張 沛,瞿紅穎,楊國(guó)輝,李紅園,李卓偉,賈 興*,王建鋒

(1.河北遠(yuǎn)征藥業(yè)有限公司/河北省獸藥技術(shù)創(chuàng)新中心,石家莊050041;2.吉林大學(xué),長(zhǎng)春471800)

阿莫西林屬于半合成的第二代廣譜青霉素類(lèi)抗生素,別名羥氨芐青霉素,屬于β-內(nèi)酰胺類(lèi),由英國(guó)比徹姆(Beecham)公司在20世紀(jì)60年代開(kāi)發(fā)研制而成,對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌如葡萄球菌、棒狀桿菌、梭桿菌、鏈球菌、丹毒絲菌等的抗菌機(jī)理與青霉素相似。對(duì)多種革蘭氏陰性菌如變形桿菌、沙門(mén)氏菌、嗜血桿菌、大腸桿菌等亦有殺滅作用,可廣泛用于治療各種動(dòng)物的尿道、呼吸道及皮膚的敏感菌感染[1-3]。臨床使用的主要為注射用阿莫西林鈉及阿莫西林三水化合物,具有口服吸收好、殺菌迅速,選擇性高、毒性低、副反應(yīng)少,臨床使用方便等特點(diǎn)[4-7]。

目前國(guó)外已批準(zhǔn)阿莫西林可溶性粉主要用于豬、雞等動(dòng)物,常見(jiàn)給藥方式為飲水或拌料。國(guó)內(nèi)給藥方式與國(guó)外相同,主要靶動(dòng)物為雞。阿莫西林對(duì)胃酸相當(dāng)穩(wěn)定,口服吸收后,同等給藥劑量,血清濃度比氨芐西林高1.5～3倍。阿莫西林鈉已批準(zhǔn)用于豬、牛、羊、馬、貓、狗等家畜,給藥方式為注射給藥。二者主要用于對(duì)阿莫西林敏感的革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌感染。關(guān)于口服阿莫西林混懸劑、肌注阿莫西林三水合物、肌注阿莫西林鈉的藥代動(dòng)力學(xué)已有報(bào)道[8-15],本試驗(yàn)主要研究口服阿莫西林可溶性粉在豬體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)及與靜脈注射阿莫西林鈉比較的絕對(duì)生物利用度,為臨床用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本次試驗(yàn)選擇8頭健康狀態(tài)良好的大白-長(zhǎng)白雜交豬(體重20～30 kg,雌雄各半)為受試靶動(dòng)物。給藥前飼喂1周,自由飲水,飼喂不含藥物的飼料,每天定時(shí)飼喂三次。試驗(yàn)開(kāi)始前,受試動(dòng)物在試驗(yàn)場(chǎng)所適應(yīng)7 d,減少環(huán)境變化對(duì)其造成的應(yīng)激。

1.2藥品和試劑 阿莫西林可溶性粉(用于內(nèi)服)含量10%,批號(hào)DVA210902;注射用阿莫西林鈉(用于靜脈注射)含量85.5%,批號(hào)E8G210103;均為河北遠(yuǎn)征禾木藥業(yè)有限公司。阿莫西林對(duì)照品:含量86.6%,批號(hào)K0221703,中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。甲醇:含量>99.9%,色譜純,批號(hào)21115270,賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;磷酸:含量85%～90%,色譜純,批號(hào)RH238446,上海麥克林生化科技有限公司;磷酸二氫鉀:含量>99.5%,批號(hào)G2117143,上海阿拉丁生化科技有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備 高效液相色譜儀:廠家:日本島津公司,型號(hào):LC-2010A HT;電子天平:感量0.00001 g,廠家:賽多利斯,型號(hào):QUINTIX125D-1CN;臺(tái)式冷凍離心機(jī):廠家:長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司,型號(hào):H1850R;旋渦混合器:廠家:其林貝爾,型號(hào):XW-80A;智能靜音超聲波清洗機(jī):廠家:小美超聲,型號(hào):XM-300UVF;真空抽氣泵:廠家:上海亞榮生化儀器廠,型號(hào):SHZ-Ⅲ;移液器:規(guī)格:10、20、200、1000 μL,廠家:吉爾森實(shí)驗(yàn)儀器(上海)有限公司。

