收稿日期：2022-03-29""""" 修回日期：2023-10-17

基金項(xiàng)目：貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合LH字[2017]7035號(hào)）；貴州省青年科技人才成長(zhǎng)項(xiàng)目（黔教合KY字［2019］221號(hào)）。

作者簡(jiǎn)介：郭倩倩，1985年生，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)閼?yīng)用微生物。E-mail：qian1111qian@126.com

通信作者：盧彪。E-mail：449195518@qq.com

摘要：微生物群落結(jié)構(gòu)的變化可反映養(yǎng)殖環(huán)境的變化，研究水體微生物群落結(jié)構(gòu)組成及功能對(duì)管理和維護(hù)湖泊生態(tài)環(huán)境具有重要意義。2019年6月，在貴州省萬(wàn)峰湖（104.5～105.1°E，24.7～24.9°N）網(wǎng)箱上游1 000 m處（對(duì)照點(diǎn)）、網(wǎng)箱內(nèi)、網(wǎng)箱下游200、400、600、800 m處設(shè)置采樣點(diǎn)，每個(gè)采樣點(diǎn)均采集表層、中層（25 m）、底層（50 m）水體水樣。利用高通量測(cè)序技術(shù)分析水樣中細(xì)菌群落多樣性，結(jié)果顯示：18個(gè)水樣中共鑒定出細(xì)菌38門(mén)、699屬，其中Flavobacterium（黃桿菌屬）和Pseudomonas（假單胞菌屬）是萬(wàn)峰湖水體中優(yōu)勢(shì)菌屬，網(wǎng)箱底層水體中分布有Lactobacillus（乳桿菌屬）、Barnesiella、Shewanella（希瓦氏菌屬）、Sphingomonas（鞘氨醇單胞菌屬）等特異性優(yōu)勢(shì)菌屬。對(duì)不同采樣點(diǎn)細(xì)菌多樣性分析表明：萬(wàn)峰湖水體與網(wǎng)箱的水平距離是影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵，影響范圍在800 m以內(nèi)。網(wǎng)箱養(yǎng)殖造成了底層水體大量特異性細(xì)菌種屬的產(chǎn)生。pH、總磷和化學(xué)需氧量是影響網(wǎng)箱水體細(xì)菌群落的關(guān)鍵因子。研究結(jié)果可為湖泊漁業(yè)養(yǎng)殖可持續(xù)性發(fā)展和湖泊生態(tài)環(huán)境保護(hù)提供參考。

關(guān)鍵詞：高通量測(cè)序；網(wǎng)箱養(yǎng)殖；細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)；萬(wàn)峰湖

中圖分類(lèi)號(hào)：Q938.8；S967.3""""""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A""""""" 文章編號(hào)：1674-3075（2024）04-0175-09

DOI：10.15928/j.1674-3075.202203290090

萬(wàn)峰湖（104.5～105.1°E，24.7～24.9°N）位于世界3大喀斯特地區(qū)之一的中國(guó)西南喀斯特地區(qū)（Jiang et al，2014；李秋華，2018），是典型的喀斯特深水水庫(kù)，湖面面積176"km2，集供水、發(fā)電、灌溉、養(yǎng)殖、防洪、旅游及調(diào)節(jié)自然生態(tài)等功能于一體（鄒竹波等，2005；孫嘉龍等，2008）。2017年以前，萬(wàn)峰湖作為漁業(yè)養(yǎng)殖基地，網(wǎng)箱養(yǎng)殖面積近千萬(wàn)平方米（車(chē)軒，2019；方林和王小婷等，2019），對(duì)水環(huán)境壓力較大，嚴(yán)重影響了其生態(tài)環(huán)境，經(jīng)初步治理萬(wàn)峰湖水質(zhì)已達(dá)到了地表水III 類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)。截至2018 年4 月貴州省水域4.67×106 m2養(yǎng)殖網(wǎng)箱全部拆除; 廣西省截至2018 年11 月累計(jì)拆除面積2.26×106 m2的養(yǎng)殖網(wǎng)箱，湖面網(wǎng)箱清理工作完成率97.4%。

