F基因的表達差異，多個GEO數(shù)據集中正常和腫瘤組織之間 E2F5 的表達差異以及細胞系中處理組與對照組之間目的基因的表達差異。GraphPad Prism （v. 7.0） 用于統(tǒng)計分析和圖形創(chuàng)建。P<0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肝癌患者中E2F1-8 表達水平升高

肝癌患者中E2F1-8表達水平見表1。

通過GENT2數(shù)據庫在GPL570平臺的多個腫瘤芯片數(shù)據中比較腫瘤和正常組織樣本之間 E2F1-8 的表達。腫瘤患者中E2F1-8的表達水平均上調。在肝癌芯片數(shù)據集中，與正常組織相比，肝癌組織中E2F8表達水平增加了2.374倍（P<0.001）。此外，肝癌組織中E2F1（Log2FC=0.8621，P<0.001）、E2F7 （Log2FC=0.870，P<0.001）在肝癌組織中的表達也均高于正常組織（表1）。

2.2 晚期肝癌患者中E2F1-8 表達的預后價值

由于E2F1-8 在晚期肝癌患者中表達更顯著，因此通過生存分析進一步探討 E2F1-8 表達與 Ⅲ 期 肝癌患者生存率之間的關系。結果顯示，在肝癌Stage Ⅲ 期患者中較高的 E2F3/5表達與較差的 OS 相關（P<0.05，圖1C，圖1E）；同樣在Grade Ⅲ 期患者中，E2F2/4/5/6的高表達對 OS 更不利（P<0.05，圖1J，圖1L，圖1M，圖1N）。表明E2F1/2/3/5/6/7/8的表達與不同分期肝癌患者的預后顯著相關，由此初步判斷E2F基因可作為預測肝癌患者存活率的有效生物標志物，且E2F5對于晚期肝癌患者更為敏感。

2.3 E2F1-8 表達水平對肝癌患者OS的獨立預后價值

利用TCGA數(shù)據庫中373例肝癌患者的mRNA表達和臨床資料進行Cox分析。單因素分析顯示在肝癌中病理分期、T分期、M分期、E2F1-3和E2F5-8高表達與顯著縮短的OS相關。多因素分析顯示，僅E2F5高表達與OS的顯著縮短獨立相關（表2），表明E2F5是所有肝癌患者OS的獨立預后因素。

2.4 肝癌中E2F表達與免疫浸潤的關系

利用ESTIMATE算法計算TCGA數(shù)據庫中肝癌患者樣本的免疫評分，來預測腫瘤組織中是否存在浸潤性的免疫細胞。將肝癌患者按免疫評分的中位數(shù)分為高、低評分組，比較E2F1-8的表達差異（圖2A～圖2H）。結果顯示，E2F5在高評分組表達略顯升高而E2F7在高評分組表達顯著降低（P<0.05，圖2E，圖2G），提示E2F5/7可能參與了肝癌的免疫浸潤。

通過ssGSEA算法分析TCGA數(shù)據庫肝癌樣本中E2F5/7分別與各免疫浸潤細胞之間的相關性。結果顯示，E2F5/7均與Th2細胞呈正相關（圖2I，圖2J）。使用TIMER數(shù)據庫評估E2F1-8的表達與腫瘤純度和免疫浸潤細胞水平的關系。結果表明，E2F5/7的表達與肝癌的腫瘤純度及腫瘤細胞中的免疫浸潤水平相關（P<0.05，圖2K，圖2L）。

此外，利用TIMER數(shù)據庫進一步分析E2F5/7表達與免疫細胞標志物之間的相關性（表3）。經過腫瘤純度矯正后，E2F5/7的表達與不同功能T細胞、B細胞、DCs、中性粒細胞、NKs等大部分免疫細胞的基因標志物顯著相關。由此表明，E2F5/7與肝癌中免疫細胞的浸潤有關。

2.5 肝癌患者中E2F基因突變及與生存的相關性

肝癌患者中E2F基因的突變率較高，在379例肝癌患者樣本中有177份樣本發(fā)生了突變，且E2F5的突變率最高，為22%（圖3A）。

生存分析和Log- rank檢驗結果顯示，肝癌患者中E2F基因的遺傳改變均與更短的OS、PFS、DFS和DSS相關（圖3B～圖3E，P<0.05）。這些結果提示，E2F基因突變可顯著影響肝癌患者的預后。