1.4 試液的配制

1.4.1 阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1 mg/mL) 精密稱(chēng)取阿莫西林對(duì)照品適量于10 mL棕色容量瓶中,用5%甲醇水定容至刻度,配制成1 mg/mL的阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,密封,分裝后,于-80 ℃避光保存,有效期30 d。

1.4.2 阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)工作液 準(zhǔn)確量取1 mL阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中,用5%甲醇水定容至刻度,搖勻,使其濃度為100 μg/mL,并通過(guò)稀釋最終配制成7個(gè)濃度的阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)工作液,分別為100、50、25、10、5、2.5和1 μg/mL。

1.4.3 空白基質(zhì)溶液 采用不含待測(cè)組分的空白樣品,按血漿樣品前處理方法進(jìn)行操作,制得空白基質(zhì)溶液。

1.5 方法

1.5.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)方案 在動(dòng)物入選完成后,使用EXCEL隨機(jī)數(shù)字函數(shù)給每頭豬賦予一個(gè)隨機(jī)數(shù)字,根據(jù)隨機(jī)數(shù)字由小到大排列,將8頭受試豬隨機(jī)分成2 組,每組4頭,采用單劑量、雙周期、兩處理、隨機(jī)、交叉研究,設(shè)置內(nèi)服組和靜注組。內(nèi)服組(阿莫西林可溶性粉)以口服方式給藥20 mg/kg B.W.,靜注組(注射用阿莫西林鈉)以耳緣靜脈注射方式給藥10 mg/kg B.W.。在進(jìn)行給藥之前,記錄每頭動(dòng)物的體重,計(jì)算給藥劑量。

1.5.2樣品采集 在每個(gè)周期的不同時(shí)間點(diǎn),從豬的前腔靜脈采血5 mL,置于肝素抗凝采血管中。具體的采血時(shí)間點(diǎn)如下:給藥前一次(0 h)、給藥后5、10、15、30、45 min及1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、18 h各一次,采集血樣于3800 rpm離心10 min,吸取上層血漿(采集頸靜脈血置于含0.5%肝素鈉的離心管中,混勻,3800 rpm,離心10 min。),置于標(biāo)識(shí)好的試管中,同時(shí)取空白豬血漿樣品,作為空白試樣。-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3 液相色譜條件 色譜柱:WondaSil C18-WR(4.6 mm×250 mm,5 μm),日本島津公司。流動(dòng)相:0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液:甲醇=90∶10(V∶V)。流速:1.0 mL/min。柱溫:35 ℃。進(jìn)樣量:20 μL;檢測(cè)波長(zhǎng):225 nm。

1.5.4 血漿樣品的處理 取出冷凍血漿樣品,室溫化凍,渦旋混勻。準(zhǔn)確吸取500 μL豬血漿樣品,加入500 μL含1%磷酸的甲醇溶液,渦旋混勻30 s,于4 ℃條件下,15000 rpm離心10 min,轉(zhuǎn)移上清液至2 mL離心管中,過(guò)0.22 μm有機(jī)相針式過(guò)濾器至棕色進(jìn)樣瓶中,供HPLC上機(jī)檢測(cè)。

1.5.5 檢測(cè)限和定量限 取450 μL空白豬血漿,加入50 μL相應(yīng)濃度的阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(500、1000 ng/mL),制得50、100 ng/mL添加濃度的標(biāo)準(zhǔn)添加樣品,每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)重復(fù),按血漿樣品前處理方法處理后上機(jī)檢測(cè)。以最低檢出濃度計(jì)算,S/N≥3時(shí)的加標(biāo)樣品濃度為檢測(cè)限,S/N≥10且具有可接受的準(zhǔn)確度和精密度的加標(biāo)樣品濃度為定量限。

1.5.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線 設(shè)置7個(gè)不同的阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度,依次為1、2.5、5、10、25、50和100 μg/mL。準(zhǔn)確吸取450 μL空白豬血漿樣品,分別加入50 μL上述阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)工作液,渦旋混勻。如下表所示,制得血漿藥物濃度為100、250、500、1000、2500、5000和10000 ng/mL的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,按照血漿樣品前處理方法處理后進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。以測(cè)得阿莫西林峰面積為縱坐標(biāo),對(duì)應(yīng)藥物濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,求得線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)(表1)。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

