李貝　范宇宸　趙博

摘要：目的 本課題組前期構(gòu)建了一種正交泛素鏈傳遞方法，并發(fā)現(xiàn)染色體濃縮調(diào)節(jié)蛋白2（RCC2）是泛素連接酶CHIP的潛在底物。本實(shí)驗(yàn)旨在驗(yàn)證CHIP是否能介導(dǎo)RCC2的泛素化及降解，以期通過(guò)CHIP來(lái)泛素化調(diào)控RCC2的表達(dá)和功能。方法 首先構(gòu)建CHIP及其突變體質(zhì)粒，驗(yàn)證CHIP與RCC2是否有相互作用；然后構(gòu)建pLVX-RCC2-FLAG重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染進(jìn)CHIP敲減細(xì)胞株（shCHIP）、HEK293細(xì)胞株、CHIP過(guò)表達(dá)細(xì)胞株（OE CHIP），通過(guò)免疫共沉淀下拉富集RCC2-FLAG并檢測(cè)其泛素化水平；接下來(lái)在HEK293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染不同量的CHIP，以及設(shè)置CHX chase蛋白穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)RCC2的蛋白水平變化；最后利用泛素突變體K48R-Ub及K11R-Ub進(jìn)行CHIP介導(dǎo)RCC2上形成泛素鏈的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。結(jié)果 在HEK293細(xì)胞中，CHIP能夠介導(dǎo)RCC2的泛素化，并在RCC2上形成K48和K11多聚泛素鏈，促進(jìn)其通過(guò)蛋白酶體發(fā)生降解。本課題組前期構(gòu)建了一種正交泛素傳遞方法，并發(fā)現(xiàn)染色體濃縮調(diào)節(jié)蛋白2（RCC2）是泛素連接酶CHIP的潛在底物。本實(shí)驗(yàn)旨在驗(yàn)證CHIP是否能介導(dǎo)RCC2的泛素化及降解，以期通過(guò)CHIP來(lái)泛素化調(diào)控RCC2的表達(dá)和功能。 方法? 首先構(gòu)建CHIP及其突變體質(zhì)粒，驗(yàn)證CHIP與RCC2是否有相互作用；然后構(gòu)建pLVX-RCC2-FLAG重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染進(jìn)CHIP敲減細(xì)胞株（shCHIP）、HEK293細(xì)胞株、CHIP過(guò)表達(dá)細(xì)胞株（OE CHIP），通過(guò)免疫共沉淀下拉富集RCC2-FLAG并檢測(cè)其泛素化水平；接下來(lái)在HEK293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染不同量的CHIP，以及設(shè)置CHX chase蛋白穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)RCC2的蛋白水平變化；最后利用泛素突變體K48R-Ub及K11R-Ub進(jìn)行CHIP介導(dǎo)RCC2上形成泛素鏈的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。 結(jié)果? 在HEK293細(xì)胞中，CHIP能夠介導(dǎo)RCC2的泛素化，并在RCC2上形成K48和K11多聚泛素鏈，促進(jìn)其通過(guò)蛋白酶體發(fā)生降解。 結(jié)論? 泛素連接酶CHIP能夠介導(dǎo)RCC2的泛素化及降解，為實(shí)現(xiàn)通過(guò)CHIP來(lái)泛素化調(diào)控RCC2提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：泛素化；泛素連接酶CHIP；染色體濃縮調(diào)節(jié)蛋白2；降解

中圖分類號(hào)：中圖分類號(hào)R346文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

E3 ligase CHIP mediates the ubiquitination and degradation of RCC2

LI? Bei，F(xiàn)AN? Yuchen，ZHAO? Bo*

（School of Pharmacy， Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200240， China）

Abstract： ?Objective Through the OUT （orthogonal ubiquitin transfer） pathway， we identified RCC2 （regulatory of chromosome condensation 2） as a potential substrate of E3 ubiquitin ligase CHIP. Here， we verified that CHIP can mediate the ubiquitination and degradation of RCC2 and provided a new direction for pharmacology research targeting RCC2. Methods We verified the interaction between CHIP and RCC2 by co-immunoprecipitation. We then examined RCC2 ubiquitination levels in HEK293 cells with knockdown or overexpression of CHIP. To determine if CHIP regulates the degradation of RCC2 by ubiquitination， we transiently transfected CHIP plasmids with titration into HEK293 cells and measured the steady-state levels of RCC2. We also conducted a CHX chase assay to investigate whether CHIP could induce the degradation of RCC2. Furthermore， we validated that CHIP can form K48- and K11- linked polyubiquitin chains on RCC2 by Ub mutants K48R-Ub and K11R-Ub. Conclusions Overall， our work uncovers an important mechanism underlying the regulation of RCC2 through CHIP-mediated ubiquitination and degradation in HEK293 cells.

