姜曉娜，賈智英

（中國水產(chǎn)科學研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)生物技術與遺傳育種重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076）

在魚類中，病毒感染會引起許多宿主基因的表達，進而使機體對病毒產(chǎn)生抗性免疫反應，干擾素（interferon regulatory factor,IFN）是魚體受到病毒感染或細菌等因素下在受體細胞迅速反應并產(chǎn)生的一種具有高生物活性的糖蛋白[1]。IFN 與其同源受體（interferon regulatory factor receptor,IFNR）結合激活Jak-STAT 信號通路，Jak-STAT 信號轉導促進干擾素刺激基因（Interferon-stimulated genes,ISG）與多種ISG 的IFN 激活調(diào)控元件（interferon stimulation reaction element,ISRE）結合，進而誘導多種抗病毒基因的表達[2]，抑制病毒mRNA 翻譯，增加宿主細胞的抵抗力，在機體抗病毒免疫應答中起重要作用[3]。干擾素調(diào)控因子（interferon regulatory factor,IRF）作為參與IFN 抗病毒免疫反應中的重要轉錄調(diào)節(jié)因子，啟動IFN 的轉錄表達[4]。

1 IRF 家族

1988 年，IRF1（Homo sapiens）作為IRF 家族的第一個成員被發(fā)現(xiàn)，確定其具有啟動IFN 轉錄表達的作用[5]。迄今為止，脊椎動物鑒定出11 個IRF 家族成員，包括IRF1-11[6]，其中IRF10 為魚類和鳥類中特有，而IRF11 為硬骨魚特有[7,8]。根據(jù)C 端結構特征和系統(tǒng)發(fā)育分析，IRF 家族可分為四個亞家族：IRF1 亞家族（包含IRF1、IRF2 和IRF11）、IRF3 亞家族（IRF3 和IRF7）、IRF4 亞家族（IRF4、IRF8、IRF9 和IRF10）和IRF5 亞家族（IRF5 和IRF6），表明了IRF 家族基因在進化過程中的功能多樣性。IRF 家族成員是魚類先天抗病毒反應的主要調(diào)節(jié)因子，主要參與IFN 和ISG 的轉錄表達[9]。IRF 家族蛋白結構均含有一個高度保守的N 端DNA 結構域（DNA binding domain,DBD）和一個C 端IRF 相關結構域（IRF-associated domain,IAD）。DBD 具有5或6 個色氨酸重復元件的特征，可形成螺旋-轉角-螺旋結構，使IRF 蛋白能夠識別并結合在ISRE基因的啟動子中[10]。IAD 目前確定具有IAD1 和IAD2 兩種類型，其中IAD1 存在于所有IRF 中，IAD2 存在僅存在于IRF1 和IRF2 中[11]。IAD 保守性較低，能夠與其他IRF 成員相互作用形成轉錄復合物，激活每個IRF 成員特定的生物活性，調(diào)控不同IFN 或ISG 的轉錄表達[10]。

2 IRF 的抗病毒作用

2.1 IRF1 亞家族

IRF1 亞家族包括IRF1、IRF2、IRF11，其 中IRF1 為IRF 家族中最初定義為調(diào)控IFN 轉錄表達的調(diào)控因子[5]。IRF1、IRF2 和IRF11 在魚類組織呈現(xiàn)組成型表達[12-15]。研究發(fā)現(xiàn)哺乳動物和硬骨魚類的主要先天免疫信號通路是相對保守的，在斑馬魚中發(fā)現(xiàn)參與先天免疫反應的IRF1、IRF2 和IRF11基因，其中IRF11 與IRF1 和IRF2 的遺傳距離相等[5]。硬骨魚類中IRF1、IRF2 和IRF11 均含有5 或6 個高度保守的色氨酸殘基（NH2-X10-W-X14-WX11-W-X7-W-X11-W-18-W）[14]。此外，發(fā)現(xiàn)魚類中IRF1 基因和IRF11 基因均與IFN 基因啟動子的同一段DNA 序列結合，但結合偏好性有所不同[8,16]。IRF2 蛋白結構中IAD2 中的含有一個IRF1 蛋白不具有的反式激活域，以上均導致了IRF1、IRF2 和IRF11 的功能多樣性。