1.5.7 準(zhǔn)確度和精密度 取450 μL空白豬血漿,加入50 μL相應(yīng)濃度的阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)工作液(1、2.5、10和75 μg/mL),制得100、250、1000和7500 ng/mL四個(gè)添加濃度水平的添加樣品,每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)重復(fù),按照血漿樣品前處理方法處理后上機(jī)檢測(cè)。以現(xiàn)配隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量,于三個(gè)不同工作日每天檢測(cè)一批,計(jì)算準(zhǔn)確度、批內(nèi)和批間精密度。

1.5.8 基質(zhì)效應(yīng) 純標(biāo):用純水配制成濃度分別為125、500和3750 ng/mL的阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)工作液,每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)重復(fù),作為基質(zhì)效應(yīng)考察的參照溶液?；|(zhì)匹配:取空白豬血漿樣品,按血漿樣品前處理方法處理血漿樣品得到空白基質(zhì),用空白基質(zhì)配制成濃度分別為125、500和3750 ng/mL的阿莫西林基質(zhì)標(biāo)液,每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)重復(fù)。

按照色譜工作條件對(duì)上述樣品進(jìn)行檢測(cè),比較相同濃度下空白基質(zhì)對(duì)檢測(cè)的影響。

1.5.9 方法的穩(wěn)定性試驗(yàn)

1.5.9.1 樣品反復(fù)凍融穩(wěn)定性 取450 μL空白豬血漿,分別添加50 μL三個(gè)不同濃度(2.5、10和75 μg/mL)的阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)工作液,混勻,制得250、1000和7500 ng/mL三個(gè)添加濃度水平的添加樣品,每個(gè)濃度分成6份,3份當(dāng)天檢測(cè),其余3份在-80 ℃與常溫條件下反復(fù)凍融3次后,按血漿樣品前處理方法處理血漿樣品,供HPLC檢測(cè)分析。以現(xiàn)配隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量,分析待測(cè)藥物在凍融過(guò)程中的穩(wěn)定性。

1.5.9.2 樣品室溫放置穩(wěn)定性 取450 μL空白豬血漿,分別添加50 μL三個(gè)不同濃度(2.5、10和75 μg/mL)的阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)工作液,混勻,制得250、1000和7500 ng/mL三個(gè)添加濃度水平的添加樣品,每個(gè)濃度分成6份,分2個(gè)批次,室溫放置0、12 h后按血漿樣品前處理方法處理樣品,供HPLC檢測(cè)分析。以現(xiàn)配隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量,考察血漿樣品室溫放置后的穩(wěn)定性。

1.5.9.3 樣品前處理后進(jìn)樣盤(pán)放置穩(wěn)定性 取450 μL空白豬血漿,分別添加50 μL三個(gè)不同濃度(2.5、10和75 μg/mL)的阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)工作液,混勻,制得250、1000和7500 ng/mL三個(gè)添加濃度水平的添加樣品,每個(gè)濃度分成6份,分2個(gè)批次,按血漿樣品前處理方法處理樣品,進(jìn)樣盤(pán)放置0、12 h后上機(jī)檢測(cè)。以現(xiàn)配隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量,考察前處理后的血漿樣品在進(jìn)樣盤(pán)放置后的穩(wěn)定性。

1.5.9.4 樣品前處理后-20 ℃放置穩(wěn)定性 取450 μL空白豬血漿,分別添加50 μL三個(gè)不同濃度(2.5、10和75 μg/mL)的阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)工作液,混勻,制得250、1000和7500 ng/mL三個(gè)添加濃度水平的添加樣品,每個(gè)濃度分成6份,分2個(gè)批次,按血漿樣品前處理方法處理樣品,-20 ℃放置0、24 h后上機(jī)檢測(cè)。以現(xiàn)配隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量,考察血漿樣品前處理后在-20 ℃放置的穩(wěn)定性。