2.6 肝癌患者中E2F及其相關基因變化對功能和通路的影響

通過GEPIA2 數(shù)據庫探索與E2F1-8密切程度最高的5個基因。應用 STRING 數(shù)據庫構建包含E2F1-8及40個已識別基因的相互作用網絡（圖3F）。GO富集分析發(fā)現(xiàn)，E2F家族成員在肝癌中主要參與有絲分裂和細胞周期的轉錄調控等功能相關（圖3G）。同樣的，與E2F基因密切相關的MCM2、EXO1、CCNF、DTL、MELK、MKI67、FBXO5和KIFC1等基因也多是調控染色體或驅動細胞有絲分裂的關鍵基因。MCM2可能是E2F基因在肝癌中的關鍵節(jié)點。根據STRING結果，E2F基因高表達可能與染色體有絲分裂有關。

2.7 E2F5可作為肝癌預后的潛在標志物

GEO數(shù)據集中，E2F5在腫瘤組織中的表達量高于正常組織（圖4A～圖4C，P<0.05）。

為了解E2F5在肝癌組織中異常上調的機制，通過分析UALCAN、MEXPRESS數(shù)據庫，以及GEO14520和TCGA-LIHC數(shù)據集中的甲基化位點數(shù)據，發(fā)現(xiàn)E2F5的表達水平與啟動子DNA序列中多個位點的甲基化狀態(tài)呈負相關（圖4D～圖4G，P<0.05）。此外，使用1 μmol·L-1甲基化抑制劑地西他濱處理細胞48 h后，通過qRT-PCR檢測肝癌細胞中E2F5的表達情況。結果顯示，MHCC97H細胞中與對照組（1.000±0.221）相比，藥物刺激組（2.323±0.342）E2F5表達水平升高（P<0.01）；HuH-7細胞中與對照組（1.000±0.197）相比，藥物刺激組（1.908±0.240）E2F5表達水平升高（圖4H，P<0.01）。將TCGA-LIHC項目中的臨床數(shù)據校正年齡、性別、腫瘤分級、病理分期、T分期等多項臨床參數(shù)變量后，進行單因素和多因素Cox分析。表明在肝癌中E2F5是一種可預測患者總生存的獨立預后因素（圖5A，圖5B）。

3 討論

雖然E2F家族中的部分成員在腫瘤發(fā)生和預后中的功能已得到部分證實［17-19］，但尚未進行生物信息學分析來證明這些因子在肝癌中的作用。本研究基于公共數(shù)據庫的高質量數(shù)據集，對肝癌患者中所有可獲得的E2F1-8 基因表達、基因突變、預后價值、與免疫浸潤的關系和潛在功能進行了深入分析。在肝癌患者中觀察到E2F基因的突變率高達47%，并與較短的生存期相關。并且為E2F基因及其40個最密切相關的基因構建了一個相互作用網絡。此外，E2F基因在晚期肝癌中的預后價值已被確定。E2F5的穩(wěn)定表達和生存價值在多個數(shù)據集中得到驗證。本研究通過對E2F1-8全面分析，為提高肝癌患者的預后準確性及肝癌的治療做出貢獻。

E2F家族成員中，E2F1在細胞中功能已被不斷證實。研究發(fā)現(xiàn)，E2F1通過介導LOC100130075激活MDM2的轉錄使宮頸癌的惡性程度進一步加深［20］；E2F1可通過調節(jié)STMN1的過表達促進卵巢癌的增殖和遷移［21］；DTX3通過調控E2F1及其下游基因CDC2和Cyclin D3表達來調控結直腸癌細胞的生長［22］。此外，E2F1還是真核細胞中細胞周期的主要調控因子，在細胞有絲分裂G1-S期的轉化中起到促進作用［23-24］。與此相同的，本研究發(fā)現(xiàn)肝癌組織中E2F1的表達顯著高于正常組織，且E2F1表達與肝癌患者的分期和分級密切相關。E2F1表達較高的肝癌患者總體生存率普遍較低。

