刁振麗，李金明

1北京醫(yī)院 國家老年醫(yī)學(xué)中心 國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院老年醫(yī)學(xué)研究院，北京 1007302國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京 100730

當(dāng)前，新型冠狀病毒感染仍在全球流行，猴痘、埃博拉等一系列突發(fā)傳染性疾病正在嚴(yán)重危害全球公眾健康[1]。如何及時準(zhǔn)確地實(shí)現(xiàn)對新發(fā)、突發(fā)或罕見病原體的檢測是臨床微生物學(xué)領(lǐng)域面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)微生物學(xué)診斷技術(shù)主要包括分離培養(yǎng)、免疫學(xué)檢測及微生物核酸(DNA或RNA)檢測，然而受時效性、準(zhǔn)確性及有限病原體檢測范圍的限制，傳統(tǒng)微生物學(xué)檢測技術(shù)難以滿足臨床復(fù)雜多變的病原體檢測需求。宏基因組高通量測序(metagenomic next-generation sequencing，mNGS)技術(shù)是對標(biāo)本中全部核酸進(jìn)行高通量測序，并通過生物信息學(xué)分析以識別標(biāo)本中病原體的檢測方法[2]。近年來，mNGS技術(shù)憑借不依賴傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)、病原體覆蓋廣及無須預(yù)先假設(shè)存在的病原體等優(yōu)勢，已成功應(yīng)用于多種類型臨床感染性疾病的病原體診斷，新發(fā)、突發(fā)傳染病的調(diào)查，耐藥基因檢測以及宿主免疫應(yīng)答分析等領(lǐng)域。本文將概述mNGS檢測國內(nèi)外臨床應(yīng)用現(xiàn)狀，并對該領(lǐng)域未來發(fā)展所面臨的挑戰(zhàn)與前景進(jìn)行論述。

1 mNGS臨床應(yīng)用現(xiàn)狀

1.1 診斷感染性疾病

在感染性疾病診斷領(lǐng)域，mNGS側(cè)重于對病原體基因組的識別和分析[3]。近年來，眾多獨(dú)立醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室已廣泛開展基于高通量測序的病原體檢測并應(yīng)用于不同類型感染性疾病(神經(jīng)系統(tǒng)感染、呼吸系統(tǒng)感染、血流感染等)的病原體診斷[4]。廣泛的病原體譜和無菌腦脊液標(biāo)本使mNGS最先用于臨床神經(jīng)系統(tǒng)感染的診斷。mNGS診斷腦脊液標(biāo)本中病原體的靈敏度為73%～92%，特異度為96%～99%[5]。在診斷神經(jīng)系統(tǒng)感染時，mNGS與常規(guī)微生物學(xué)檢測(即培養(yǎng)、免疫學(xué)檢測等)的陽性符合率為80%，陰性符合率高達(dá)98%[6]。與腦脊液等無菌標(biāo)本不同，呼吸道、泌尿生殖道等表面存在大量正常菌群定植，增加了mNGS檢測的挑戰(zhàn)性。mNGS檢測肺泡灌洗液標(biāo)本中病原體的靈敏度為95.18%，特異度為91.30%[7]。由于方法學(xué)和比較“金標(biāo)準(zhǔn)”的不同，各研究中mNGS診斷下呼吸道感染的性能存在較大差異，靈敏度為47.9%～100%，特異度為41.7%～100%[8]。因血液流經(jīng)全身，不同感染部位也可將足量的病原體核酸釋放入血液用于感染性疾病的檢測，通過檢測血液中的微生物細(xì)胞游離DNA(microbial cell-free DNA，mcfDNA)不僅可診斷血流感染也可用于難以取樣或深部部位的感染(如心內(nèi)膜炎、侵襲性真菌感染等)，擴(kuò)大了mNGS的檢測范圍[9]。第一個商業(yè)化的定量mNGS方法(Karius實(shí)驗(yàn))檢測350例疑似膿毒癥患者的靈敏度為92.9%，特異度為62.7%[10]。能夠檢測來自全身的mcfDNA是mNGS的優(yōu)勢，但鑒定出病原體后如何結(jié)合臨床特征判斷病灶位置是實(shí)際應(yīng)用中面臨的難題。血液中也常會檢測到來自皮膚、口腔、腸道等部位的微生物，且載量較低，需設(shè)置合理的閾值過濾掉低載量的微生物[11]。