魚類中IRF1、IRF2 和IRF11 的表達調(diào)控及抗病毒作用機制存在差異。魚類中IRF1 是抗病毒反應調(diào)控IFN 轉錄表達的正調(diào)節(jié)因子[16]，受到病毒、poly（I:C）刺激后能誘導IFN 及ISG 的轉錄表達[6,14,16,17]，在虹鱒（Salmo playtcephalus）中還確定了IRF1a 的存在[18]。但魚類IRF2 對病毒的抗性調(diào)節(jié)有所不同，鯉（Cyprinus carpio）受嗜水氣單胞菌和poly（I:C）刺激后IRF2 基因能夠抑制IFN 基因和ISG 基因的表達，但能夠激活NF-κB 信號通路并促進MyD88 介導和β 干擾素TIR 結構域銜接蛋白（TIRdomain-containing adoptor inducing interfere-β，TRIF）介導的NF-κB 產(chǎn)生[12]。草魚（Ctenopharyngodon idella）中IRF2 能夠與IFN 的啟動子結合下調(diào)IFN的轉錄活性[19]。然而IRF2 在卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）中正調(diào)控IFNa3 和IFNγ 的轉錄表達[20]。在大黃魚（Larimichthys crocea）中IRF2 能夠既誘導IFNd 和IFNh 啟動子活性，又抑制IFNc 啟動子活性，能夠抑制上皮細胞中鯉春病毒血癥病毒（infection with Spring Viraemia of Carp Virus,SVCV）的復制[21]。魚類IRF11 是I 型IFN 的正調(diào)節(jié)因子，能夠在培養(yǎng)魚細胞中建立抗病毒狀態(tài)以抵抗病毒感染[8]，曾因與IRF1 高度同源被錯誤地認為是IRF1[22]，斑馬魚（Danio rerio）和翹嘴鱖（Siniperca chuatsi）中發(fā)現(xiàn)IRF11 能通過正調(diào)控IFN 或ISGs 基因的轉錄表達發(fā)揮抗病毒作用[8,22]。此外，魚類中IRF1 和IRF2 和IRF11 除單獨發(fā)揮抗病毒作用外，也互相協(xié)同或拮抗來調(diào)控IFN 或ISG 的轉錄表達進而使機體產(chǎn)生抗病毒免疫反應。大西洋鮭（Salmo salar）和草魚中均確定IRF2 能通過與IRF1 拮抗作用來作為IFN 和ISG 的負調(diào)控因子[19]。斑馬魚中IRF1 基因在病毒感染和poly（I:C）刺激后的表達倍增水平高于IRF11 基因，IFNγ 能夠誘導IRF1 基因的表達而與IRF11 基因的表達及啟動子活性無關[8,16]。

2.2 IRF3 亞家族

IRF3 亞家族包括IRF3 和IRF7，IRF3 和IRF7被作為是病毒感染細胞的主要調(diào)節(jié)因子，參與機體抗病毒防御反應[23]，因此在魚類中IRF3 和IRF7 的相關機制研究較為廣泛。目前IRF3 和IRF7 基因已在多種魚類中得到驗證，且均在組織呈現(xiàn)組成型表達[24,25]。IRF3 和IRF7 均包含三個結構域，分別為N端DBD、C 端IAD 和富含絲氨酸的結構域（serine-rich domain,SRD），IAD 參與除IRF1 和IRF2 外的其他IRF 的交互作用，DBD 是負責與IRF 元件結合的核心部位，IRF3 和IRF7 的結構域通過與基因調(diào)控區(qū)內(nèi)的DNA 序列相互作用以調(diào)控自身轉錄[26]。此外，研究發(fā)現(xiàn)虹鱒IRF3 的DBD 區(qū)域包含五種色氨酸，但IRF7 僅含有4 種，且IRF3 主要存在于細胞質(zhì)中并被病毒、ploy（I：C）和脂多糖（Liposome,LPS）激活，而IRF7 僅能被病毒激活[27-29]。在機體受病毒感染后，模式識別受體（Pattern recognition receptor,PRR）啟動信號轉導并激活Tank 結合激酶1（TANK binding kinase 1,TBK1）來磷酸化IRF3 和IRF7 蛋白C 端富含絲氨酸區(qū)域的絲氨酸或蘇氨酸殘基，隨后磷酸化的IRF3 進入細胞核并介導IFN-α 和IFN-β以及其他IFN 誘導基因的轉錄[30,31]。