水體微生物是水生態(tài)過(guò)程的驅(qū)動(dòng)者，種類(lèi)繁多、數(shù)量巨大，有自身特有的群落結(jié)構(gòu)，對(duì)環(huán)境變化敏感，能指示生態(tài)現(xiàn)狀，預(yù)測(cè)環(huán)境變化（何浩然等，2019）。水體微生物的新陳代謝影響著湖泊生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量循環(huán)等生物地球化學(xué)循環(huán)過(guò)程（Newton et al，2011；Hanson et al，2012；Guidi et al，2016）。在水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中，微生物群落承擔(dān)著重要的微生態(tài)功能，菌群結(jié)構(gòu)的變化可反映養(yǎng)殖環(huán)境的變化（Zhang et al，2014）。因此，研究水體微生物群落結(jié)構(gòu)組成及功能對(duì)管理和維護(hù)湖泊生態(tài)環(huán)境具有重要意義。

高通量測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用使得全面展示環(huán)境樣本中微生物群落組成及分布情況得以實(shí)現(xiàn)。利用高通量測(cè)序技術(shù)研究水體環(huán)境中的微生物多樣性，并通過(guò)對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬的分析來(lái)評(píng)價(jià)環(huán)境成了研究熱點(diǎn)。本文擬通過(guò)高通量測(cè)序研究網(wǎng)箱養(yǎng)殖對(duì)湖泊微生物多樣性的影響，研究結(jié)果對(duì)保護(hù)湖泊生態(tài)環(huán)境、維持漁業(yè)養(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展具有指導(dǎo)意義。

1"" 材料與方法

1.1"" 區(qū)域概況

本研究選取的網(wǎng)箱所在地位于貴州和廣西交界處（圖1），屬于尚未拆除仍在進(jìn)行魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖的網(wǎng)箱。網(wǎng)箱面積約5 000 m2，共養(yǎng)殖各類(lèi)魚(yú)約100 t，每日投放飼料約2 t，該網(wǎng)箱所在區(qū)域水深50余m，方圓10 km內(nèi)無(wú)其他網(wǎng)箱。

1.2"" 樣品采集與處理

2019年6月無(wú)降水時(shí)采樣，共設(shè)置網(wǎng)箱上游1 000 m處（對(duì)照）以及網(wǎng)箱內(nèi)、網(wǎng)箱下游200、400、600、800 m等6處作為采樣點(diǎn)，每個(gè)采樣點(diǎn)均使用2 L水樣采集器分別采集表層、中層（25 m）、底層（50 m）水體水樣，分裝至500 mL無(wú)菌水樣收集袋中。樣品命名：首字母W、200、400、600、800、1 000分別代表網(wǎng)箱、網(wǎng)箱下游200 m、400 m、600 m、800 m、網(wǎng)箱上游1 000 m；后字母S、Z、X分別代表表層、中層和底層。

水樣采集后迅速讀取水樣溫度；水樣pH值使用臺(tái)式pH計(jì)測(cè)量；水樣化學(xué)需氧量（COD）、氨氮、總磷檢測(cè)參照《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（GB3838-2002）（國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局科技標(biāo)準(zhǔn)司，2002）中的方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.3"" DNA提取

將1 L水樣經(jīng)砂芯抽濾器抽濾，把水體微生物抽濾至0.22 μm無(wú)菌聚碳酸酯膜上并裝入無(wú)菌離心管低溫保存。把聚碳酸酯濾膜剪碎后利用E.Z.N.A.? Soil DNA Kit提取水體生物總DNA，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總DNA完整性。

