黃天晴，董福霖,2，劉恩慧，徐革鋒，王高超，姚作春，王炳謙，谷偉

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)生物技術(shù)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150070；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 200120）

近年來，隨著全球變暖養(yǎng)殖水體溫度升高，對魚類的熱應(yīng)激日愈增加。水溫是水產(chǎn)養(yǎng)殖中最關(guān)鍵的環(huán)境因素之一，而日?；蚣竟?jié)性熱波動(dòng)和培養(yǎng)水溫的變化顯著影響魚的生長。水產(chǎn)養(yǎng)殖中高溫脅迫造成魚體疾病爆發(fā)頻率升高、代謝及免疫能力下降等一系列危害，直接影響?zhàn)B殖的經(jīng)濟(jì)效益。本文綜述了熱應(yīng)激對魚類生命活動(dòng)影響的最新研究成果，包括代謝與生長、抗氧化能力以及熱休克蛋白等，以期為魚類生產(chǎn)實(shí)踐及相關(guān)生理生態(tài)研究提供參。

1 應(yīng)激

1.1 應(yīng)激的概念

1936 年加拿大麥吉爾大學(xué)的病理學(xué)家Hans Selye 首次提出[1]：應(yīng)激是生物在長期進(jìn)化過程中產(chǎn)生的適應(yīng)性和保護(hù)性的機(jī)制，主要作用是維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)。機(jī)體對應(yīng)激有一定的適應(yīng)范圍，刺激超出這個(gè)范圍時(shí)，機(jī)體的穩(wěn)態(tài)就會被破壞[2]，長期或者過度的刺激對機(jī)體的生理[3]和心理[4]產(chǎn)生不利影響。達(dá)到一定的強(qiáng)度，引起機(jī)體非特異性應(yīng)答反應(yīng)的刺激稱之為應(yīng)激源[2]。按照應(yīng)激源的性質(zhì)，水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)激源可分為三大類：管理脅迫、物理脅迫以及生物脅迫。其中管理脅迫包括養(yǎng)殖病害處理、運(yùn)輸、性別分選、捕捉、分池和養(yǎng)殖的不當(dāng)操作[5]等。物理脅迫包括鹽度、氨氮、pH、光照以及溫度等。生物脅迫包括病原生物的入侵以及擁擠等[6]。

1.2 應(yīng)激的種類

目前，對魚類應(yīng)激反應(yīng)的研究已十分深入和廣泛。根據(jù)反應(yīng)發(fā)生的組織水平，生理應(yīng)激反應(yīng)分為初級、二級和三級應(yīng)激反應(yīng)[7]。初級應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生在機(jī)體內(nèi)分泌系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)水平上。它是在應(yīng)激源刺激機(jī)體后立即出現(xiàn)的反應(yīng)。與哺乳動(dòng)物相似，魚類包括兩個(gè)應(yīng)激激素反應(yīng)系統(tǒng)：交感—腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)和下丘腦—垂體—腎間組織軸[8]。當(dāng)魚類受到應(yīng)激時(shí)，首先激活交感—腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)。該系統(tǒng)合成和分泌大量去甲腎上腺素。其次，也會激活下丘腦—垂體—腎間組織軸，促進(jìn)皮質(zhì)醇的合成與分泌，腎上腺激素和皮質(zhì)醇分別通過擴(kuò)散作用和血液流動(dòng)作用于靶器官或靶組織，引起一系列的代謝和生理變化，起到特定的生物學(xué)功能[9]。刺激反應(yīng)是應(yīng)激激素調(diào)控的生理生化以及免疫過程，包括呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、能量代謝以及電解質(zhì)平衡等生物學(xué)功能的改變。三級應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生在二級應(yīng)激反應(yīng)的基礎(chǔ)上，是魚類個(gè)體或群體水平上的變化，魚體適應(yīng)了應(yīng)激源或隨著應(yīng)激水平的提升發(fā)生了抗病能力、繁殖能力以及生長能力的變化[5]。