1.5.9.5 儲(chǔ)備液長(zhǎng)期凍存穩(wěn)定性 取新配制的阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,分裝,于-80 ℃條件下密封避光保存。分別在配置后的0 d和30 d,用純水稀釋成濃度為125、500和3750 ng/mL三個(gè)濃度的待測(cè)液,每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù),供HPLC檢測(cè)分析。每次重新稱(chēng)量標(biāo)準(zhǔn)品配制阿莫西林儲(chǔ)備液并配制標(biāo)準(zhǔn)曲線,用來(lái)定量。將放置后樣品測(cè)定濃度與標(biāo)示濃度相比,考察儲(chǔ)備液在-80 ℃的儲(chǔ)存條件下的穩(wěn)定性。

1.5.9.6 樣品長(zhǎng)期凍存穩(wěn)定性 取450 μL空白豬血漿,分別添加50 μL三個(gè)不同濃度(2.5、10和75 μg/mL)的阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)工作液于空白血漿中混勻,制得250、1000和7500 ng/mL三個(gè)添加濃度水平的添加樣品,每個(gè)濃度分成6份,分2個(gè)批次,于-80 ℃條件下儲(chǔ)存,分別于0、30 d后按血漿樣品前處理方法處理血漿樣品,供HPLC分析。以現(xiàn)配隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量,考察樣品長(zhǎng)期凍存的穩(wěn)定性。

1.5.10 稀釋可靠性 10倍稀釋效應(yīng)-質(zhì)控樣本:取空白血漿450 μL,加入1000000 ng/mL的阿莫西林標(biāo)液50 μL,渦旋混勻配制成100000 ng/mL的質(zhì)控樣本原液。取樣本原液50 μL,加入空白血漿450 μL,配制成10000 ng/mL的10倍稀釋-質(zhì)控樣本。

100倍稀釋效應(yīng)-質(zhì)控樣本:取空白血漿450 μL,加入1000000 ng/mL的阿莫西林標(biāo)液50 μL,渦旋混勻配制成100000 ng/mL的質(zhì)控樣本原液。取樣本原液50 μL,加入空白血漿450 μL,配制成10000 ng/mL的10倍稀釋-質(zhì)控樣本。取上述10倍稀釋效應(yīng)-質(zhì)控樣本50 μL,加入450 μL空白血漿,配制成1000 ng/mL的100倍稀釋質(zhì)控-樣本。

取上述10倍、100倍稀釋效應(yīng)-質(zhì)控樣本,每一濃度設(shè)置6個(gè)平行樣本,按照“血漿樣品前處理方法”進(jìn)行處理后進(jìn)行HPLC檢測(cè),以現(xiàn)配隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析 根據(jù)液相檢測(cè)測(cè)定的血漿濃度值,采用非房室模型分析方法對(duì)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià),采用Data Analysis System(DAS 3.0,中國(guó))對(duì)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行分析,計(jì)算出以下藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù):λz,T1/2,Tmax,Cmax,AUC (0-t),AUC(0-∞),MRT(0-t),MRT(0-∞),Vz/F,CLz/F。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性 通過(guò)對(duì)空白血漿基質(zhì)和添加阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)工作液的空白血漿添加樣品進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果如圖1、圖2所示,血漿內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾樣品的測(cè)定,色譜峰保留時(shí)間在11.217 min左右,且色譜圖中目標(biāo)化合物的保留時(shí)間處沒(méi)有雜質(zhì)干擾,藥峰與雜質(zhì)峰分離良好,表明該方法有較好的特異性。

圖1 A:豬空白血漿的色譜圖;B:豬空白血漿添加阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)工作液(100 ng/mL)的色譜圖

圖2 (目標(biāo)峰放大) A:豬空白血漿的色譜圖;B:豬空白血漿添加阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)工作液(100 ng/mL)的色譜圖

2.2 檢測(cè)限和定量限 以最低檢出濃度計(jì)算,S/N≥3時(shí)的加標(biāo)樣品濃度為檢測(cè)限,S/N≥10且具有可接受的準(zhǔn)確度和精密度時(shí)的加標(biāo)樣品濃度為定量限。本方法中阿莫西林的檢測(cè)限定為50 ng/mL(信噪比S/N均值為8.80)、定量限為100 ng/mL(信噪比S/N均值為20.16),滿足上述要求。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線 以測(cè)得阿莫西林峰面積為縱坐標(biāo),對(duì)應(yīng)藥物濃度為橫坐標(biāo),以1/C為權(quán)重系數(shù),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,求得線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示,線性關(guān)系良好f(x)=83.0974x+5072.44,R≥0.9999,符合檢測(cè)要求。

