馬慧　程文杰　賀君君　楊建發(fā)　鄒豐才　王開勝

摘要：目的 為了解云南省邊境地區(qū)肉牛弓形蟲感染的流行情況，分別從德宏傣族景頗族自治州、保山市、西雙版納傣族自治州等地區(qū)，共采集858頭肉牛組織樣品2 574份。方法 本研究分別提取其組織DNA，利用巢式PCR方法對弓形蟲SAG3基因進(jìn)行檢測，在此基礎(chǔ)上針對陽性DNA樣本SAG3基因開展了PCR-RFLP分型研究，初步確定了主要流行株的基因型。結(jié)果 該批組織樣品中有來自89頭牛呈弓形蟲SAG3基因陽性，弓形蟲總感染率為10.37%（89/858）。不同地區(qū)、不同品種肉牛之間弓形蟲感染率具有顯著的差異（P<0.05），其中，德宏地區(qū)的樣品均顯示為陰性，而保山、西雙版納地區(qū)的陽性率分別為0.33%（1/300，95% CI=0.00～0.99）、25.14%（88/350，95% CI=20.60～29.69）；不同品種中，黃牛感染率最高（23.73%）?；蚍中徒Y(jié)果顯示，云南省邊境地區(qū)肉牛感染為SAG3表面抗原Ⅰ型。結(jié)論 本研究通過對云南部分邊境地區(qū)的肉牛弓形蟲感染情況進(jìn)行調(diào)查，為云南邊境地區(qū)肉牛弓形蟲的流行病學(xué)研究提供參考數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞：云南邊境地區(qū)；肉牛；弓形蟲；流行病學(xué)調(diào)查；基因分型

中圖分類號：S858.23文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文獻(xiàn)標(biāo)識碼

Investigation and genotyping of Toxoplasma gondii infection in beef cattle

in Yunnan border areas

MA? Hui1，CHENG? Wenjie1，HE? Junjun1，YANG? Jianfa1，ZOU? Fengcai1，WANG? Kaisheng2*

（1 College of Veterinary Medicine， Yunnan Agricultural University， Kunming，Yunnan 650201， China; 2 College of Biology

and Pharmacy， Yulin Normal University， Yulin，Guangxi 537000， China）

Abstract： ?Objective In order to understand the prevalence of Toxoplasma gondii infection in beef cattle in Yunnan Province， 2574 tissue samples were collected from 858 beef cattle in Dehong Dai and Jingpo Autonomous Prefecture， Baoshan City and Xishuangbanna Dai Autonomous Prefecture. Methods DNA was extracted and SAG3 gene of T. gondii was amplified by nested PCR. PCR-RFLP gene typing was performed using DNA sample which was SAG3 gene positive. Results Showed that 134 samples were positive from 89 of 858 beef cattle were positive for SAG3 gene of T. gondii， and the total infection rate of T. gondii was 10.37% （89/858）. The infection rate of T. gondii was significantly different among beef cattle from different regions and breeds（P<0.05）. No T. gondii positive samples were found in Dehong， while the positive rates in Baoshan and Xishuangbanna were 0.33% （1/300， 95% CI=0.00-0.99） and 25.14% （88/350， 95% CI=20.60-29.69）， respectively. It was found that SAG3 gene of T. gondii in beef cattle in the border areas of Yunnan Province belong to genotype I. Conclusions The infection of T. gondii in beef cattle in the border areas of Yunnan Province was investigated in this study， this study provided reference data for the epidemiological study of T. gondii in beef cattle in Yunnan border areas.

Key words： Yunnan border area;beef cattle;Toxoplasma gondii;epidemiological survey;genotyping

弓形蟲（Toxoplasma gondii）主要寄生于人和動物真核細(xì)胞內(nèi)，是一種人畜共患胞內(nèi)寄生蟲，夏秋季為弓形蟲感染高發(fā)季［1］。弓形蟲病在全球廣泛流行，隱性感染為主，呈慢性經(jīng)過。當(dāng)宿主免疫力低下時，其會對被感染動物造成嚴(yán)重危害，致妊娠母畜流產(chǎn)或胎兒停止發(fā)育等。在牛弓形蟲病中，弓形蟲可能引發(fā)宿主嚴(yán)重貧血、高熱，生產(chǎn)性能降低等癥狀，從而使養(yǎng)牛業(yè)遭受巨大損失［2］。