魚類和哺乳動物共享相同或相似的IFN 激活信號通路，IRF3 和IRF7 是機體應對可變致病性感染的信號級聯(lián)的核心參與者，對IFN 轉錄表達調(diào)節(jié)起關鍵作用[32]。大西洋鮭中髓樣分化因子（myeloiddifferentiationfactor88,MyD88）與IRF3 相互作用正向調(diào)節(jié)IFN 轉錄表達[33]。大黃魚中IRF3 能夠減弱核因子kappaB 抑制蛋白（nuclear factor kappa-B,IκBα 對核因子（nuclear factor kappa-B,NF-κB）活化的抑制作用[34]。病原體誘導宿主IRF3 表達正向調(diào)節(jié)MyD88 介導硬骨魚NF-κB 信號通路轉導[35]。然而趙雪妍等發(fā)現(xiàn)IRF3 在硬骨魚中負調(diào)控TRIF 介導的NF-κB 信號通路[36]。鯽（Carassius auratus）和斑馬魚受病毒感染后IRF7 基因參與IFN基因轉錄表達及磷酸化反應過程，是機體抗病毒反應的主要調(diào)控因子[37,38]。當細胞受到病毒感染后，IRF7 基因啟動IFNI 基因的轉錄并誘導ISG 基因表達以保護細胞免受病毒感染[28]。研究發(fā)現(xiàn)青魚（Mylopharyngodon piceus）受到草魚呼腸孤病毒（Grass Carp Reovirus,GCRV）和SVCV 感染后IRF3/7 基因在機體抗病毒免疫反應中發(fā)揮至關重要的作用[39]。IRF3/7 基因在尖吻鱸（Lates calcarifer）和虹鱒中均發(fā)現(xiàn)能夠誘導IFN、ISGs 基因和促炎因子的表達，在IFN 介導的抗病毒免疫反應中的發(fā)揮重要作用[ 40 ]。

2.3 IRF4 亞家族

IRF4 亞家族包括IRF4、IRF8、IRF9 和IRF10。目前IRF4、IRF8、IRF9 和IRF10 基因已在多種硬骨魚中被克隆完成[41]。硬骨魚中IRF4、IRF8、IRF9 和IRF10 在組織中呈現(xiàn)組成型表達，且主要在富含淋巴細胞的組織中高表達[41,42]，IRF4 和IRF8、IRF9 和IRF10 蛋白均含有DBD 和IAD，不同的是除IRF10外，均含有一或兩個核定位信號（nuclea rlocalization signal,NLS），這些信號與IRF 在末端區(qū)域的核易位和保留有關[43]。IRF4 和IRF8 和IRF10 的DBD 區(qū)域均含有5 個色氨酸殘基，但IRF9 只有三個。IRF4 對靶基因轉錄調(diào)控和識別是通過形成與其他蛋白質(zhì)或轉錄因子相互作用的二聚體來定義的[44]，IRF4 在進化上存在明顯的差異，該蛋白中富含絲氨酸的結構域目前僅在斑馬魚、河豚（Tetraodontidae）、青鳉（Oryzias latipes）、斑石鯛（Oplegnathuspunctatus）和斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）中存在，而在非洲爪蟾（Xenopus laevis）、虹鱒和亞洲沼澤鰻（Monopterus albus）中不存在。IRF8 通常與識別靶基因啟動子中的Ets-IRF-E 復合元件（ETS-IRF-E composite element,EICE）的Ets 家族成員PU.1/Spi-1相互作用以發(fā)揮其轉錄調(diào)節(jié)作用[45]。IRF9 能夠與信號轉導與轉錄激活因子1 和2（signal transducer and activator of transcription,STAT1-STAT2）異二聚體的結合后加強對ISRE 的特異性識別[46]，IRF10 蛋白結構在硬骨魚中相對保守，其中DBD 結構是IRF10發(fā)揮功能是不可或缺的[47]。