圖3 阿莫西林豬血漿基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 準(zhǔn)確度和精密度 結(jié)果顯示,阿莫西林100、250、1000和7500 ng/mL添加濃度回收率分別為88.9%～114.6%、88.3%～97.1%、95.9%～105.0%、91.4%～105.1%;批內(nèi)變異系數(shù)分別為1.22%～3.92%、0.71%～2.76%、0.29%～3.75%、0.88%～3.97%;批間變異系數(shù)分別為8.55%、2.68%、2.82%、5.32%。

2.5 基質(zhì)效應(yīng) 通過(guò)計(jì)算基質(zhì)存在下的峰面積(由空白基質(zhì)提取后加入分析物測(cè)得),與不含基質(zhì)的相應(yīng)峰面積(分析物純?nèi)芤?比值,計(jì)算每一分析物的基質(zhì)因子,從6批基質(zhì)計(jì)算的基質(zhì)因子的變異系數(shù)不應(yīng)大于15%。結(jié)果顯示:阿莫西林在125、500和3750 ng/mL濃度下幾乎無(wú)基質(zhì)效應(yīng)。

2.6 方法的穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.6.1 樣品反復(fù)凍融穩(wěn)定性 按1.5.9.1項(xiàng)方法考察-80 ℃與室溫條件下樣品反復(fù)凍融三次后的穩(wěn)定性。以現(xiàn)配隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量,以檢測(cè)的未凍融質(zhì)控樣品的平均濃度作為標(biāo)示濃度考察放置前后待測(cè)藥物濃度的變化。結(jié)果顯示:血漿樣品在-80 ℃與室溫條件下反復(fù)凍融3次后,每個(gè)濃度的均值與標(biāo)示濃度的偏差在±15%范圍,變異系數(shù)均≤7.59。

2.6.2 樣品室溫放置穩(wěn)定性 按1.5.9.2項(xiàng)方法考察血漿樣品在室溫放置0、12 h的穩(wěn)定性,以現(xiàn)配隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量,以0 h檢測(cè)的質(zhì)控樣品平均濃度作為標(biāo)示濃度,考察放置前后待測(cè)藥物濃度的變化。結(jié)果顯示:血漿樣品在室溫條件下放置12 h,每個(gè)濃度的均值與標(biāo)示濃度的偏差在±15%范圍,變異系數(shù)均≤3.00。

2.6.3 樣品前處理后進(jìn)樣盤(pán)放置穩(wěn)定性 按1.5.9.3項(xiàng)方法考察樣品經(jīng)前處理后在進(jìn)樣盤(pán)放置0、12 h的穩(wěn)定性。以現(xiàn)配隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線的進(jìn)行定量,以0 h檢測(cè)的質(zhì)控樣品平均濃度作為標(biāo)示濃度,考察放置前后待測(cè)藥物濃度的變化。結(jié)果顯示:血漿樣品前處理后,在進(jìn)樣盤(pán)放置12 h,每個(gè)濃度的均值與標(biāo)示濃度的偏差在±15%范圍,變異系數(shù)均≤4.24。

2.6.4 樣品前處理后-20 ℃放置穩(wěn)定性 按1.5.9.4項(xiàng)方法考察血漿樣品經(jīng)前處理后在-20 ℃冰箱放置0、24 h的穩(wěn)定性,以現(xiàn)配隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量,以0 h檢測(cè)的質(zhì)控樣品平均濃度作為標(biāo)示濃度,考察放置前后待測(cè)藥物濃度的變化。結(jié)果顯示:血漿樣品前處理后,在-20 ℃條件下放置24 h,每個(gè)濃度的均值與標(biāo)示濃度的偏差在±15%范圍,變異系數(shù)均≤8.68。