使用的試劑主要有： E.Z.N.A.? Soil 脫氧核糖核酸Kit（美國(guó)OMEGA公司）；Taq DNA Polymerase（1000 U，中國(guó)Vazyme 公司）；Qubit 3.0 DNA檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Life 公司）；Agencourt AMPure XP（美國(guó)Beckman公司）。

1.4"" PCR擴(kuò)增與測(cè)序

將總DNA通過(guò)Qubit3.0 DNA檢測(cè)試劑盒進(jìn)行精確定量，并以此為模板進(jìn)行第1輪PCR擴(kuò)增。第1輪擴(kuò)增引物為V3～V4區(qū)通用引物（341 Primer F：5′-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG-3′；805 Primer R：5′-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′）。第2輪PCR擴(kuò)增以第1輪擴(kuò)增的產(chǎn)物為模板，通過(guò)Illumina橋式PCR兼容引物（Primer F：5′-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCCTACGGGNGGCWGCAG-3；Primer R：5′-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測(cè)，并通過(guò)Agencourt AMPure XP對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化、回收?；厥盏腜CR產(chǎn)物通過(guò)Qubit3.0 DNA檢測(cè)試劑盒進(jìn)行定量，使最終上機(jī)測(cè)序的DNA濃度為20 pmol/L。測(cè)序平臺(tái)為生工生物工程（上海）股份有限公司的Illumina Mieq測(cè)序平臺(tái)，測(cè)序讀長(zhǎng)為雙向300 bp。

1.5"" 微生物分類(lèi)鑒定

測(cè)序結(jié)果通過(guò)拼接、過(guò)濾、去除非特異性擴(kuò)增及嵌合體后得到最終有效序列。利用QIIME軟件將相似度gt;97%的序列定義為1個(gè)操作分類(lèi)單元（operational taxonomic unit，OTU），每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)于1種代表性序列。通過(guò)16S RNA基因數(shù)據(jù)庫(kù)（RDP數(shù)據(jù)庫(kù)、Silva數(shù)據(jù)庫(kù)、NCBI 16S數(shù)據(jù)庫(kù)）進(jìn)行16S rRNA基因序列比對(duì)、以及分類(lèi)學(xué)注釋從而確定微生物屬。

1.6"" 數(shù)據(jù)分析

多樣性分析指數(shù)，分別選用了Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao1指數(shù)和覆蓋度來(lái)分析。

Shannon指數(shù)（Hshannon）用來(lái)估算樣品中微生物多樣性指數(shù)之一，常用于反映α多樣性指數(shù)。Shannon值越大，說(shuō)明群落多樣性越高。計(jì)算公式如下：

Hshannon = -[i=1SobsniNlnniN]"""""""""""""""""""""""""""""""" """"""""""①

Simpson指數(shù)（Dsimpson）用來(lái)估算樣品中微生物多樣性指數(shù)之一，在生態(tài)學(xué)中常用來(lái)定量描述一個(gè)區(qū)域的生物多樣性。Simpson指數(shù)值越大，說(shuō)明群落多樣性越低。計(jì)算公式如下：

Dsimpson = [i=1Sobsni（ni-1）N（N-1）]""" ②

Chao1指數(shù)為用chao1算法估計(jì)群落中含OTU數(shù)目的指數(shù)，chao1在生態(tài)學(xué)中常用來(lái)估計(jì)物種總數(shù)。計(jì)算公式如下：

Schao1 = Sobs + [ni（ni-1）2（n2+1）]""""" ③

覆蓋度（Coverage，C）為各樣品文庫(kù)的覆蓋率，其數(shù)值越高，則樣本中序列沒(méi)有被測(cè)出的概率越低。該指數(shù)實(shí)際反映了本次測(cè)序結(jié)果是否代表樣本的真實(shí)情況。計(jì)算公式如下：

C = 1- [n1N] ④

上述公式中：Sobs為實(shí)際觀測(cè)到的OTU數(shù)，單位為個(gè)；n為第i個(gè)OTU包含的序列數(shù)，單位為條；N為所有序列總數(shù)，單位為條；Schao1為估計(jì)的OTU數(shù)，單位為個(gè)；n1為只含有1條序列的OTU數(shù)目，單位為個(gè)；n2為只含有2條序列的OTU數(shù)目，單位為個(gè)。