IRF4 和IRF8 在硬骨魚中能夠被poly（I:C）、LPS 和各種細菌和病毒誘導，參與機體抗病毒免疫反應，最近研究發(fā)現(xiàn)IRF4 在斑馬魚、河豚和青鳉中存在兩個IRF4 旁系物（IRF4a 和IRF4b），受到GCRV 和SVCV 刺激后表達水平顯著提高[41]。卵形鯧鲹IRF8 基因能夠在體外上調(diào)IFNr 基因的表達[48]。草魚IRF8 基因下調(diào)IFN1 基因的表達[49]，（Miichthys miiuy）IRF8 基因下調(diào)MyD88 和MyD88介導的NF-κB 信號通路的表達，以防止體外過度免疫損傷[33]。在病毒微生物入侵鯽時，宿主中IFNs誘導STAT1 與IRF9 形成ISGF3 復合物，激活ISGs的轉錄以抵抗病毒入侵[50]。硬骨魚中IRF10 基因被病毒、poly（I：C）、細菌、LPS 等刺激下上調(diào)表達[85,105-108]。牙鲆（Paralichthys olivaceus）感染細菌或病毒出血性敗血癥病毒（Viral hemorrhagic septicemia virus,VHSV）后IRF10 基因在腎臟組織中表達量升高，但斑馬魚和斜帶石斑魚中發(fā)現(xiàn)IRF10 為干擾素轉錄表達的負調(diào)節(jié)劑[51]。在大西洋鱈（Gadus morhua（Linnaeus,1758））和斜帶石斑魚中發(fā)現(xiàn)IRF10 基因具有兩個剪切體，在魚類抗病毒免疫反應中發(fā)揮功能有所不同[47]。IRF4 基因能夠在斜帶石斑魚的抗病毒反應中抑制抗粘性病毒基因（myxovims resistant 1,Mx1）的啟動子活性，促進病毒復制[51]。然而在鯉上皮瘤細胞（Epitheliomacells,EPC）細胞缺失IRF9 會抑制Mx1 和ISG15 的表達[52]。歐洲沼澤鰻被poly（I:C）、LPS 刺激后能夠誘導IRF4 和IRF10 基因的表達[41]。

2.4 IRF5 亞家族

IRF5 亞家族包含IRF5 和IRF6，目前IRF5 基因已在多種硬骨魚中報道[53-55]，而IRF6 基因目前在魚類中僅在斑馬魚、半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）、膨腹海馬（Hippocampus abdominalis）和團頭魴（Megalobrama amblycephala）中被發(fā)現(xiàn)[56]。IRF5 和IRF6 基因在硬骨魚組織中均呈現(xiàn)組成型表達，但表達水平因組織而異，IRF5 基因在鰓、頭腎和脾臟等免疫組織中有更高水平的表達[54]。IRF5 蛋白結構包括DBD、中間域（middle region,MR）、IAD、病毒激活域（viral activation domain,VAD），N 末端和C 末端含有在病毒感染細胞中發(fā)揮了至關重要的作用[43,54]，IRF6 蛋白的C 端IAD 參與抗病毒免疫反應[57]。

IRF5 可以在硬骨魚受到病毒、細菌感染后產(chǎn)生的抗病毒和抗菌反應中發(fā)揮作用[53-55]。IRF5 基因在草魚中參與LPS 誘導的IFN 信號通路，參與宿主先天免疫反應[58]。IRF5 基因能夠在卵形鯧鲹中正向調(diào)控IFNI、腫瘤壞死因子受體相關蛋白6（tumor necrosis factor receptor-associated factor-6,TRAF6）、Mx1、ISG15、毒蛇毒素（Viperin1）和Viperin2 抗病毒因子的表達[59]。魚類IRF6 是干擾素轉錄的正調(diào)節(jié)因子，并能夠被MyD88 和TBK1 磷酸化，進而參與抗病毒免疫反應[60]。斑馬魚中IRF6 能夠減少細胞中SVCV 病毒的復制，在膨腹海馬中IRF6 基因直接參與了宿主抗病毒防御機制，半滑舌鰨和團頭魴中IRF6 基因在細菌感染后肝臟、脾臟和頭腎組織中均顯著上調(diào)[16,56,60]。目前IRF5 基因在硬骨魚抗病毒免疫反應中的作用已被證實，但IRF6 基因在大多數(shù)魚類中的功能尚不清晰。