1.2 發(fā)現(xiàn)未知病原體

mNGS廣泛的病原體檢測譜和發(fā)現(xiàn)未知病原體的能力使其成為新發(fā)、突發(fā)傳染病的有效檢測工具。2019年12月初，湖北武漢出現(xiàn)了一種不明原因的重癥肺炎，宏基因組RNA測序在5 d內(nèi)就鑒定并分析出了新型冠狀病毒的基因組，而2003年SARS的鑒定耗時5月余，2013年H7N9的鑒定耗時1月余[12]。宏基因組Nanopore測序已成功應(yīng)用于埃博拉病毒、寨卡病毒和新型冠狀病毒等新發(fā)、突發(fā)疾病病原體的實(shí)時分析，可監(jiān)測流行病學(xué)信息、識別病毒突變類型等[13]。

1.3 檢測耐藥基因

mNGS檢測獲得的微生物基因組信息不僅可用于物種鑒定，還可進(jìn)一步分析其耐藥基因。在臨床實(shí)踐中，為快速從物種組成復(fù)雜的臨床標(biāo)本中獲得耐藥基因信息，通常不進(jìn)行基因組的從頭組裝，而直接使用Bowtie2或BWA等比對軟件將reads比對到耐藥基因參考數(shù)據(jù)庫，或?qū)eads拆分為k-mers后比對到參考數(shù)據(jù)庫[14]。mNGS檢測耐藥基因的性能受多方面因素的影響，如病原體種類、抗生素類型、測序類型(DNA或RNA測序)等。mNGS預(yù)測下呼吸感染患者耐藥基因的準(zhǔn)確度為78%～87%，通過結(jié)合CRISPR/Cas9 靶向富集策略可將低豐度的耐藥基因富集2500倍[15-16]。mNGS預(yù)測耐藥基因的準(zhǔn)確度尚需進(jìn)一步評估，但隨著靶向富集技術(shù)的發(fā)展和生物信息學(xué)分析流程的完善，準(zhǔn)確檢出耐藥基因?qū)⒉辉偈窍拗苖NGS的主要瓶頸，而耐藥基因的結(jié)果解讀將是面臨的重要挑戰(zhàn)。在臨床應(yīng)用中，當(dāng)標(biāo)本來源于正常菌群定植或污染的部位時，耐藥基因需從復(fù)雜多樣的物種組成中明確來源菌種，此外檢測到的耐藥基因型與表型可能不一致[17]，因此，當(dāng)mNGS檢測到可能存在相應(yīng)的耐藥基因時，需通過相應(yīng)的抗生素敏感試驗(yàn)確認(rèn)后，指導(dǎo)臨床選擇相應(yīng)的治療藥物。

1.4 分析宿主轉(zhuǎn)錄組

最新的mNGS研究結(jié)合微生物物種鑒定和宿主轉(zhuǎn)錄組信息建立機(jī)器分類模型，進(jìn)一步提高了mNGS診斷感染性疾病的性能。通過整合mNGS檢測到的病原體信息、微生物組多樣性和宿主轉(zhuǎn)錄組等多方位信息診斷下呼吸道感染患者的陰性預(yù)測值高達(dá)100%[18]。診斷由人體免疫失調(diào)引起的膿毒癥感染是整合宿主-微生物mNGS分析的另一重要應(yīng)用場景。利用mNGS檢測血漿標(biāo)本獲得的宿主和微生物信息開發(fā)的集成膿毒癥診斷模型可鑒定出99%臨床診斷為膿毒癥的患者[19]。聯(lián)合mNGS檢測結(jié)核分枝桿菌的高特異性和宿主轉(zhuǎn)錄組分類模型的高敏感性，診斷結(jié)核性腦膜炎的靈敏度高達(dá)88.9%，特異度高達(dá)86.7%[20]。充分挖掘單一mNGS檢測獲得的病原體、微生物組和宿主轉(zhuǎn)錄組信息以提高mNGS診斷感染性疾病的準(zhǔn)確性是重要的發(fā)展方向。

