黃小潔,張 兵,王兆麗,吳華偉,薛青紅,劉 丹,薛 麒

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京 100081)

禽腦脊髓炎(Avian encephalomyelitis,AE)也稱為流行性震顫,是由禽腦脊髓炎病毒(Avian encephalomyelitis virus,AEV)引起的一種侵害雛雞中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成非化膿性腦炎的疾病[1]。1930年在美國首次發(fā)現(xiàn)該病,現(xiàn)已遍及大多數(shù)國家。4周齡以下雛雞最容易被感染,并出現(xiàn)典型癥狀[2]。

AEV是無囊膜的單股正鏈RNA病毒,全長為7.5 kb,基因組上只有一個翻譯起始位點,故把病毒翻譯的蛋白命名為“多聚糖蛋白”[3-4]。蛋白質(zhì)在翻譯過程中,多聚蛋白不斷被水解成小片段蛋白,分別為VP1、VP3、VP0、VP2四種外殼蛋白,構(gòu)成了病毒的結(jié)構(gòu)蛋白[5]。其中VP1是由270個氨基酸殘基組成的多肽,編碼基因全長810 bp,是主要的宿主保護(hù)性免疫蛋白。有研究表明,利用桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)的VP1、VP3和VP0蛋白在雞體內(nèi)保護(hù)性和雞胚保護(hù)性試驗證實,VP1 蛋白的免疫原性明顯高于其他兩個蛋白[6-7]。

目前針對AEV的檢測方法的研究很多,包括瓊脂免疫擴(kuò)散試驗、中和試驗[8]和組織切片間接免疫熒光試驗等診斷技術(shù)運用于AEV的診斷。在禽源活疫苗成品檢驗環(huán)節(jié),《中華人民共和國獸藥典》(三部)二〇二〇年版雞檢查法,針對AEV檢驗的方法主要是ELISA方法。但上述方法均存在缺點:瓊脂擴(kuò)散試驗敏感性較低,中和試驗費時耗力;組織切片間接免疫熒光試驗用陽性血清作為一抗檢測組織中的AEV,存在敏感性特異性差和只能檢測組織切片的問題;ELISA抗體檢測必須通過雞檢查法獲得雞血清進(jìn)行檢測,又存在費時成本高的問題。單克隆抗體技術(shù)特異性高,方法可靠,近年來廣泛用于病毒的檢測[9]。本研究旨在使用免疫原性高的VP1蛋白,運用原核表達(dá)系統(tǒng)對其進(jìn)行表達(dá)并純化,結(jié)合雜交瘤技術(shù)制備特異性的單克隆抗體,為后續(xù)禽腦脊髓炎病毒檢測方法和致病機(jī)制研究提供素材。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、毒株和實驗動物 pET30a-VP1重組質(zhì)粒,由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所構(gòu)建及鑒定;AEV VR株等由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制備和保存;8周齡BALB/c雌性小鼠,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑 表達(dá)菌株BL21購自北京全式金公司;SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、Proteintech小鼠單抗隆抗體亞型鑒定試劑盒均購自上海百賽生物技術(shù)有限公司;Protein Marker、兔抗鼠IgG-HRP、一抗稀釋液、膜封閉液、HRP抗體稀釋液、增強(qiáng)型DAB顯色試劑盒、TBST均購自索萊寶生物科技有限公司;AEV ELSA試劑盒購自IDEXX公司;HAT為Sigma公司產(chǎn)品;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 VP1蛋白的原核表達(dá)及純化 將重組質(zhì)粒pET30a-VP1轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞,挑取單克隆,接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中,于37 ℃搖床培養(yǎng)過夜。將上述菌液以1∶100的比例再轉(zhuǎn)接含氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD600nm為0.6～0.8,加入IPTG誘導(dǎo)置37 ℃搖床200 r/min培養(yǎng)6 h。取誘導(dǎo)后的菌液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。

1.4 重組VP1蛋白的可溶性分析及純化 將活化的菌液加到含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至OD600nm為0.6～0.8,IPTG(0.5 mmol/L)16 ℃誘導(dǎo)過夜。將誘導(dǎo)菌液、未誘導(dǎo)菌液、裂解菌液上清及沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。采用GST柱對重組VP1蛋白進(jìn)行純化。

1.5 單克隆抗體的制備 按照常規(guī)方法進(jìn)行小鼠免疫、細(xì)胞融合和雜交瘤細(xì)胞篩選。將純化后的VP1蛋白作為免疫原,于背部皮下多點注射免疫小鼠,每次免疫接種間隔2周,第3次免疫1周后采血,分離血清檢測ELISA抗體效價,第3次免疫后2周腹腔注射免疫原加強(qiáng)免疫1次。3 d后融合,于融合后第10 d取細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行陽性克隆篩選,分別以VP1蛋白和His蛋白作為包被抗原,通過間接ELISA方法進(jìn)行篩選,共進(jìn)行3次亞克隆。