OTU豐度樣本聚類(lèi)分析：使用R軟件根據(jù)各樣本OTU豐度用Bray-Curtis計(jì)算多樣性距離矩陣?yán)L制聚類(lèi)樹(shù)圖。

RDA（多元直接梯度分析）：基于對(duì)應(yīng)分析發(fā)展而來(lái)的一種排序方法，將對(duì)應(yīng)分析與多元回歸分析相結(jié)合，每一步計(jì)算均與環(huán)境因子進(jìn)行回歸。主要是用來(lái)反映菌群與環(huán)境因子之間的關(guān)系。箭頭的長(zhǎng)度代表相應(yīng)的環(huán)境因子與各水樣的相關(guān)程度，箭頭越長(zhǎng)，說(shuō)明其作用越大。水樣投影點(diǎn)距離箭頭及延長(zhǎng)線越近，說(shuō)明該環(huán)境因子對(duì)水樣產(chǎn)生的影響越大。兩箭頭呈銳角時(shí)表示2個(gè)環(huán)境因子之間呈正相關(guān)關(guān)系，鈍角時(shí)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

功能基因分析：將測(cè)序獲得的物種與COG（蛋白相鄰類(lèi)的聚簇?cái)?shù)據(jù)庫(kù)）中已有測(cè)序微生物基因組的基因功能構(gòu)成分析結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，通過(guò)已知蛋白推測(cè)樣本中的功能分類(lèi)的構(gòu)成，利用R軟件對(duì)功能統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行作圖。

2"" 結(jié)果與分析

2.1"" 水環(huán)境特征

萬(wàn)峰湖水樣環(huán)境因子檢測(cè)結(jié)果如表1所示。不同水樣的環(huán)境因子中，COD值差別最為明顯，其中網(wǎng)箱內(nèi)COD值最高，隨著離網(wǎng)箱距離的增加，COD值逐漸降低。其余環(huán)境因子在不同采樣點(diǎn)無(wú)較大變化。根據(jù)《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（GB3838-2002）（國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局科技標(biāo)準(zhǔn)司，2002）指標(biāo)可知，pH、COD、氨氮含量均符合地表水質(zhì)量Ⅱ類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，總磷含量達(dá)到地表水質(zhì)量Ⅲ類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)。

2.2"" OTU豐度聚類(lèi)

根據(jù)各水樣OTU豐度層次進(jìn)行聚類(lèi)分析并構(gòu)建樹(shù)狀結(jié)構(gòu)圖，樹(shù)狀結(jié)構(gòu)可直觀反映各水樣間的相似性和差異關(guān)系。從圖2可知，網(wǎng)箱水樣與不同采樣距離的水樣分屬2個(gè)不同聚類(lèi)，網(wǎng)箱水樣處于同一聚類(lèi)，相同采樣點(diǎn)的不同水層水樣也基本處于同一聚類(lèi)，相同水層深度的水體不存在聚類(lèi)性。由此可知，距離網(wǎng)箱的水平距離是影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵因素，而相同采樣點(diǎn)的不同水層細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似。

2.3"" 基于OTU的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性

基于測(cè)序水樣中的OTU，通過(guò)主成分分析（PCA）對(duì)各樣品中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性進(jìn)行了分析。如圖3所示，PCA1、PCA2分別注釋了測(cè)序樣品OTU的69%和17%的信息，累計(jì)貢獻(xiàn)率為86%，可以較全面地解釋測(cè)序樣品中OTU水平上的異同。圖3中相同顏色和形狀的3個(gè)點(diǎn)表示同一采樣地點(diǎn)上的3個(gè)不同深度的水樣。從整體上看，所有水樣呈現(xiàn)3個(gè)聚類(lèi)，根據(jù)采樣點(diǎn)大體可以分為網(wǎng)箱、1 000 m和其他，說(shuō)明大致可以分為3類(lèi)水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，200、400、600、800的這幾個(gè)水樣聚集性較高，說(shuō)明細(xì)菌群落相似性較高。