Through the OUT （orthogonal ubiquitin transfer） pathway， we identified RCC2 （regulatory of chromosome condensation 2） as a potential substrate of E3 ubiquitin ligase CHIP. Here， we verified that CHIP can mediate the ubiquitination and degradation of RCC2 and provided a new direction for pharmacology research targeting RCC2. Methods We verified the interaction between CHIP and RCC2 by co-immunoprecipitation. We then examined RCC2 ubiquitination levels in HEK293 cells with knockdown or overexpression of CHIP. To determine if CHIP regulates the degradation of RCC2 by ubiquitination， we transiently transfected CHIP plasmids with titration into HEK293 cells and measured the steady-state levels of RCC2. We also conducted a CHX chase assay to investigate whether CHIP could induce the degradation of RCC2. Furthermore， we validated that CHIP can form K48- and K11- linked polyubiquitin chains on RCC2 by Ub mutants K48R-Ub and K11R-Ub. Results In HEK293 cells， CHIP can mediate the ubiquitination of RCC2. CHIP can form K48- and K11- linked polyubiquitin chains on RCC2 and promote its degradation. Conclusions Overall， our work uncovers an important mechanism underlying the regulation of RCC2 through CHIP-mediated ubiquitination and degradation.

Key words： ubiquitination;ubiquitin ligase CHIP;RCC2;degradation

泛素化是真核生物中一種廣泛存在且非常重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾過(guò)程，是在泛素活化酶E1、泛素結(jié)合酶E2、泛素連接酶E3的參與下，發(fā)生的連續(xù)多步的級(jí)聯(lián)反應(yīng)［1］。首先在ATP的參與下，被活化的泛素Ub C末端的甘氨酸殘基與泛素活化酶E1的半胱氨酸殘基形成高能硫脂鍵，然后泛素結(jié)合酶E2的半胱氨酸殘基進(jìn)攻高能硫脂鍵從而將泛素轉(zhuǎn)移到E2上，最后泛素連接酶E3將泛素傳遞到底物蛋白上，使底物蛋白泛素化［2］。泛素化能夠參與調(diào)控很多重要的生理過(guò)程，包括蛋白質(zhì)質(zhì)量調(diào)控、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等［1-2］。

迄今為止，在人類細(xì)胞中已有2種E1、50多種E2以及600多種E3被鑒定［3］。同一個(gè)E3能夠接收來(lái)自不同E2的泛素并與不同的底物結(jié)合，同一個(gè)底物也能被不同的E3泛素化調(diào)控。作為泛素化級(jí)聯(lián)過(guò)程的最后一個(gè)反應(yīng)關(guān)鍵酶，E3與細(xì)胞中成千上萬(wàn)個(gè)底物有著錯(cuò)綜復(fù)雜的對(duì)應(yīng)關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建了一種正交泛素傳遞途徑（Orthogonal Ubiquitin Transfer， OUT），能夠?qū)ふ壹?xì)胞中特定E3的底物［4］。在這種正交泛素傳遞途徑中，人工構(gòu)建的泛素（xUb）僅能通過(guò)人工構(gòu)建的xE1、xE2、xE3依次傳遞到特定E3的底物蛋白上。xUb上帶有可純化檢測(cè)的標(biāo)簽，后續(xù)可用來(lái)進(jìn)行質(zhì)譜及蛋白組學(xué)分析等實(shí)驗(yàn)，來(lái)檢測(cè)特定E3的潛在的底物蛋白。

泛素連接酶CHIP（carboxyl terminus of Hsc70/Hsp70-interacting protein，CHIP）又名STUB1，是U-box家族泛素連接酶的重要成員［5］。在結(jié)構(gòu)上，CHIP主要的活性結(jié)構(gòu)域是N端的四肽重復(fù)結(jié)構(gòu)域TPR結(jié)構(gòu)域和C端的U-box結(jié)構(gòu)域［6］。TPR結(jié)構(gòu)域主要發(fā)揮分子伴侶結(jié)合蛋白的功能，幫助CHIP與Hsp70和Hsp90等分子伴侶相互作用，C末端的U-box序列發(fā)揮泛素化連接酶E3功能。在功能上，CHIP與多種生理過(guò)程有關(guān)，大量臨床數(shù)據(jù)表明，CHIP與乳腺癌［7］、非小細(xì)胞肺癌［8］、胃癌［9］等癌癥相關(guān)，并且在很多時(shí)候扮演著抑癌因子。同時(shí)，CHIP通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)質(zhì)量控制過(guò)程，參與了很多蛋白質(zhì)錯(cuò)誤聚集和折疊過(guò)程，因此CHIP在一些神經(jīng)退行性疾病中也具有重要作用［10-11］。