弓形蟲病常導(dǎo)致人類的腦膜腦炎，同時，其可通過感染孕婦，進(jìn)一步感染胎盤，從而誘發(fā)胎兒出現(xiàn)免疫缺陷。研究顯示，人感染弓形蟲病可能是由于食用了未煮熟的肉或偶然攝入了貓糞便中的弓形蟲卵囊［3］。據(jù)報道，全球有些地區(qū)超過60%人口存在弓形蟲血清抗體［3］。我國牛弓形蟲病感染率為 0～52.2%［4］，且在華北地區(qū)廣為流行［3］；羊弓形蟲病感染率為 1.40%～29.86%［4］；豬弓形蟲病感染率可高達(dá) 7.19%～75.95%［5］。有報道顯示，云南邊境地區(qū)存在弓形蟲感染風(fēng)險［6-8］，但是云南邊境地區(qū)肉牛弓形蟲流行病學(xué)調(diào)查尚未見相關(guān)報道。

因此，為了明確云南邊境地區(qū)肉牛弓形蟲感染的最新情況，本研究擬通過對云南邊境地區(qū)牛弓形蟲的流行病學(xué)進(jìn)行調(diào)查，對采集的樣品弓形蟲基因型的分析，以期為云南邊境地區(qū)的弓形蟲病防治提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

2020年8～10月，分別從德宏傣族景頗族自治州、保山市、西雙版納傣族自治州的208、300和350頭（共計858頭）肉牛采集了共2574份肝、肺、淋巴結(jié)等組織樣品，并記錄相應(yīng)牛只的年齡、性別、品種等信息，將樣品裝于放有冰袋的泡沫箱中，帶回實驗室，置于4 ℃冰箱，保存待檢。

1.1.2 主要試劑

組織DNA提取試劑（北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品），Taq酶、dNTP等PCR所需試劑（大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品），Nci Ⅰ 限制性內(nèi)切酶（美國NEB公司產(chǎn)品）。

1.1.3 弓形蟲標(biāo)準(zhǔn)株DNA

弓形蟲標(biāo)準(zhǔn)對照株GT1、PTG、CTG株由朱興全教授在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所工作期間惠贈。

1.2 方法

1.2.1 SAG3基因巢式PCR檢測

1.2.1.1 巢式PCR擴(kuò)增引物

使用DNA提取試劑盒提取組織樣品DNA，根據(jù)弓形蟲SAG3序列特異性引物對所有樣品進(jìn)行檢測。引物由上海生工有限公司合成，其序列見表1。

1.2.1.2 巢式PCR擴(kuò)增體系及條件

PCR反應(yīng)體系為25.0 μL，其中ddH2O 16.5 μL，dNTP 2.0 μL，MgCl22.0 μL，10×PCR buffer（Mg2+free）2.5 μL，上下游引物各0.15 μL，Taq酶 0.2 μL，DNA模板1.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min 30 s，30個循環(huán);72 ℃終延伸7 min。擴(kuò)增結(jié)束后，使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.2.2 PCR-RFLP基因分型

1.2.2.1 巢式PCR擴(kuò)增引物

通過1.2.1中的方法檢測出的陽性樣品與標(biāo)準(zhǔn)對照株GT1、PTG、CTG株與SAG3基因進(jìn)行同時擴(kuò)增，其中SAG3基因巢式PCR引物見表1。

1.2.2.2 巢式PCR擴(kuò)增SAG3基因體系

PCR反應(yīng)體系為25.0 μL，其中10×buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，MgCl 2.0 μL，上下游引物各0.15 μL，DNA模板1.5 μL，Taq酶0.2 μL，ddH2O 16.5 μL。第一輪反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸 1 min 30 s，35個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。第二輪反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，59 ℃退火1 min，72 ℃延伸 1 min 30 s，35個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。擴(kuò)增結(jié)束后，使用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。

針對SAG3基因檢測結(jié)果為陽性的樣品切膠回收后，進(jìn)行PCR-RFLP分型分析，37 ℃酶切30 min。用相應(yīng)的內(nèi)切酶37 ℃金屬浴30 min，酶切體系為：內(nèi)切酶0.4 μL，Cutsmart buffer2 μL，PCR產(chǎn)物6 μL，ddH2O 11.6 μL，共計20 μL。酶切結(jié)束后，通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

將檢測數(shù)據(jù)輸入IBM SPSS Statistic 21，按品種、性別和區(qū)域進(jìn)行統(tǒng)計處理，分析品種、性別、區(qū)域等因素對肉牛弓形蟲感染的影響，并對SAG3基因分型PCR-RFLP結(jié)果綜合分析，從而系統(tǒng)了解云南省邊境地區(qū)肉牛弓形蟲病的流行狀況。