相同顏色和形狀的3個(gè)點(diǎn)表示同一采樣地點(diǎn)上3個(gè)不同深度的水樣。

2.4"" 微生物群落多樣性

對(duì)各水樣細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行分析，選取了各個(gè)樣品的總序列數(shù)、OTU數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao1指數(shù)和覆蓋度進(jìn)行分析。表2顯示，所有樣品的測(cè)序覆蓋度都在99%以上，說(shuō)明本次測(cè)序能真實(shí)反映水體中所包含細(xì)菌種類(lèi)。從體現(xiàn)水體細(xì)菌總量的Chao1指數(shù)看，網(wǎng)箱底層（WX）水體中細(xì)菌總量顯著大于其他水體，其他水體中細(xì)菌總量差異不大。Shannon指數(shù)顯示的細(xì)菌群落多樣性表明，WX的指數(shù)（6.430）最大，其次是200X（5.177），第3是400X（4.501），說(shuō)明網(wǎng)箱底層的細(xì)菌群落多樣性最高，200 m底層其次，400 m底層第3。由此可知，網(wǎng)箱養(yǎng)殖增加了底層水體的細(xì)菌群落多樣性，而底層水樣細(xì)菌群落多樣性隨著遠(yuǎn)離網(wǎng)箱而遞減，而與細(xì)菌群落多樣性呈負(fù)相關(guān)的Simpson指數(shù)也呈現(xiàn)出同樣的趨勢(shì)。

2.5"" 微生物組成

測(cè)序結(jié)果與16S RNA基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)、分類(lèi)注釋后，從18個(gè)水樣中鑒定出微生物38門(mén)、699屬，各樣品中所包含的門(mén)屬個(gè)數(shù)見(jiàn)圖4。

網(wǎng)箱水體上、中、下層的細(xì)菌種屬數(shù)均高于其他采樣點(diǎn)，尤其是下層水體細(xì)菌的屬數(shù)目明顯偏高，推測(cè)其原因可能是網(wǎng)箱養(yǎng)殖過(guò)程中飼料和魚(yú)類(lèi)排泄物在水底堆積，導(dǎo)致水體環(huán)境與其他水體差異明顯，微生物種類(lèi)增加。距離網(wǎng)箱800 m范圍內(nèi)，下層水體微生物屬數(shù)目隨距離增加而遞減，800 m采樣點(diǎn)與上游1 000 m采樣點(diǎn)的微生物種屬數(shù)目差異較小。由此可知，網(wǎng)箱養(yǎng)殖對(duì)附近水域水體微生物多樣性影響較大，可使其水體微生物種類(lèi)增多，尤其增多底層水體微生物種類(lèi)；從門(mén)屬數(shù)量來(lái)看，網(wǎng)箱對(duì)水體微生物多樣性影響范圍在800 m以內(nèi)，其影響隨著距離增加逐漸減小。

對(duì)各樣本中的細(xì)菌屬種類(lèi)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并制作韋恩圖（圖5），分析各樣品中細(xì)菌的組成相似情況和重疊情況。各水樣中共有菌72屬，占總數(shù)的10.30%；采集的18個(gè)水樣中，特有細(xì)菌347屬，占總數(shù)的49.64%。網(wǎng)箱底層水體中特有細(xì)菌屬最多，達(dá)298個(gè)，占特有菌屬總數(shù)的85.88%。對(duì)照點(diǎn)（1 000 m）特有細(xì)菌9屬，而網(wǎng)箱（W）特有細(xì)菌312屬，網(wǎng)箱周?chē)w特有細(xì)菌均少于10屬。韋恩圖結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明，網(wǎng)箱養(yǎng)殖增加了網(wǎng)箱水體尤其是網(wǎng)箱底層水體中微生物的多樣性和特異性，主要是網(wǎng)箱養(yǎng)殖導(dǎo)致水底沉積物所致。