2.6.5 儲(chǔ)備液長(zhǎng)期凍存穩(wěn)定性 按1.5.9.5項(xiàng)方法考察儲(chǔ)備液在-80 ℃條件下儲(chǔ)存的穩(wěn)定性,以現(xiàn)配隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線的進(jìn)行定量,以0 d 取樣檢測(cè)的質(zhì)控樣品平均濃度作為標(biāo)示濃度考察放置前后待測(cè)藥物濃度的變化。結(jié)果顯示,阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液在-80 ℃條件下放置30 d,每個(gè)濃度的均值與標(biāo)示濃度的偏差在±15%范圍,變異系數(shù)均≤5.19。

2.6.6 樣品長(zhǎng)期凍存穩(wěn)定性 按1.5.9.6項(xiàng)方法考察樣品在-80 ℃條件下放置后樣品的穩(wěn)定性。以現(xiàn)配隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量,以0 d取樣檢測(cè)的質(zhì)控樣品平均濃度作為標(biāo)示濃度考察放置前后待測(cè)藥物濃度的變化。結(jié)果顯示:血漿樣品在-80 ℃條件下儲(chǔ)存30 d,每個(gè)濃度的均值與標(biāo)示濃度的偏差在±15%范圍,變異系數(shù)均≤7.53。

2.7 稀釋可靠性 按1.5.10項(xiàng)方法考察10倍和100倍稀釋對(duì)阿莫西林的影響,以現(xiàn)配隨行標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行定量。結(jié)果顯示:用豬空白血漿稀釋含阿莫西林的豬血漿樣品10倍時(shí)平均稀釋效應(yīng)為106.53%,稀釋100倍時(shí)平均稀釋效應(yīng)為106.41%。

2.8 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)結(jié)果 豬以20 mg/kg(以阿莫西林計(jì))單次口服阿莫西林可溶性粉和10 mg/kg單次頸靜脈注射阿莫西林鈉注射液,檢測(cè)結(jié)果使用藥代動(dòng)力學(xué)分析軟件Data Analysis System的非房室模型處理藥-時(shí)濃度數(shù)據(jù)得到主要的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)?？诜⒛髁挚扇苄苑酆挽o脈注射阿莫西林鈉注射液在血漿中的藥時(shí)曲線見(jiàn)圖4、圖5。

圖4 豬口服阿莫西林平均藥-時(shí)曲線擬合圖

圖5 豬靜脈注射阿莫西林平均藥-時(shí)曲線擬合圖

口服給藥阿莫西林可溶性粉(20 mg/kg B.W.)后,阿莫西林的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)為:平均達(dá)峰時(shí)間Tmax為1.63±0.35 h,藥物平均滯留時(shí)間MRT(0-t)為3.12±0.41 h,消除半衰期t1/2z為2.48±1.73 h,具有較快的吸收速度,吸收進(jìn)血液后在體內(nèi)的停留時(shí)間較短,代謝較快。

豬經(jīng)靜脈注射給藥(10 mg/kg B.W.)后,平均滯留時(shí)間MRT(0-t)為1.54±0.35 h,平均藥-時(shí)曲線下面積AUC(0-t)為8522.56±1430.51 μg/L×h,消除速率常數(shù)λz為0.23±0.12/h,半衰期t1/2z為3.84±2.03 h。說(shuō)明阿莫西林靜脈注射后與口服給藥相比半衰期較稍長(zhǎng),消除較慢。

將口服給藥的藥-時(shí)曲線下面積AUC(0-t)與靜脈注射給藥的藥-時(shí)曲線下面積AUC(0-t)比較,經(jīng)公式F=AUC(0-t)P.O./(AUC(0-t)I.V.×2)×100計(jì)算阿莫西林受試品的平均絕對(duì)生物利用度為79.44%,說(shuō)明阿莫西林口服給藥吸收較好。

口服阿莫西林可溶性粉和靜脈注射阿莫西林鈉的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 口服阿莫西林可溶性粉藥動(dòng)參數(shù)(20 mg/kg B.W.,P.O.,n=8)及靜脈注射阿莫西林鈉藥動(dòng)參數(shù)(10 mg/kg B.W.,I.V.,n=8)