2 mNGS面臨的挑戰(zhàn)

mNGS檢測流程復(fù)雜，包括核酸提取、文庫制備、上機(jī)測序、生物信息學(xué)分析和結(jié)果報告等，檢測過程中每一步驟引入的變異均會影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。mNGS檢測的影響因素眾多且在不斷變化中，需隨時更新調(diào)整，因此mNGS不適用于體外診斷產(chǎn)品，現(xiàn)有的mNGS方法均屬于實(shí)驗(yàn)室自建檢測(laboratory-developed tests，LDTs)[21]。

2.1 核酸提取

核酸提取方法的選擇依賴于待檢樣本類型。不同試劑盒對不同類型病原體的提取效率差異較大。例如，某些試劑盒對革蘭陽性細(xì)菌或真菌等厚壁微生物的提取效率較差，采用DNA+RNA共同提取方法較單獨(dú)提取RNA通常會產(chǎn)生較低的RNA病毒基因組覆蓋率等[22-23]。珠磨法破壁能夠提高厚壁微生物的提取效率，但隨著珠磨頻率的增加或時間的延長，存在基因組過度碎片化的風(fēng)險[24]。因此，必須對選取的病原體核酸提取試劑盒進(jìn)行充分的性能確認(rèn)或驗(yàn)證，以明確所選試劑盒對不同類型微生物的提取效率。

2.2 去除宿主DNA

感染性標(biāo)本(如痰液、肺泡灌洗液等)往往含有大量人類白細(xì)胞，導(dǎo)致測序結(jié)果中絕大部分核酸(90%，甚至>99%)為人源序列，從而降低了樣本中低濃度病原體的檢測敏感性[25]。為增加mNGS的檢測敏感性，節(jié)約測序資源，實(shí)驗(yàn)室通常采用去除宿主核酸策略以富集微生物核酸，如采用滲透裂解或表面活性劑(如皂苷)等選擇性裂解宿主細(xì)胞，然后用核酸酶分解宿主DNA[25]。然而，增加去除宿主DNA步驟延長了樣本周轉(zhuǎn)時間，增加了引入試劑中假陽性微生物的風(fēng)險，可能導(dǎo)致檢測偏倚。用于裂解細(xì)胞的化學(xué)試劑(如皂苷等)，不僅可破壞宿主細(xì)胞，還可在一定程度上溶解微生物的細(xì)胞壁，特別是細(xì)胞壁較薄或無細(xì)胞壁的微生物，如病毒、革蘭陰性菌等[4]。當(dāng)用核酸酶處理宿主DNA時，這些釋放出的微生物DNA也會不可避免地被分解，若該微生物濃度較低則易產(chǎn)生假陰性結(jié)果。無論采用何種方式去除宿主DNA，在考慮微生物富集效率的同時不應(yīng)忽視造成的特定種類微生物漏檢或引入外源性假陽性微生物的風(fēng)險，因此，實(shí)驗(yàn)室在選擇應(yīng)用去宿主環(huán)節(jié)時需對所選方法進(jìn)行充分的性能確認(rèn)。

2.3 文庫制備和測序

mNGS文庫制備包括 DNA 片段化、末端修復(fù)、添加A尾、接頭連接和PCR擴(kuò)增富集(適用時)。對于低微生物量/濃度的臨床標(biāo)本，在接頭連接后需進(jìn)行文庫擴(kuò)增，一般12～16個循環(huán)[26]。文庫擴(kuò)增時會引入擴(kuò)增偏倚，建議盡量不增加接頭連接后擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)[26]。我國各實(shí)驗(yàn)室在mNGS檢測中應(yīng)用最廣泛的是illumina測序平臺和華大測序平臺，其中SE50是最常用的測序模式[4]。illumina和華大等短讀長測序平臺具有測序通量高且錯誤率低的優(yōu)勢，是目前臨床mNGS檢測的首選測序平臺，但其存在操作繁瑣、測序時間長且測序價格高等缺點(diǎn)[27]。長讀長測序平臺(如Oxford Nanopore MinION)的長讀長、實(shí)時分析優(yōu)勢提供了mNGS用于耐藥基因檢測和病原體快速診斷的重要方向，但其具有較高的錯誤率(1%～10%)且測序通量較低[13]。測序深度的選擇取決于mNGS檢測的預(yù)期用途和成本預(yù)算。例如，若mNGS檢測目的為耐藥基因分析，則需比鑒定病原體更高的測序深度(10～100倍)[28]。因組織標(biāo)本比體液標(biāo)本中存在更多的人源核酸，相應(yīng)微生物占比較少，在檢測組織標(biāo)本時實(shí)驗(yàn)室可通過增加測序深度提高微生物數(shù)據(jù)量[29]。由于臨床標(biāo)本中病毒載量普遍較低，用于診斷病毒感染的測序深度不應(yīng)低于10 M[26]。在臨床標(biāo)本常見的人源細(xì)胞背景下(105cells/mL)，20 M reads是推薦的測序數(shù)據(jù)量[30]。