將各水樣中所鑒定的微生物屬按照相對(duì)豐度排序，給相對(duì)豐度前50的微生物屬作柱狀圖，不同顏色代表不同的微生物屬，柱狀圖的長(zhǎng)度代表該微生物屬所占的相對(duì)豐度，從圖6可粗略看出各水樣中微生物的群落結(jié)構(gòu)。除網(wǎng)箱底層水體外，其他水體的微生物群落結(jié)構(gòu)大致相似，而網(wǎng)箱底層水體具有不同的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。Flavobacterium（黃桿菌屬）與Pseudomonas（假單胞菌屬）作為水體中的優(yōu)勢(shì)菌屬在網(wǎng)箱水體中相對(duì)豐度占比均小于對(duì)照點(diǎn)以及網(wǎng)箱周?chē)w，而“other”在網(wǎng)箱水體中相對(duì)豐度占比均大于對(duì)照點(diǎn)以及網(wǎng)箱周?chē)w。這進(jìn)一步說(shuō)明網(wǎng)箱水體較對(duì)照點(diǎn)以及網(wǎng)箱周?chē)w細(xì)菌種類(lèi)多、多樣性大，特異性菌屬多的特點(diǎn)。

“Core 72”為各水樣共有菌屬數(shù)，花瓣上的數(shù)字為該水樣特有細(xì)菌屬數(shù)。

按各菌屬的相對(duì)豐度排序，選取各水樣相對(duì)豐度前5的優(yōu)勢(shì)菌屬進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表3。Flavobacterium（黃桿菌屬）和Pseudomonas（假單胞菌屬）作為優(yōu)勢(shì)菌存在于17個(gè)水樣中。黃桿菌屬是非發(fā)酵革蘭氏陰性桿菌，以產(chǎn)生黃色素為特征，包括腦膜炎膿毒性黃桿菌、短黃桿菌、水生黃桿菌、嗜鹽黃桿菌以及吲哚黃桿菌等，廣泛存在于淡水、海水、土壤和植物中。Pseudomonas在16個(gè)水樣中相對(duì)豐度最高。假單胞菌屬?gòu)V泛分布于土壤、淡水、海水以及生物體中，是一類(lèi)生長(zhǎng)適應(yīng)能力較強(qiáng)的革蘭氏陰性菌。Lactobacillus（乳桿菌屬）、Barnesiella、Shewanella（希瓦氏菌屬）、Sphingomonas（鞘氨醇單胞菌屬）作為優(yōu)勢(shì)菌僅存在于網(wǎng)箱底層水體。

2.6"" 功能基因

根據(jù)已有微生物基因組的基因功能數(shù)據(jù)以及本次水樣16S測(cè)序獲得的物種組成，推測(cè)其功能基因的構(gòu)成，以分析不同樣本和分組之間的功能差異。以COG為預(yù)測(cè)基礎(chǔ)，以橫坐標(biāo)為樣品，縱坐標(biāo)為基因功能頻度比例，繪制各水樣的功能基因構(gòu)成（圖7）。不同顏色對(duì)應(yīng)各功能名稱(chēng)，不同色塊長(zhǎng)度表示不同功能的頻度，反應(yīng)各水樣中功能基因的組成及頻度。

如圖7所示，各水樣中功能基因組成結(jié)構(gòu)大致相同，差異在于各樣本中功能基因的頻度不同，以網(wǎng)箱底層為例，頻度前5的功能基因?yàn)橐话愎δ茴A(yù)測(cè)（[R]General function prediction only），氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝（[E]Amino acid transport and metabolism）、轉(zhuǎn)錄（[K]Transcription）、碳水化合物運(yùn)輸和代謝（[G]Carbohydrate transport and metabolism）和能量的生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換（[C]Energy production and conversion），均屬于微生物生長(zhǎng)的基本功能。