3 討 論

本試驗(yàn)建立了豬血漿中測(cè)定阿莫西林藥物的HPLC含量測(cè)定方法,該方法具有良好的專(zhuān)屬性、準(zhǔn)確度和精密度,能很好的滿足豬后期血漿樣品中血藥濃度的測(cè)定。實(shí)驗(yàn)中空白血漿基質(zhì)中目標(biāo)化合物的保留時(shí)間附近沒(méi)有雜質(zhì)干擾;方法在豬血漿中的檢測(cè)限為0.05 μg/mL,定量限為0.1 μg/mL;基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為0.1～10 μg/mL,相關(guān)系數(shù)>0.9999;阿莫西林100、250、1000、7500 ng/mL添加濃度回收率分別為88.9%～114.6%、88.3%～97.1%、95.9%～105.0%、91.4%～105.1%,批內(nèi)變異系數(shù)均小于3.97%,批間變異系數(shù)均小于8.55%;反復(fù)凍融3次后待測(cè)藥物響應(yīng)值的變異系數(shù)均低于7.59%,血漿樣品室溫放置12 h待測(cè)藥物響應(yīng)值的變異系數(shù)均低于3.00%,血漿樣品前處理后室溫放置12 h待測(cè)藥物響應(yīng)值的變異系數(shù)均低于4.24%,血漿樣品前處理后-20 ℃保存24 h待測(cè)藥物響應(yīng)值的變異系數(shù)均低于8.68%,儲(chǔ)備液凍存30 d待測(cè)藥物響應(yīng)值的變異系數(shù)均低于5.19%,樣品凍存30 d待測(cè)藥物響應(yīng)值的變異系數(shù)均低于7.53%。結(jié)果表明,本方法的重復(fù)性、靈敏度、特異性、線性范圍、準(zhǔn)確度、精密度能夠滿足豬血漿中阿莫西林血藥濃度檢測(cè)要求。

試驗(yàn)研究了阿莫西林可溶性粉在豬體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)和生物利用度,阿莫西林可溶性粉口服(20 mg/kg B.W.)給藥后,測(cè)得MRT(0-t)、Tmax、Cmax、AUC(0-t)、t1/2z分別為3.12±0.41 h、1.63±0.35 h、4101.35±631.55 μg/L、13540.33±3445.51 μg/L×h、2.48±1.73 h。楊潔研究發(fā)現(xiàn)豬口服阿莫西林混懸液后主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù):Tmax為1.38±0.35 h,Cmax為4.69±0.91 μg/mL,AUC(0-t)為13.27±3.63 μg/mL×h,與本研究結(jié)果比較接近;t1/2為1.52±0.46 h ,生物利用度為(90.55±16.14)%,與本研究結(jié)果比較有所差異,可能與給藥劑量、制劑劑型和試驗(yàn)動(dòng)物品種有關(guān)。

豬靜脈注射阿莫西林鈉(10 mg/kg B.W.)后,具體藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù):MRT(0-t)、AUC(0-t)、λz、t1/2z、Vz、CLz為分別為1.54±0.35 h,8522.56±1430.51 μg/L×h,0.23±0.12/h,3.84±2.03 h,5.71±2.37 L/kg,1.10±0.24 L/h/kg。曾振靈等研究了健康豬靜注阿莫西林鈉(10 mg/kg)后,t1/2β為2.29±0.94 h ,Vd為1.06±0.45 L/kg,AUC為31.67±7.09 mg/L×h,與本試驗(yàn)相比,有所不同,可能與動(dòng)物個(gè)體之間的差異、制劑工藝、輔料有關(guān)。

按照20 mg/kg的劑量口服阿莫西林可溶性粉,其平均絕對(duì)生物利用度為79.44%,吸收程度較好,臨床上可考慮多劑量、連續(xù)給藥來(lái)增加藥效。

試驗(yàn)研究了阿莫西林可溶性粉在豬體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)和生物利用度,藥代試驗(yàn)結(jié)果表明,阿莫西林可溶性粉經(jīng)內(nèi)服給藥后,平均絕對(duì)生物利用度較高,口服阿莫西林可溶性粉藥動(dòng)學(xué)的研究為新藥增加靶動(dòng)物豬的研發(fā)及臨床試驗(yàn)劑量和休藥期的制定提供重要參考。