3 討論

目前研究發(fā)現(xiàn)魚類中存在相對保守IFN 天然抗病毒免疫系統(tǒng)[61]，而IRF 作為調(diào)控IFN 功能的主要轉錄因子，當前魚類中IRF 的功能研究多集中于表達及抗病毒免疫反應，且均在體外使用魚細胞系進行的[4-6]。盡管IRF 家族蛋白結構較為保守，能夠識別相似的DNA 序列，但每個IRF 都有不同的功能角色，其中C 端的IAD 的不同決定了家族成員的功能多樣性[57]。研究發(fā)現(xiàn)在哺乳動物和魚類中IRF數(shù)量均有所不同，其中家族成員IRF1-9 均保守存在但功能有所不同，IRF10 僅在魚類和鳥類中報道，IRF11 在魚類中特有[22]，表明IRF 家族成員在進化過程中可能相對獨立。此外，魚類中IRF 家族成員雖均為組成型表達，但在不同組織的表達具有差異性。如在卵形鯧鲹、鯉等中IRF5 基因在已知的富含淋巴細胞的組織（如頭腎和鰓）中表達豐富，而在肝臟、血液、脾臟和肌肉中較差，在斑馬魚中IRF5 基因在肌肉和卵巢中高表達[54,55]；IRF1 基因和IRF2基因在虹鱒的肝臟中不表達，推測不同硬骨魚中IRFs表達模式差異的原因可能是由于魚類的多種免疫系統(tǒng)導致[55]。

盡管魚類IRF 與哺乳動物的IRF 是同源的，但研究發(fā)現(xiàn)哺乳動物和魚類相同IRF 家族成員在病毒感染過程中發(fā)揮功能有所不同，如哺乳動物中IRF3 組成型表達，而魚類IRF3 是典型的ISG，通過IFN 或病毒刺激而上調(diào)；哺乳動物IRF4 通過與IRF5 競爭與MyD88 相互作用而成為IFN 表達的負調(diào)節(jié)因子[62]，而魚類IRF4 可以作為正調(diào)節(jié)因子促進IFN 的轉錄[41]；IRF6 在哺乳動物中不受IFN 表達影響，魚類中IRF6 是IFN 轉錄的正調(diào)節(jié)因子[60]。盡管魚類IRF 的大部分功能在哺乳動物中是保守的，但仍然存在一些魚類特有的功能，需進一步體內(nèi)研究數(shù)據(jù)支撐。

哺乳動物IRF1/3/5/7/9 主要在抗病毒免疫反應的調(diào)節(jié)中起激活劑的作用，而IRF4 起負調(diào)節(jié)劑的作用[62]。然而魚類中IRF1/3/6/7/9/11 主要作為轉錄激活因子不斷發(fā)揮作用，而IRF2/4/5/8/10 是雙功能因子，根據(jù)靶基因激活或抑制轉錄來發(fā)揮功能[63]。IRF2 屬于一類多功能轉錄因子，其在轉錄抑制或激活中的特定作用取決于細胞類型和炎癥狀態(tài)[10]，草魚IRF2 能夠與IFN 的啟動子結合下調(diào)IFN 基因的轉錄活性[19]，而卵形鯧鲹IRF2 基因正調(diào)控IFNa3和IFNγ 基因的轉錄表達[20]，而在青鳉中發(fā)現(xiàn)IRF2基于表達的持續(xù)時間而具有抗病毒或促進病毒復制的雙面性[64]。IRF3 既可以通過促進IκBα 降解來增強NF-κB 的活性[34]，又能夠負調(diào)控TRIF 進而抑制的NF-κB 信號通路[36]。魚類IRF8 具有多種功能，是IFN1 表達的負調(diào)節(jié)因子。在體外試驗中，IRF8 基因能夠在體外上調(diào)IFNr 基因的表達[48]，也能抑制NF-κB 信號通路的激活，以防止體外過度免疫損傷[33]。在斑馬魚和斜帶石斑魚中IRF10 基因能夠抑制IFNφ1 和IFNφ3 基因啟動子的激活，并負調(diào)控魚類抗病毒基因的表達，這是硬骨魚中IFN反應的獨特調(diào)節(jié)機制[47]。

4 問題與展望

顯然，哺乳動物和魚類中IRF 家族成員的作用和作用的多樣性需要一些澄清，尤其是關于IRF 家族成員在病毒或細菌感染后的免疫反應中所起的作用以及IRF 家族成員個數(shù)等的不同。當前越來越多的魚類IFN 負調(diào)節(jié)因子被發(fā)現(xiàn)，說明魚類也存在一個龐大而復雜的IFN 反應平衡系統(tǒng)，保證了免疫的相對平衡，防止過度免疫造成嚴重損害，進一步研究IRF 家族的功能有助于促進魚類IFN 抗病毒免疫機制的理解。