2 結(jié)果與分析

2.1 弓形蟲感染風(fēng)險因素分析

對來自德宏、保山、西雙版納三地區(qū)的858頭肉牛的共2 574份肝、肺、淋巴結(jié)等組織樣品進(jìn)行巢式PCR檢測，發(fā)現(xiàn)134份樣品陽性，擴(kuò)增出約225 bp的目的條帶（圖1），134份組織樣品分別屬于89頭牛，弓形蟲總感染率為10.37%（89/858）。

根據(jù)不同地區(qū)肉牛弓形蟲的檢測結(jié)果（表2）顯示：德宏地區(qū)的樣品均顯示為陰性，而保山、西雙版納地區(qū)的陽性率分別為0.33%（1/300，95% CI=0.00～0.99）、25.14%（88/350，95% CI=20.60～29.69），不同地區(qū)間弓形蟲感染率差異極顯著（χ2=138.72，df=2，P=0.00<0.01）。

不同品種肉牛弓形蟲感染情況顯示（表3），在4個品種的牛中，黃牛弓形蟲陽性率最高，為23.73%（70/295，95% CI=18.87～28.58）而瘤牛中未發(fā)現(xiàn)弓形蟲的感染，不同品種肉牛弓形蟲感染率差異極顯著（χ2=127.87，df=3，P=0.00）。

不同性別肉牛弓形蟲的檢測結(jié)果（表4）顯示，母牛弓形蟲陽性率16.7%高于公牛9.90%，但差異不顯著（χ2=2.612，df=1，P=0.106）。

2.2 PCR-RLFP基因分型結(jié)果

本研究對弓形蟲SAG3基因陽性的樣品進(jìn)行該基因擴(kuò)增，并進(jìn)行序列分析，將134份陽性PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果進(jìn)行Blast比對分析，結(jié)果顯示，134份樣品序列與登錄號為MH744785、MH744784、LC414532的序列相似性為100.0%。

針對弓形蟲SAG3位點(diǎn)進(jìn)行酶切，所有樣品經(jīng)酶切發(fā)現(xiàn)存在3個條帶，酶切位點(diǎn)位于65與127 bp，與Ⅰ型標(biāo)準(zhǔn)株GT1株相同（圖2）。

3 討論與結(jié)論

弓形蟲是一種寄生于細(xì)胞內(nèi)的單細(xì)胞原蟲，弓形蟲病在全球范圍均具有廣泛的流行性，對人類健康以及養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)造成嚴(yán)重危害。食用感染弓形蟲的畜禽是人感染弓形蟲的主要途徑，其中弓形蟲感染的牛肉是人弓形蟲病的重要感染源之一。

（1）肉牛弓形蟲流行情況分析。

對云南邊境地區(qū)肉牛弓形蟲的檢測數(shù)據(jù)顯示，其弓形蟲感染總陽性率為10.37%。同時，結(jié)合近五年國內(nèi)外有關(guān)弓形蟲的相關(guān)報道［9-12］，本研究發(fā)現(xiàn)西雙版納地區(qū)肉牛的弓形蟲陽性率高達(dá)25.14%，同國內(nèi)其它地區(qū)相比［13］，此次研究地區(qū)的感染率較高，風(fēng)險較大，值得警惕。而云南接壤國緬甸在之前進(jìn)行的研究中，分別報道了家養(yǎng)山羊（11.4%）、家豬（18.4%）和野生食蟲蝙蝠（29.3%）的弓形蟲感染，這表明這種感染在該國的家畜和野生動物中普遍存在［14］。邊境地區(qū)為跨國貿(mào)易往來頻繁區(qū)域，屠宰場部分生豬源于境外，因此要加強(qiáng)屠宰場豬肉的檢疫，防止境外弓形蟲傳入我國［8］

（2）肉牛弓形蟲感染風(fēng)險因素分析。

通過本研究發(fā)現(xiàn)在云南不同地區(qū)、品種、性別等因素對弓形蟲感染存在影響，其中地理因素對弓形蟲的陽性率存在顯著影響。本研究調(diào)查了云南德宏傣族景頗族自治州、保山市、西雙版納傣族自治州等多個地區(qū)牛弓形蟲感染情況，我們發(fā)現(xiàn)西雙版納地區(qū)陽性率明顯高于其他兩地區(qū)，根據(jù)顯著性結(jié)果分析可能與西雙版納部分地區(qū)少數(shù)民族遺有吃生肉的習(xí)慣有關(guān)，從而加快了弓形蟲的感染與傳播。該風(fēng)險因素與陳文承等［13］對湖南郴州市調(diào)查結(jié)果具有一致性。在不同品種肉牛弓形蟲感染調(diào)查中發(fā)現(xiàn)在4個品種的肉牛中，黃牛弓形蟲陽性率最高，不同品種肉牛弓形蟲感染率差異極顯著。