到目前為止，E2F2在人類癌癥中的表達和功能仍然相對空白。生理狀態(tài)下，在細胞增殖、分化和DNA損傷應答等方面發(fā)揮關鍵作用［25］。據文獻報道，E2F2可通過調控細胞周期阻滯、DNA損傷和細胞增殖抑制等方式參與內皮細胞的衰老過程［26］。在肝癌中，E2F2可作為LncRNA AC026401.3調控的下游靶向轉錄因子。AC026401.3通過與OCT1作用來促進其對E2F2啟動子區(qū)的募集，從而增強肝癌患者對索拉非尼和樂伐替尼的耐藥性［27］。本實驗中，E2F2在肝癌組織中的表達量隨腫瘤惡性程度分級的加深而不斷增加，且總體生存率更加惡化。

E2F3位點轉錄表達時有E2F3a和E2F3b兩種替代的亞型蛋白［28］。其過表達對腫瘤細胞所產生的惡性生物學行為目前已被普遍認可。E2F3在兒童的成神經細胞瘤中具有和E2F1相似的下游轉錄特征。E2F1和E2F3作為成神經細胞瘤獨立的預后因素，高表達時患者的預后普遍較差，可能與其異常表達可導致成神經細胞瘤細胞周期和DNA復制失控有關［29］。在肝癌中也有相關miRNA被證明可通過調控E2F3來影響細胞增殖和抑制G0/G1期。據報道，miR-15a-5p可通過靶向E2F3調控肝癌細胞的遷移、凋亡和生長［30］。同樣的，與正常對照組相比，肝癌樣本中E2F3表達上調且與腫瘤分期顯著相關。E2F3過表達的肝癌患者OS普遍較差。綜上所述，認為E2F3在肝癌中可能是一種較強的致癌基因。

目前已有報道指出，E2F4在鼻鱗癌腫瘤組織中高表達且與預后不良有關。E2F4在細胞核中作為轉錄因子可調節(jié)免疫細胞，被認為是診斷和治療鼻咽癌的重要分子靶點，是鼻咽癌潛在的預后因素［31］。除此之外，E2F4在結直腸癌中也普遍被認為是潛在的致癌基因。在人結直腸癌細胞中，E2F4及其靶細胞周期蛋白A的表達均上調。E2F4的表達受抑制時可減緩細胞周期中G1/S相的轉化和降低結腸癌細胞的增殖率［32］。不僅如此，E2F4還可以刺激AGAP2-AS1通過調節(jié)miR-182-5p/CFL1 軸促進結直腸癌的發(fā)展［33］。與先前報道相符，本研究發(fā)現(xiàn)E2F4在肝癌細胞中與正常細胞相比表達上調。然而，E2F4的表達上調與較短的OS之間并無明顯相關，表明其在肝癌中并未起到主要的致癌作用。

E2F5的高表達和致癌能力目前已在多種腫瘤中得到證實，然而在肝癌中的研究還相對較少。胰腺癌中，METTL3可通過調控E2F5的m6A甲基化修飾來促進腫瘤細胞的惡性進展［34］；視網膜母細胞瘤中，circ_0084811通過吸附miR-18a（18b）-5p對E2F5的表達進行調控來促進細胞增殖［35］；miR-32、miR-34a和miR-181a-5p可以通過靶向E2F5調控結直腸癌細胞系的增殖、遷移和侵襲［32］。本研究發(fā)現(xiàn)E2F5在肝癌組織中的表達高于正常組織。在腫瘤分級及個別腫瘤分期中，E2F5的高表達與不利的OS顯著相關，提示是OS縮短的獨立因素。此外，E2F5與肝癌中CD4+/CD8+ T細胞、巨噬細胞和DC的浸潤呈顯著正相關，提示E2F5可能通過參與免疫浸潤細胞的招募和調節(jié)來影響肝癌患者的預后。E2F5的表達主要與Th細胞不同亞群標記物的表達相關，包括Th1細胞（STAT1）、調節(jié)性T細胞（CCR8、CD25）。表明E2F5在調節(jié)Th細胞腫瘤浸潤中發(fā)揮重要作用。由于調節(jié)性T細胞在腫瘤免疫抑制中發(fā)揮重要作用，這可能從側面解釋了為什么E2F5是一種致癌基因。8個E2F基因中E2F5的基因突變率最高，E2F5的高基因突變可能通過破壞Th2/Th1的相對平衡狀態(tài)來促進腫瘤細胞的生長。綜上所述，我們的研究結果表明，E2F5可能通過調節(jié)腫瘤細胞中免疫細胞的浸潤，在肝癌的發(fā)生和惡性進展中起著重要作用。