實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，染色體濃縮調(diào)節(jié)蛋白2（Regulator of chromosome condensation 2，RCC2）可能是CHIP的潛在底物［12］。CHIP可能與RCC2有相互作用，并通過(guò)泛素化調(diào)控RCC2。因此，本文探究了在HEK293細(xì)胞中CHIP對(duì)RCC2的泛素化作用。首先驗(yàn)證了CHIP與RCC2的相互作用，然后通過(guò)CHIP敲減細(xì)胞株（shCHIP）、HEK293細(xì)胞株、CHIP過(guò)表達(dá)細(xì)胞株（OE CHIP）3組細(xì)胞系來(lái)檢測(cè)CHIP表達(dá)量是否與RCC2的泛素化水平相關(guān)。接下來(lái)通過(guò)CHX-chase穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)、泛素鏈類型研究等系列實(shí)驗(yàn)來(lái)證明CHIP與RCC2的泛素化作用。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在HEK293細(xì)胞中，CHIP可以在RCC2上形成K48和K11泛素鏈，并介導(dǎo)了RCC2的降解。

1 材料與方法

1.1 材料

人腎胚細(xì)胞HEK293細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，穩(wěn)定敲減CHIP的HEK293細(xì)胞株shCHIP由本課題組構(gòu)建保存；慢病毒載體pLVX-IRES-3FLAG由本課題組保存，DH5α感受態(tài)細(xì)胞由本課題組自制保存；胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、DMEM高糖培養(yǎng)基、Opti-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；anti-FLAG（M2）抗體（F1804）購(gòu)自Sigma-Aldrich公司、anti-CHIP抗體、anti-GAPDH抗體、anti-Ub抗體、anti-HA標(biāo)簽抗體、鼠源熒光二抗M800及兔源熒光二抗M800均購(gòu)自Abcam公司；anti-FLAG（M2） affinity gel（A2220） 購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。轉(zhuǎn)染試劑PEI購(gòu)自上海翌圣生物科技有限公司、RIPA裂解液（P0013J）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司、蛋白酶抑制劑PMSF（HY-B0496）和PIC（HY-K0010）、蛋白酶體抑制劑MG132（HY-13259）、蛋白合成抑制劑放線菌酮CHX（HY-12320）均購(gòu)自MCE公司。Gel/PCR純化提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒均購(gòu)自天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇及培養(yǎng)

從液氮罐中取出兩支凍存的HEK293細(xì)胞和穩(wěn)定敲減CHIP的穩(wěn)轉(zhuǎn)株（shCHIP），迅速放入37 ℃水浴鍋中加熱，約1～2 min后，絕大部分冰晶融化，迅速將凍存管進(jìn)行消毒處理后拿入生物安全柜，將細(xì)胞懸液吸出，加入一個(gè)有3～5 mL新鮮完全培養(yǎng)基的15 mL離心管中，800 rpm離心3 min。去除上清，加入2 mL新鮮完全培養(yǎng)基到離心管中重懸細(xì)胞沉淀，將細(xì)胞懸液加入到培養(yǎng)皿中，加入適量完全培養(yǎng)基，十字法交叉法混勻細(xì)胞，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，后續(xù)觀察細(xì)胞狀態(tài)。待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，匯合度約90%時(shí)，可進(jìn)行傳代操作。

1.2.2 HEK293細(xì)胞cDNA的獲取

取一個(gè)6 cm皿生長(zhǎng)狀態(tài)良好，匯合度約80～90%的HEK293細(xì)胞，去除培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS潤(rùn)洗幾次，洗去殘存的培養(yǎng)基。加入500 μL Trizol試劑，置于冰上孵育3～5 min，待細(xì)胞完全裂解后，加入100 μL氯仿，上下顛倒使其完全混勻，孵育2～3 min后，離心（4℃，12000 g，15 min），然后小心吸取上面的無(wú)色上清層至一個(gè)全新EP管中，加入250 μL異丙醇，孵育2～3min后，離心（4℃，12000 g，10 min）。去除上面的液體，加入500 μL 新鮮配制的75%乙醇，渦旋樣品，離心（4℃，7500 g，5 min）。棄掉上清，風(fēng)干5～10 min使RNA完全風(fēng)干，加入50 μL DEPC水溶解RNA。提取的RNA進(jìn)行測(cè)濃度、瓊脂糖電泳檢測(cè)其質(zhì)量。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA樣品。