1.6 單克隆抗體的鑒定

1.6.1 單克隆抗體的亞類鑒定 取經(jīng)亞克隆定株后的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清,根據(jù)Proteintech小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒說明書方法,測定單克隆抗體的亞類。

1.6.2 Western-blot檢測雜交瘤細(xì)胞 將滅活后的AEV VR株經(jīng)處理后,進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜上;用適當(dāng)稀釋的雜交瘤細(xì)胞上清作為一抗于室溫孵育1 h,用1∶10000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗于室溫孵育1 h并用增強(qiáng)型DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色。

1.6.3 IFA方法檢測雜交瘤細(xì)胞 將AEV VR株以及雞減蛋綜合征病毒(EDSV)、禽白血病病毒(ALV)、雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)和禽呼腸孤病毒(ARV)等常見的禽類病毒以100 EID50/0.1mL接種雞原代法氏囊細(xì)胞,培養(yǎng)5 d,經(jīng)甲醇固定后,以雜交瘤細(xì)胞上清作為一抗于37 ℃孵育1 h,用FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗于37 ℃孵育1 h,置于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察,以評價單抗與AEV的反應(yīng)性和單克隆抗體的特異性。

1.7 單抗隆抗體的初步應(yīng)用 按照1.6.3建立的IFA方法,對10家國內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的禽用活疫苗重點品種進(jìn)行AEV外源檢測,并與《中國獸藥典》2020年版三部推薦的ELISA方法進(jìn)行對比。同時設(shè)置PBS組為陰性對照,感染AEV(VR株)組為陽性對照。結(jié)果顯示,血清學(xué)檢驗和ELISA試劑盒檢測的結(jié)果一致,所選取的禽用活疫苗均無AEV污染,陰性對照為AEV檢測陰性,陽性對照為AEV檢測陽性。

2 結(jié)果與分析

2.1 pET30a-VP1的誘導(dǎo)表達(dá) 取1 mL誘導(dǎo)表達(dá)的pET30a-VP1轉(zhuǎn)化至BL21的菌液進(jìn)行SDS-PAGE,結(jié)果在44 kD處可見表達(dá)條帶,符合預(yù)期大小(圖1)。

M:蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1:未誘導(dǎo)對照(pET30a-VP1轉(zhuǎn)化至BL21);2-3:IPTG誘導(dǎo)(pET30a-VP1轉(zhuǎn)化至BL21)

2.2 重組蛋白的可溶性分析 超聲裂解誘導(dǎo)后的菌液,將菌液上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳,結(jié)果顯示,pET30a-VP1蛋白在沉淀和上清都有,但是上清中的蛋白成分更純凈,沒有雜帶。表明該蛋白可以以包涵體的形式和可溶性蛋白的形式表達(dá)(圖2)。選擇上清中的蛋白進(jìn)行純化,結(jié)果見圖3,表明蛋白的純度高。

M:蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1:超聲后全菌;2:超聲后沉淀;3:超聲后上清

M:蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1:純化蛋白稀釋5倍;2:純化蛋白稀釋10倍

2.3 雜交瘤細(xì)胞篩選 將雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清用間接ELISA 方法在VP1蛋白和His蛋白包被板上進(jìn)行ELISA抗體檢測,將3次篩選均顯示陽性的細(xì)胞株進(jìn)行亞克隆及擴(kuò)大培養(yǎng)定株。共篩選出兩株ELISA陽性雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為4#、19#(表1)。

表1 雜交瘤細(xì)胞株的ELISA分析

2.4 單克隆抗體的鑒定

2.4.1 亞類的鑒定 用ELISA方法對兩株雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行鑒定,結(jié)果顯示4#的重鏈類型為IgG2b,19#的重鏈類型為IgG2a,輕鏈類型均為Kappa(表2)。

表2 ELISA法測定單克隆抗體類及亞類

2.4.2 Western-blot檢測單克隆抗體 將滅活后的AEV VR株進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離,并轉(zhuǎn)至PVDF膜上,用兩株單抗作為一抗,進(jìn)行Western-blot鑒定,結(jié)果顯示兩株單抗均與VR株產(chǎn)生特異性反應(yīng),在約35 kD大小處(VP1蛋白分子量)能特異性結(jié)合(圖4)。