E2F6在多種腫瘤中均有表達上調的報道，但在肝癌中的作用卻未涉及較深入的研究。E2F6在肝癌的惡性增殖中并未起到主要作用，其作為輔助因子可與CENPU發(fā)生物理作用來促進其泛素化降解，通過影響E2F1的轉錄水平來促進肝癌細胞的增殖［36］。在本研究中，E2F6在肝癌中的表達水平升高，且與OS之間具有顯著相關性。因此，E2F6在肝癌中致癌的潛在機制有待進一步探究。

在腫瘤中E2F7既是轉錄抑制因子，也可作為激活因子［37-38］。有文獻提到，透明細胞腎細胞癌中RP11-478C19.2/E2F7軸參與了預后和免疫浸潤水平，可作為治療的新生物標志物［37］。目前有研究表明，E2F7作為E2F家族中一個特殊成員，對其下游基因的功能具有一定抑制作用，并且其在癌癥中所發(fā)揮的功能目前頗有爭議［38］。E2F7是在肝癌中普遍上調的一個抑制性轉錄因子，其高表達與患者的臨床病理特征不良和生存率差相關。E2F7可通過抑制miR-383-5p轉錄和依次激活SP1/SOX4/Anillin軸促進肝癌細胞的生長［38］。在本研究中，E2F7在肝癌組織中比在正常組織中表達更高，且與患者的個體癌癥分期和腫瘤分級相關。免疫相關性分析發(fā)現(xiàn)，E2F7在肝癌高評分組中表達顯著降低，并且與包括Th1/Th2細胞、耗竭性T細胞和調節(jié)性T細胞在內的T細胞亞群標記物密切相關。由此推斷，E2F7可能通過免疫浸潤改善肝癌患者的預后。

家族最后一個成員E2F8可通過調節(jié)E2F1的活性來控制DNA損傷相關的細胞周期過程［29，32］。在包括肝臟在內的一些組織中，細胞增殖的有絲分裂過程中可被轉錄抑制因子E2F7和E2F8抑制，導致多倍體細胞的形成［39］。此外，E2F8在結直腸癌患者中上調，并且是miR-1258.72的特異性靶點。一項研究報道，敲低E2F8會減少細胞周期調控因子的表達，并且可通過調節(jié)NF-κB通路影響結腸癌細胞的生長［32］。同樣，本研究顯示，所有肝癌患者中E2F8表達上調，且提示OS不良。但其在肝癌中的預后作用尚不清楚，有待進一步研究。

如上所述，本研究證實E2F基因的高突變率（48%）及遺傳改變與較短的生存期相關。進一步發(fā)現(xiàn)，E2F5高表達是所有肝癌患者OS縮短的獨立預后因素且對晚期肝癌患者的預測更為敏感。通過免疫相關性分析，發(fā)現(xiàn)E2F5與腫瘤誘導的免疫反應激活和免疫浸潤相關。這可能是E2F5影響肝癌進展的潛在機制。此外，通過分析數(shù)據庫的甲基化樣本以及甲基化抑制實驗，證實啟動子低甲基化是導致其異常表達的重要原因之一。本次研究結果希望將為拓寬E2F基因作為肝癌中重要標志物的認識提供幫助，同時為肝癌的免疫治療提供新的思路。然而，需要進一步的研究來驗證我們的發(fā)現(xiàn)。

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（責任編輯：編輯唐慧）

收稿日期：中文收稿日期2022-11-17

基金項目：國家自然科學基金項目（81760570），中國醫(yī)學科學院中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項資金項目（2020-PT330-003），新疆生產建設兵團財政科技計劃項目（2021BB006），新疆生產建設兵團中青年領軍人才項目（2018CB017）

作者簡介：劉程豪（1995—），男，碩士研究生，專業(yè)方向為外科學。

*通信作者：吳向未（1973—），男，教授，博士生導師，從事干細胞與再生醫(yī)學、肝膽外科良惡性疾病的臨床與基礎研究，e-mail：wxwshz@126.com。