2.7"" 水體細(xì)菌對(duì)環(huán)境理化因子的響應(yīng)

采用RDA分析法對(duì)水體細(xì)菌門(mén)類(lèi)多樣性與5種關(guān)系較大的環(huán)境因子的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖8。由箭頭長(zhǎng)短可知環(huán)境因子與各采樣點(diǎn)水體細(xì)菌門(mén)類(lèi)相關(guān)性大小依次為：CODgt;pHgt;溫度gt;氨氮gt;總磷；由箭頭角度可知pH與其他環(huán)境因子呈負(fù)相關(guān)性，總磷與其他環(huán)境因子也呈負(fù)相關(guān)，COD、氨氮、溫度3個(gè)因子之間相互呈正相關(guān)性；由各水樣投影點(diǎn)與箭頭的距離可知，pH、總磷和COD是影響網(wǎng)箱水體細(xì)菌群落的關(guān)鍵因子。

3"" 討論

3.1"" 萬(wàn)峰湖網(wǎng)箱養(yǎng)殖對(duì)水體優(yōu)勢(shì)菌屬的影響

在萬(wàn)峰湖15個(gè)水樣中Pseudomonas（假單胞菌屬）相對(duì)豐度最高。它是漁業(yè)養(yǎng)殖常見(jiàn)菌屬，可寄生在動(dòng)、植物體上，近年來(lái)許多國(guó)家如土耳其（Duman et al，2020）、尼日利亞（Falodun amp; Ikusika，2019）、美國(guó)（Pathak et al，2021）均報(bào)道其養(yǎng)殖水體中分離出該菌屬，在我國(guó)東南沿海4個(gè)養(yǎng)殖區(qū)冬季和夏季微塑料上也有較高的附著量（Dong et al，2021）。萬(wàn)峰湖漁業(yè)資源豐富，易導(dǎo)致該菌屬在水體中有較高的含量。李選文等（2021）、楊梓琪等（2021）、趙小永（2021）、陳夢(mèng)等（2021）均在喀斯特地區(qū)的巖石、沉積物或特有生物的根際土壤中發(fā)現(xiàn)了假單胞菌屬微生物，且多屬于采集樣品中的優(yōu)勢(shì)菌屬，因此同屬喀斯特地貌的萬(wàn)峰湖中存在的大量假單胞菌屬也有可能是環(huán)境地貌中該屬細(xì)菌隨水流沖刷進(jìn)入萬(wàn)峰湖水體中所致。研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)養(yǎng)殖水體中存在假單胞菌屬微生物（陳卓等，2018；Duman et al，2020）。由于假單胞菌屬的微生物多為條件致病性微生物（吳金軍等，2018），因此，對(duì)萬(wàn)峰湖水體尤其是網(wǎng)箱水體中假單胞菌屬微生物的進(jìn)一步分類(lèi)鑒定及耐藥性檢測(cè)將有助于湖區(qū)魚(yú)類(lèi)疾病的預(yù)防。