1.2.3 目的基因的獲取

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到的目的基因RCC2的序列，結(jié)合載體pLVX-IRES-3FLAG的多克隆酶切位點(diǎn)信息，選擇兩個(gè)酶切位點(diǎn)NdeI和NotI，設(shè)計(jì)兩條引物，上游引物RCC2-F序列為：TACCTTCATATGCCCAGGAAGAAGGCGGC，下游引物RCC2-R序列為：ATCTTAAAGCGGCCGCGAGGGTTCGGGGGTTGTATT。PCR擴(kuò)增得到目的基因RCC2，通過(guò)Gel回收試劑盒回收目的基因。

1.2.4 載體和目的基因PCR產(chǎn)物的雙酶切及酶連

根據(jù)載體pLVX-IRES-3 FLAG和目的基因PCR產(chǎn)物的濃度，取出約1 μg的載體和約300 ng的PCR產(chǎn)物，用NdeI和NotI兩種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，雙酶切后的PCR產(chǎn)物和載體進(jìn)行膠回收。將回收得到的兩個(gè)酶切產(chǎn)物設(shè)置酶連反應(yīng)，然后用感受態(tài)細(xì)胞DH5α將酶連后的產(chǎn)物進(jìn)行化學(xué)轉(zhuǎn)化，取適量的菌液涂布在具有氨芐抗性的平板上，放入37℃細(xì)菌培養(yǎng)箱中進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)。第二天挑取平板上長(zhǎng)勢(shì)良好的單克隆進(jìn)行測(cè)序，最后得到序列正確的pLVX-RCC2-3 FLAG質(zhì)粒。

1.2.5 細(xì)胞鋪板及轉(zhuǎn)染

待生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞密度達(dá)到80%以上時(shí)可進(jìn)行下一步的鋪板操作。首先用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，根據(jù)培養(yǎng)皿的大小和所需的細(xì)胞密度計(jì)算鋪板量。12～16 h后觀察到鋪板的細(xì)胞均勻分布且密度達(dá)到70%～80%左右，可進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作。對(duì)于HEK293細(xì)胞可使用PEI轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，去除舊培養(yǎng)基，用PBS潤(rùn)洗2次，確保洗去大部分血清，更換為新鮮的Opti-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基。

配制PEI-DNA轉(zhuǎn)染混合物。A管加入一定量的質(zhì)粒，然后加入Opti-MEM培養(yǎng)基，B管加入3倍質(zhì)粒質(zhì)量的PEI，然后加入Opti-MEM培養(yǎng)基，兩管分別混勻后靜置5 min，將B管液體全部慢慢加入A管中，輕柔吹吸幾次混勻，靜置20～30 min后將全部液體緩慢滴加入培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)染12～18 h后更換為完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h后收樣，收樣前加入10 μmol·L-1蛋白酶體抑制劑MG132處理4 h。

1.2.6 細(xì)胞裂解液及樣品的制備

轉(zhuǎn)染48 h后，收取細(xì)胞。先用預(yù)冷的PBS潤(rùn)洗幾次，洗去舊培養(yǎng)基，然后新鮮配制適量的RIPA裂解液（按照1∶100的比例加入PIC、PMSF抑制劑），根據(jù)細(xì)胞密度加入適量的RIPA 裂解液。加入裂解液后，將培養(yǎng)皿放在冰上靜置2～5 min，觀察到有細(xì)胞碎片脫落時(shí)用細(xì)胞刮刀刮取，刮取充分后將裂解液吸入EP管中，將EP管放入冰盒中充分振蕩使其充分裂解。然后將EP管放入預(yù)冷的4 ℃離心機(jī)中離心20～30 min，離心后小心將上面的無(wú)色上清轉(zhuǎn)移至一個(gè)全新的EP管中。檢測(cè)樣品蛋白濃度后，將細(xì)胞裂解液制備成1～2 μg·μL-1的樣品，于99 ℃煮沸10 min，后續(xù)可進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。