1.3 熱應(yīng)激

熱應(yīng)激是高溫下，機(jī)體對熱刺激所做的一系列非特異性生理反應(yīng)的總和[10]。魚類都是變溫動(dòng)物，溫度是影響魚類生存的重要環(huán)境因素。它可以影響魚類的代謝率、生長率以及攝食率等[11]。熱應(yīng)激的影響增加了水產(chǎn)養(yǎng)殖的困難，研究熱應(yīng)激對魚類的影響十分必要。

2 熱應(yīng)激對魚類的影響

2.1 熱應(yīng)激對魚類代謝與生長的影響

溫度是顯著影響魚類生長發(fā)育的重要因素之一。大多數(shù)魚都是水生變溫動(dòng)物，無法靠自身獲取穩(wěn)定的熱量；體表和鰓不停地與外界進(jìn)行熱量交換，無法保持與外界水溫不同，所以，溫度就成為影響魚類生長發(fā)育和代謝的重要因素之一[12]。水溫還通過影響環(huán)境中其他生物的生長和物質(zhì)能量循環(huán)來影響魚類的生長發(fā)育和代謝[10,13]。

水溫過高或過低都會影響魚類的正常生長。在最適溫度范圍內(nèi)，魚類的攝食率和生長率隨水溫的升高而升高，當(dāng)溫度超過了生存上限溫度后，生長率就開始下降，甚至大量死亡。魚類的生長速度依賴于攝食量及魚類活動(dòng)代謝和基礎(chǔ)代謝后的剩余能量[14]。徐冬冬等[15]研究表明，對褐牙鲆（Paralichthys olivaceus）的最適生長溫度為25℃，當(dāng)超過此溫度時(shí)，褐牙鲆的特定生長率與攝食率開始下降，并與水溫的平方呈顯著的負(fù)相關(guān)，即特定生長率和攝食率隨水溫的升高而下降。

消化酶活性是反映魚類消化生理機(jī)能的重要指標(biāo)之一。熱應(yīng)激使美洲鰣（Alosa sapidissima）消化酶活性降低，影響魚體的代謝速率[16]。而徐奇友[17]的研究表明，水溫不僅直接影響消化酶的活性，還間接地通過影響魚類消化酶的分泌量、體內(nèi)離子含量等來影響魚類消化酶的活性。在10℃～40℃內(nèi)，大黃魚（Larimichthys crocea）除了前腸外，肝臟、胰臟、胃以及后腸中蛋白酶的活性均先上升、后下降[18]。

在適宜溫度范圍內(nèi)，魚類的代謝速率也隨溫度的升高逐漸上升[19]。這是因?yàn)樵谒疁厣叩倪^程中，維持魚體生命活動(dòng)的各種代謝酶活性、呼吸頻率[20]增強(qiáng)，新陳代謝加快，代謝速率上升[21]。在陳婉情等對花斑刺鰓鮨（Plectropomus leopardus）、駝背鱸（Chromileptes altivelis）、棕點(diǎn)石斑魚（Epinephelus fuscoguttatus）等五種海水養(yǎng)殖魚類的研究發(fā)現(xiàn)，雖然對溫度變化的敏感性不一致，但是五種魚類的呼吸頻率均隨著水溫的升高而升高[22]。

2.2 熱應(yīng)激下魚類血液指標(biāo)變化

魚類的血液生理指標(biāo)與魚類的營養(yǎng)狀況、代謝以及疾病密切相關(guān)。當(dāng)魚體受到外界應(yīng)激源刺激發(fā)生生理變化時(shí)，就會從血液生理指標(biāo)上反映出來[23]。在不同的環(huán)境溫度下，血液生理指標(biāo)可以反映組織器官的功能狀態(tài)、代謝以及魚類的健康狀況和對環(huán)境的適應(yīng)性[13]。

血細(xì)胞在血液中數(shù)量最多，是魚體內(nèi)運(yùn)輸氧氣等物質(zhì)的最主要媒介。血液中紅細(xì)胞的數(shù)量受多種因素的影響，但Collazos 等[24]研究表明，水溫是影響魚類體內(nèi)紅細(xì)胞數(shù)量最主要的因素。管標(biāo)[25]研究表明，虹鱒（Oncorhynchus mykiss）急性熱應(yīng)激后0 h 和6 h 時(shí)，血液中紅細(xì)胞的數(shù)量明顯低于對照組，直到熱應(yīng)激48 h 后，紅細(xì)胞數(shù)量才恢復(fù)正常。