2.4 生物信息學(xué)分析

mNGS的生物信息學(xué)分析流程主要包括數(shù)據(jù)質(zhì)控、去除低質(zhì)量的序列、去除人源序列和微生物序列注釋等[3]。下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)拆分后可首先采用FASTQC或 MultiQC進(jìn)行樣本測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量評估，然后使用Trimmomatic、fastp、Cutadapt等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)量過濾，包括過濾測序接頭、低質(zhì)量序列、低復(fù)雜度序列、重復(fù)序列等[31]。質(zhì)控后的測序數(shù)據(jù)常采用 BWA(Burrows-Wheeler Alignment)、Bowtie、SNAP等工具，與人源參考基因組數(shù)據(jù)庫(包括人基因組、轉(zhuǎn)錄組、線粒體、核糖體等)比對過濾人源核酸序列從而獲得高質(zhì)量的微生物序列。臨床宏基因組物種分類通常基于reads比對的方式直接將微生物序列與參考基因組數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對分析，通過比對獲得已知物種或功能基因序列的豐度，常用軟件包括BWA、Kraken/Kraken 2等。數(shù)據(jù)庫的選擇對物種分類結(jié)果具有顯著影響。全面的公共數(shù)據(jù)庫“大而全”，但其存在大量錯誤注釋、物種信息完整度差異大等問題，當(dāng)比對到錯誤注釋的序列后會產(chǎn)生假陽性結(jié)果；而精簡的數(shù)據(jù)庫可能遺漏新發(fā)現(xiàn)或罕見的微生物，導(dǎo)致假陰性結(jié)果[31]。因此，實(shí)驗(yàn)室需從公開數(shù)據(jù)庫中挑選、整理、分類基因組序列，并進(jìn)一步整理成本實(shí)驗(yàn)室微生物及人源序列比對數(shù)據(jù)庫。理想的微生物參考數(shù)據(jù)庫應(yīng)涵蓋相關(guān)微生物的全部遺傳多樣性信息，并避免含人源序列、低質(zhì)量或錯誤注釋的基因組序列[32]。

2.5 閾值的建立和結(jié)果解讀

mNGS檢測需在開展方法學(xué)性能確認(rèn)階段建立陽性閾值，以從測序結(jié)果中排除“濕實(shí)驗(yàn)”過程中各種來源的污染微生物和“干實(shí)驗(yàn)”中由于基因組同源導(dǎo)致錯誤比對的假陽性微生物等。在設(shè)置陽性閾值時可考慮如下度量標(biāo)準(zhǔn)：檢測到的微生物特異性reads 數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)化的每百萬條reads中比對到該微生物的reads數(shù)(RPM值)、覆蓋非重疊基因組區(qū)域的數(shù)目、以及外部無模板對照樣本或內(nèi)參的reads數(shù)等[21]。將mNGS用于感染性疾病診斷的主要挑戰(zhàn)是區(qū)別上述判斷為陽性的微生物是來自正常菌群、污染微生物或病原體。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)減少假陽性微生物核酸的引入，通過設(shè)置規(guī)范的工作分區(qū)、嚴(yán)格無菌操作、進(jìn)行頻繁且廣泛的清潔、使用無菌處理的耗材等方式避免污染的引入[26]。另一方面，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)監(jiān)測污染來源，通過日常設(shè)置陰性質(zhì)控品(如健康人血漿、人工模擬體液等)及無模板對照(如樣本收集/儲存介質(zhì)、核酸提取、文庫構(gòu)建試劑的緩沖液、無菌水等)長期監(jiān)測實(shí)驗(yàn)室污染微生物的種類、豐度等信息，建立實(shí)驗(yàn)室環(huán)境及試劑常見背景微生物數(shù)據(jù)庫，并保持動態(tài)監(jiān)測與定期更新[33]。目前尚無統(tǒng)一的mNGS結(jié)果報告標(biāo)準(zhǔn)，在結(jié)果解讀前，首先需對mNGS的測序質(zhì)量、內(nèi)參的回收量、陰性質(zhì)控和無模板對照等情況進(jìn)行評估[32]。對超過閾值的微生物需進(jìn)一步判斷為定植微生物、條件致病微生物還是致病微生物。mNGS結(jié)果解讀時需要具有分子生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、臨床微生物學(xué)和生物信息學(xué)等專業(yè)人員組成的跨學(xué)科團(tuán)隊(duì)，結(jié)合標(biāo)本的類型及來源、患者的臨床表現(xiàn)、抗生素治療史及治療反應(yīng)、其他微生物學(xué)檢測結(jié)果等綜合分析該微生物的致病性，作出合理的病原學(xué)診斷決策[21]。必要時，可采用培養(yǎng)、血清學(xué)檢測、熒光PCR、PCR-Sanger測序等傳統(tǒng)技術(shù)確認(rèn)mNGS的結(jié)果。如懷疑存在物種錯誤注釋時，可使用 BLAST 軟件手動復(fù)核[32]。