人和家畜等中間宿主、以及終末宿主貓的感染會增加肉牛感染弓形蟲的風(fēng)險［14］。家貓是弓形蟲的重要宿主，而且有報道稱人類弓形蟲血清陽性與弓形蟲陽性貓密切相關(guān)。全世界家貓中弓形蟲的血清陽性率估計約為30%～40%。與其他亞洲國家相比，我國家貓弓形蟲感染率高于日本（6%～16%）、泰國（11.0%）、馬來西亞（14.5%）、但低于新加坡（30.7%）、印度尼西亞（59.4%）、伊朗（63%）和越南（72.3%）［14］。期間，我們發(fā)現(xiàn)，相對于周邊地區(qū)，貓在調(diào)查區(qū)域數(shù)量較多，分布更廣，活動頻繁。目前雖暫未出現(xiàn)該地區(qū)關(guān)于貓感染弓形蟲的相關(guān)數(shù)據(jù)報道，但是根據(jù)國內(nèi)外弓形蟲流行風(fēng)險因素，我們推測弓形蟲感染率的差異與不同地區(qū)貓的弓形蟲感染率密切相關(guān)。除家貓外，大量流浪貓在全國范圍內(nèi)漫游，就像在其他國家一樣，這可能使弓形蟲在流浪貓中的感染和傳播更為普遍［14］。

（3）弓形蟲基因分型結(jié)果分析。

弓形蟲在全球分布廣泛，主要基因型包括Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型。不同基因型的毒力不同，其毒力因受到毒力蛋白多態(tài)性的影響［15］。通過對基因型分析，可以了解該地區(qū)弓形蟲毒力以及傳播途徑，并且給出針對性的防治措施。國內(nèi)目前尚無關(guān)于云南邊境肉牛弓形蟲基因分型相關(guān)報道。本研究針對SAG3基因檢測結(jié)果為陽性的樣品進(jìn)行PCR-RFLP分型分析。PCR-RFLP技術(shù)首先通過對目的基因擴(kuò)增，然后利用特異性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生不同大小的片段。目前，該技術(shù)已在弓形蟲基因分型上被廣為應(yīng)用［16］。本研究中的弓形蟲陽性樣品均可以擴(kuò)增出SAG3基因片段，針對弓形蟲SAG3位點(diǎn)進(jìn)行酶切，酶切位點(diǎn)位于65與127 bp。酶切結(jié)果與Ⅰ型標(biāo)準(zhǔn)株GT1株的酶切結(jié)果相同，故本研究鑒定到的弓形蟲為SAG3基因Ⅰ型，研究結(jié)果與泰安市商品性雞產(chǎn)品弓形蟲感染情況調(diào)查及基因分型的研究［17］以及云南省家禽弓形蟲感染的流行病學(xué)調(diào)查及基因分型結(jié)果［18］一致。根據(jù)弓形蟲數(shù)據(jù)庫現(xiàn)有數(shù)據(jù)，本次研究可能還有其他基因型尚未檢測到，因此，今后將擴(kuò)大采樣范圍和增加樣品數(shù)量，進(jìn)行更深入分析。

3.4 結(jié)論

本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，云南邊境的西雙版納地區(qū)肉牛弓形蟲感染陽性率（25.14%）偏高，是人畜感染的基因型，具有感染人的風(fēng)險；同時，貓作為其終末宿主，其數(shù)量的增加及其活動范圍增大，加大了弓形蟲對人畜感染的風(fēng)險。因此，今后研究將進(jìn)一步擴(kuò)大采樣的范圍及數(shù)量，并對邊境地區(qū)的貓進(jìn)行弓形蟲的流行病學(xué)調(diào)查，同時還需要重點(diǎn)關(guān)注和檢測云南邊境地區(qū)的肉牛弓形蟲流行病學(xué)的動態(tài)變化，如邊境海關(guān)加強(qiáng)對跨境肉牛的檢驗檢疫，另外，有必要同接壤的相關(guān)國家的學(xué)者進(jìn)行國際合作，進(jìn)行相關(guān)研究，從而降低人畜感染風(fēng)險。

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（責(zé)任編輯：編輯唐慧）

收稿日期：2022-09-18

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（跨境肉牛弓形蟲相關(guān)研究）（32260889）

作者簡介：馬慧（1998—），女，碩士研究生，專業(yè)方向為動物寄生蟲學(xué)研究。

*通信作者：王開勝（1974—），男，副教授，從事分子遺傳與動物育種研究，e-mail：wks@ylu.edu.cn。