血清當(dāng)中含有白蛋白和球蛋白，二者合稱總蛋白。血清總蛋白主要起維持血漿pH 和滲透壓平衡、運(yùn)輸、凝血、供應(yīng)能量以及免疫等功能[26]。何福林等[28]研究中發(fā)現(xiàn)，虹鱒血液中總蛋白的含量隨溫度升高而升高，而鳙（Hypophthalmichthys nobilis）的總蛋白在23℃時(shí)大幅度減少[27]。溫度對羅非魚（Oreochromis mossambicus）血液中總蛋白含量影響不顯著，說明了魚類血液中總蛋白的含量是否受溫度影響與魚的種類有關(guān)。

正常情況下，谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）主要存在于各種細(xì)胞中，特別是心臟和肝臟中，只有少量在血液中，在脂肪、蛋白質(zhì)、糖類三大物質(zhì)循環(huán)中起重要作用。魚受到刺激時(shí)，兩種酶被釋放到血液中，影響魚類。夏斌鵬等[23]對虹鱒研究顯示，AST 和ALT 在26℃時(shí)活性顯著高于18℃。在冀德偉等[29]對大黃魚的研究中也發(fā)現(xiàn)了AST 和ALT活性隨溫度升高而升高的現(xiàn)象。

2.3 熱應(yīng)激對魚類抗氧化能力的影響

在正常狀況下，魚類體內(nèi)活性氧（ROS）的濃度會保持在一定的范圍內(nèi)，當(dāng)魚類受到溫度應(yīng)激時(shí)，ROS 產(chǎn)量增加，進(jìn)一步產(chǎn)生過量脂質(zhì)過氧化物（LPO），損傷膜和酶活性，影響細(xì)胞活性，加速細(xì)胞衰老、核酸和蛋白質(zhì)的凋亡和氧化，進(jìn)一步傷害魚體[30]。魚體內(nèi)存在兩種消除過多ROS 的途徑：酶聯(lián)通路和非酶聯(lián)通路。前者涉及到多種抗氧化酶，例如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等，以減少魚類體內(nèi)氧化代謝時(shí)產(chǎn)生的多余ROS[30]。

在熱應(yīng)激期間，吉富羅非魚（Oreochromis mossambicus）、牙鲆、大菱鲆（Scophthalmus maximus）、虹鱒和硬頭鱒等多種魚的抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px活性均表現(xiàn)出不同程度的升高，對熱應(yīng)激做出應(yīng)答，以防治氧化損傷。

2.4 熱應(yīng)激下魚類熱休克蛋白（HSP）的表達(dá)變化

熱休克蛋白（HSP）是一類在多種生物和非生物應(yīng)激源作用下表達(dá)的蛋白質(zhì)家族，也被稱為應(yīng)激蛋白[32]。主要的熱休克蛋白分子質(zhì)量在15～110 kDa之間，依大小和功能被分成不同的家族[33]。對模式物種的廣泛研究揭示了熱休克蛋白的三個(gè)主要家族：熱休克蛋白90（85～90 kDa）、熱休克蛋白70（68～73 kDa）和低分子量熱休克蛋白（16～47 kDa）[34]。