1.2.7 CHIP和RCC2的相互作用

為了證明CHIP與RCC2是否有相互作用，用PCR的方式構(gòu)建了兩個(gè)CHIP的突變體：截短了TPR結(jié)構(gòu)域的突變體ΔTPR-CHIP和截短U-box結(jié)構(gòu)域的突變體ΔU-box-CHIP。并且在兩個(gè)突變體的C末端添加了His標(biāo)簽序列，便于后續(xù)的檢測(cè)。野生型CHIP 采用同樣的方法由實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建。

在HEK293細(xì)胞中分別共轉(zhuǎn)RCC2-FLAG和野生型CHIP及兩個(gè)突變體CHIP，然后通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)下拉RCC2-FLAG，用anti-His進(jìn)行檢測(cè)，觀察能否檢測(cè)到His信號(hào)，從而判斷CHIP與RCC2是否有相互作用。

1.2.8 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CHIP對(duì)RCC2的泛素化作用

為了檢測(cè)在HEK293中CHIP對(duì)RCC2是否有泛素化作用，設(shè)置穩(wěn)定CHIP敲減細(xì)胞株（shCHIP）、HEK293細(xì)胞株、CHIP過(guò)表達(dá)細(xì)胞株（OE CHIP）3組，3組轉(zhuǎn)染相同量的RCC2-FLAG質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后48h收樣，收樣前用10 μmol·L-1 MG132處理4h。收集細(xì)胞裂解液制備樣品進(jìn)行Western Blot檢測(cè)CHIP、RCC2及GAPDH表達(dá)量，確保RCC2表達(dá)量一致后，進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。根據(jù)蛋白濃度，每組配制總蛋白1 mg的樣品，通過(guò)anti-FLAG（M2） affinity gel進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，一般1個(gè)樣品需要10～15 μL總beads。取出beads后輕輕搖晃使其混勻，將槍頭減去尖端，吸取所需體積到EP管中，加入預(yù)冷的PBS，上下混勻后，離心（4 ℃、6 000 r·min-1，1 min），重復(fù)洗滌4次。每組樣品加入相同體積的beads，加好beads的樣品放入摩天輪搖床中，置于4 ℃結(jié)合4～6 h。結(jié)合好后每組樣品中加入預(yù)冷的TBS-T溶液洗滌beads，上下顛倒EP管以洗脫雜蛋白，離心（4 ℃、6 000 r·min-1，1 min），重復(fù)洗滌5次。最后加入PBS溶液洗滌，離心（4 ℃、6 000 r·min-1，1 min），小心吸去上清，防止吸到EP管底的beads，留40～60 μL液體，加入10～15 μL 5×loading配制樣品，置于99 ℃煮沸15 min，待樣品冷卻后離心，進(jìn)行Western Blot檢測(cè)通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)下拉富集蛋白的泛素化水平。

1.2.9 CHIP介導(dǎo)RCC2的降解及CHX-chase穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

為了進(jìn)一步證明CHIP介導(dǎo)RCC2的泛素化是否是降解作用，我們進(jìn)行了降解實(shí)驗(yàn)。在HEK293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染相同量的RCC2-FLAG及不同量的CHIP質(zhì)粒，CHIP的轉(zhuǎn)染量從0～2 μg梯度增加，檢測(cè)細(xì)胞中RCC2-FLAG的量。同時(shí)，使用放線菌酮CHX進(jìn)行蛋白質(zhì)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，放線菌酮CHX是一種抗真菌抗生素，能夠抑制真核生物中新蛋白質(zhì)合成，便于檢測(cè)細(xì)胞中已合成蛋白質(zhì)的去向。CHIP敲減細(xì)胞株（shCHIP）、HEK293細(xì)胞株、CHIP過(guò)表達(dá)細(xì)胞株（OE CHIP）3組細(xì)胞中轉(zhuǎn)染相同量的RCC2-FLAG，其余操作均相同，同時(shí)加入等量的放線菌酮CHX處理，檢測(cè)不同時(shí)間梯度的RCC2-FLAG的量。

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（責(zé)任編輯：編輯唐慧）

收稿日期：中文收稿日期2023-02-07

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31971187），上海市科委基礎(chǔ)研究領(lǐng)域項(xiàng)目（20JC1411200）

作者簡(jiǎn)介：李貝（1998—），女，碩士研究生，專業(yè)方向?yàn)榉核鼗瘷C(jī)理研究。

*通信作者：趙博（1980—），男，研究員，博士生導(dǎo)師，從事泛素化機(jī)理以及腫瘤免疫療法研究，e-mail：bozhao@sjtu.edu.cn。