M: 蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1: 4#單克隆抗體;2: 19#單克隆抗體

2.4.3 IFA方法檢測單克隆抗體的特異性 將兩株單抗做為一抗,將單抗進(jìn)行了1∶1000、1∶2000稀釋,進(jìn)行IFA檢測,均能出現(xiàn)綠色熒光,結(jié)果顯示兩株單抗僅與AEV VR株發(fā)生特異性反應(yīng),出現(xiàn)特異性綠色熒光,而與EDSV、ALV、ILTV和ARV等常見的禽類病毒均不發(fā)生反應(yīng),說明單克隆抗體的特異性良好。圖5是將單抗進(jìn)行1∶2000倍稀釋時IFA的檢測結(jié)果圖。

1:AEV(VR株);2:正常細(xì)胞對照;3: EDSV(127株);4: ALV(RAV-1株);5: ILTV(ILT/13株);6: ARV(Reo1133株) 7: AEV(VR株);8: 正常細(xì)胞對照;9: EDSV(127株);10: ALV(RAV-1株);11: ILTV(ILT/13株);12: ARV(Reo1133株)1、2、3、4、5、6是用4#單抗做為一抗;7、8、9、10、11、12是以19#單抗做為一抗

2.4.4 單抗初步應(yīng)用 10批疫苗兩種方法檢測均無AEV外源污染,兩種方法檢測結(jié)果一致,符合率100% 結(jié)果見表3,說明該方法用來進(jìn)行禽外源病毒檢測可行,方法的靈敏性與進(jìn)口的IDEXX ELISA試劑盒差異不大,實現(xiàn)了該單克隆抗體的初步運用。

表3 IFA與ELISA外源檢測方法的比較

3 討 論

禽腦脊髓炎病毒是危害禽類的重大傳染病之一,該病不僅能水平傳播而且能垂直傳播。主要侵害母雞和雛雞,產(chǎn)蛋雞感染則造成產(chǎn)蛋下降,雛雞發(fā)病則會腿部癱瘓、頭頸快速震顫、共濟(jì)失調(diào)[10],種雞場還會出現(xiàn)孵化率降低和弱雛率增加的問題,給養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。目前該病沒有特效藥物治療,只能依靠及時診斷淘汰陽性雞群和疫苗預(yù)防做到該病的凈化控制。因此建立有效的診斷和檢測方法對于疾病的診斷和疫苗外源病毒的檢測至關(guān)重要。VP1蛋白高度保守,存在極低的抗原性差異[11],且VP1蛋白的免疫原性明顯高于其他幾個蛋白。鑒于此我們選用AEV AR株的VP1基因進(jìn)行克隆表達(dá)制備免疫原。利用大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)并純化AEV VP1蛋白,多次免疫小鼠后進(jìn)行細(xì)胞融合,采用ELISA矩陣方法篩選出2株雜交瘤細(xì)胞株。可靠的篩選方法在制備單抗的過程中起到關(guān)鍵作用,ELISA方法篩選時選用表達(dá)VP1蛋白和標(biāo)簽蛋白His作為包被抗原,進(jìn)行3輪雙篩選,此方法簡化了篩選過程并排除標(biāo)簽蛋白在篩選過程中的干擾。兩株單克隆抗體經(jīng)Western-blot鑒定,均能與VR株發(fā)生特異性反應(yīng),AEV只有一個血清型,簡化了廣譜性驗證。同時采用IFA方法檢測單抗的特異性,篩選出的兩株單抗均與VR株發(fā)生特異性反應(yīng),而與禽類其他常見病毒均不發(fā)生反應(yīng),說明特異性良好。

王秋娟在2006年[11]也以VP1蛋白為免疫原制備了兩株單抗,但未對其進(jìn)行應(yīng)用。本研究將制備的單抗做為一抗,單抗稀釋1∶2000仍可出現(xiàn)綠色熒光,初步建立了AEV的 IFA方法。IFA方法需細(xì)胞培養(yǎng)病毒,開始選用雞胚成纖維細(xì)胞,雞腎細(xì)胞培養(yǎng)AEV,均不產(chǎn)生細(xì)胞病變,不易觀察。后續(xù)參考了文獻(xiàn)[12]方法,使用10日齡的雛雞法氏囊制備法氏囊原代細(xì)胞進(jìn)行AEV的培養(yǎng),2 d即可產(chǎn)生細(xì)胞病變。法氏囊原代細(xì)胞制備在取組織的過程中易造成污染,關(guān)鍵要做好剖檢前全雞的消毒和保證采樣過程的無菌操作。IFA方法的優(yōu)勢在于一抗大批量生產(chǎn)的價格和細(xì)胞制備的成本均比較低,比起目前國內(nèi)外使用的ELISA試劑盒性價比高很多。本研究應(yīng)用制備的單抗對AEV的IFA方法僅進(jìn)行初步研究和運用,后續(xù)將對各種反應(yīng)條件繼續(xù)進(jìn)行摸索和深度研究,以期建立更加成熟的方法為AEV間接免疫熒光試劑盒的成功研制奠定基礎(chǔ)。