HSP70 家族蛋白質(zhì)功能至關(guān)重要，包括折疊、細(xì)胞內(nèi)定位、調(diào)節(jié)、分泌和蛋白質(zhì)降解等[35]，研究得最廣。HSP70 是最保守的熱休克蛋白家族之一，在所有被研究的細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)了它，不同生物間的氨基酸序列同一性值在42%～57%之間[36]。目前已克隆和測序了多種魚類的HSP70 的基因序列，包括大黃魚[37]、虹鱒[38]、團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala）[39]、羅非魚[40]以及鯉（Cyprinus carpio）[41]等。自被發(fā)現(xiàn)以來，熱應(yīng)激后魚類HSP70 的表達(dá)一直是其研究的熱點(diǎn)。強(qiáng)俊等[42]發(fā)現(xiàn)，溫度顯著影響羅非魚肝臟HSP70 的表達(dá)水平。在35℃下，HSP70 的表達(dá)呈先上升后下降的趨勢，在熱應(yīng)激后12 h HSP70 的表達(dá)最高。柳意樊等[43]比較了大菱鲆在熱應(yīng)激后不同組織中HSP70 的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)與最初水平相比較，各組織中的HSP70 的表達(dá)水平均上調(diào)，肌肉中上調(diào)最高，其次是肝、腸、鰓、心、脾、胃、腎和腦。同樣，Wang 等[44]對鯉熱應(yīng)激的研究中發(fā)現(xiàn)，輕度和中度熱應(yīng)激都會導(dǎo)致心臟和腎臟中HSP70 表達(dá)上調(diào)，也呈現(xiàn)出了先上升后下降的趨勢，這與強(qiáng)俊等對羅非魚的研究相一致。

對魚類HSP90 的研究晚于對HSP70 的研究，直到2008 年才證實(shí)魚類HSP90 中存在HSP 90α和HSP90β 兩種構(gòu)型[45]。HSP90 是一種豐富的分子伴侶，參與真核細(xì)胞的細(xì)胞保護(hù)。在非應(yīng)激下，它占總蛋白質(zhì)的1%～2%[46]。HSP90α 是HSP90 的誘導(dǎo)形式，它折疊、穩(wěn)定并調(diào)節(jié)許多細(xì)胞蛋白的功能[47]。HSP90β 具有廣泛的伴侶功能，是真核細(xì)胞中表達(dá)量最高的熱休克蛋白[48]。Moon-Kyeong Shin 等研究發(fā)現(xiàn)，斑點(diǎn)鱸的熱應(yīng)激HSP90α 在肝臟、肌肉以及鰓組織中的表達(dá)量均隨水溫的升高和暴露時(shí)間的延長而增加[49]。而虹鱒中的HSP90β 表達(dá)在非應(yīng)激組的腦、肝和心臟的基礎(chǔ)表達(dá)水平明顯高于其他組織，熱應(yīng)激12 h 后，心臟、頭腎、腦和鰓的HSP90β水平分別是非應(yīng)激組的4.76 倍、4.03 倍、3.08 倍和2.70 倍[48]。

2.5 熱應(yīng)激對魚類免疫的影響

魚具有完整的非特異性和特異性免疫能力[20]，可以通過黏膜屏障、血液和組織中各種免疫因子和細(xì)胞協(xié)同抵御外來病原體的侵害[50]。在各種免疫應(yīng)答中，溶菌酶是魚類中至關(guān)重要的非特異性免疫參數(shù)。溶菌酶活性受溫度、應(yīng)激和毒物的刺激[51]。吞噬作用也是一種主要的非特異性免疫應(yīng)答。它將大顆粒吞噬入細(xì)胞液泡內(nèi)以除去病原微生物，是評價(jià)魚類健康狀況和免疫能力的主要免疫學(xué)指標(biāo)[52]。

羅非魚在持續(xù)的高溫刺激下，溶菌酶的活性顯著低于對照組[53]。在24℃、25℃時(shí)，虹鱒溶菌酶的活性也顯著低于18～23℃時(shí)[23]。半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）在27℃應(yīng)激96 h 后，溶菌酶的活性上升[54]，說明溶菌酶同其他的酶相似，在一定的溫度范圍內(nèi)，活性隨溫度升高而增強(qiáng)，當(dāng)溫度超過上限時(shí)，機(jī)體受到破壞，溶菌酶活性下降。

3 小結(jié)

水溫影響水產(chǎn)養(yǎng)殖中魚類生命活動(dòng)的各個(gè)方面，水溫過時(shí)，魚類生長率和代謝速率下降，甚至?xí)劳?，最終影響魚類的產(chǎn)量。過高的水溫還會導(dǎo)致魚體內(nèi)熱休克蛋白量增加以及免疫能力的下降。因此在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中要嚴(yán)格調(diào)控水溫，避免對魚體造成刺激，保證最終的經(jīng)濟(jì)收益。