2.6 質(zhì)量控制

在開展臨床服務(wù)前，需對mNGS檢測系統(tǒng)(包含人、機(jī)、料、法、環(huán)等)進(jìn)行充分的性能確認(rèn)。mNGS分析性能指標(biāo)應(yīng)包括但不限于精密度、準(zhǔn)確度、靈敏度、特異度(包括抗干擾能力)和穩(wěn)定性等[26]。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立室內(nèi)質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)程序，設(shè)置弱陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品和無模板對照樣本等[26]，建立日常檢測質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)及關(guān)鍵點(diǎn)，明確該方法的分析性能指標(biāo)以及檢測的局限性。此外，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)定期參加室間質(zhì)量評價/能力驗(yàn)證或?qū)嶒?yàn)室間比對，發(fā)現(xiàn)檢測過程中存在的問題并積極完善，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性[4]。

3 小結(jié)與展望

近年來mNGS技術(shù)在國內(nèi)外高速發(fā)展，并受到廣泛關(guān)注。其在提高感染性疾病(特別是急危重癥和疑難病例)診斷水平方面發(fā)揮了重要作用，但檢測方法缺乏標(biāo)準(zhǔn)化、人員認(rèn)知和能力不足以及儀器試劑成本高昂是臨床推廣面臨的主要障礙[1]。首先，標(biāo)準(zhǔn)化檢測是推廣mNGS用于臨床診斷的基石，隨著各種新技術(shù)、新方法的出現(xiàn)，迫切需要更多的方法學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化研究以規(guī)范從臨床適應(yīng)證、樣本采集、檢測至結(jié)果報告的mNGS全流程。其次，培養(yǎng)熟練掌握標(biāo)準(zhǔn)操作流程、具備一定生信分析技能、擁有臨床微生物學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)背景知識的復(fù)合型人才，提高人員的知識儲備和綜合能力是目前臨床開展mNGS檢測的迫切需求。此外，各實(shí)驗(yàn)室開展宏基因組DNA或RNA測序的價格較高，一定程度上限制了mNGS的廣泛應(yīng)用[34]。然而，mNGS能夠在一次測試中鑒定出所有潛在的病原體，可能比一系列的傳統(tǒng)微生物學(xué)檢測更具成本效益。因此，迫切需要大規(guī)模、前瞻性臨床研究和經(jīng)濟(jì)學(xué)數(shù)據(jù)評估m(xù)NGS在改善感染性疾病患者臨床管理方面的具體價值[8]。

充分整合mNGS獲得的病原體信息、轉(zhuǎn)錄組信息和耐藥基因信息等有助于綜合提高對感染性疾病患者的臨床管理水平，是mNGS的重要發(fā)展方向。相信未來大規(guī)模、前瞻性臨床研究可更好地回答mNGS是否能以更低的費(fèi)用改善感染性疾病患者臨床管理這一問題。

作者貢獻(xiàn)：刁振麗負(fù)責(zé)資料收集和論文撰寫；李金明負(fù)責(zé)選題設(shè)計并審閱定稿。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突