3.2"" 萬(wàn)峰湖網(wǎng)箱養(yǎng)殖對(duì)水體底層微生物群落的影響

萬(wàn)峰湖網(wǎng)箱底層水體存在大量特異性細(xì)菌種屬。Lactobacillus、Barnesiella、Shewanella、Sphingomonas都是網(wǎng)箱底層水體特有的優(yōu)勢(shì)菌群。王蕾（2017）、徐佳瑩（2020）、王金林等（2020）、王悅等（2021）、朱國(guó)平和王敏（2021）均在魚(yú)類(lèi)的腸道微生物中分離得到了本研究網(wǎng)箱底層水體中的1種或幾種優(yōu)勢(shì)菌屬。而Lactobacillus為常見(jiàn)的發(fā)酵菌屬，常作為益生菌添加到魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖飼料中（宋理平，2009）。因此，可認(rèn)為萬(wàn)峰湖網(wǎng)箱底層水體優(yōu)勢(shì)菌群與其他水樣相比具有較大差異是由于網(wǎng)箱底層的魚(yú)類(lèi)排泄物、飼料殘?jiān)Ⅳ~(yú)類(lèi)殘?。B(yǎng)殖出現(xiàn)的死魚(yú)均直接在網(wǎng)箱外丟棄）等堆積所致。江蘇省滆湖底泥的優(yōu)勢(shì)菌屬為Proteobacteria、Chloroflexi、Deltaproteobacteria、Betaproteobacteria、Deltaproteobacteriawei等（丁軼睿等，2017）；而江西省潘陽(yáng)湖底泥細(xì)菌中的優(yōu)勢(shì)菌屬為疣微菌門(mén)的Subdivision3 genera incertae sedis、δ-變形菌綱的Geobacter（地桿菌屬）和 Anaeromyxobacter（厭氧粘細(xì)菌屬）等（寇文伯等，2015）。由此可知，受環(huán)境影響不同湖泊中微生物多樣性及優(yōu)勢(shì)菌屬存在較大差異，同時(shí)養(yǎng)殖環(huán)境中的微生物群落結(jié)構(gòu)特征是維護(hù)水環(huán)境質(zhì)量、預(yù)防魚(yú)類(lèi)疾病的重要指標(biāo)。

3.3"" 萬(wàn)峰湖網(wǎng)箱養(yǎng)殖對(duì)周?chē)w微生物群落的影響

水質(zhì)的凈化過(guò)程是水體中各生物相互作用、相互影響的動(dòng)態(tài)過(guò)程，其中水體微生物起主要作用。水體中的微生物群落會(huì)隨著水質(zhì)環(huán)境的變化而發(fā)生改變，出現(xiàn)新的種群或者種群豐度變化（黃超等，2019）。本文的研究結(jié)果顯示，雖然幾個(gè)采樣點(diǎn)檢測(cè)水質(zhì)均符合《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（GB3838-2002）（國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局科技標(biāo)準(zhǔn)司，2002）Ⅲ類(lèi)，甚至是Ⅱ類(lèi)水質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)，但采樣點(diǎn)間微生物群落存在明顯的變化，且網(wǎng)箱對(duì)水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響范圍約為800 m。由此可見(jiàn)，微生物作為環(huán)境指示生物，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)所反映的環(huán)境變化比通過(guò)實(shí)際測(cè)量水質(zhì)條件更加靈敏。

參考文獻(xiàn)

車(chē)軒， 2019. 萬(wàn)峰湖流域水污染整體性治理研究[D]. 昆明：云南師范大學(xué).

陳夢(mèng)， 陳敬忠， 劉濟(jì)明， 等， 2021.小蓬竹根際土壤微生物及內(nèi)生真菌多樣性分析[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)，41（10）：4120-4130.

陳卓， 施慧， 謝建軍， 等， 2018.大黃魚(yú)人工感染殺香魚(yú)假單胞菌的病理形態(tài)學(xué)及病原分布的初步研究[J].浙江海洋大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），37（6）：483-488，493.

丁軼睿， 李定龍， 張毅敏， 等， 2017. 滆湖底泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，37（5）：1649-1656.

方林， 王小婷， 2019. 網(wǎng)箱魚(yú)上岸萬(wàn)峰湖清朗[J]. 當(dāng)代貴州，（21）：44-45.

國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局科技標(biāo)準(zhǔn)司， 2002. 地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)： GB3838-2002[S].

何浩然， 潘保柱， 余珂， 等， 2019. 黃土高原水體浮游微生物及沉積微生物研究進(jìn)展[J]. 生命科學(xué)研究，23（4）：324-336.

黃超， 漆新華， 曹文平， 等， 2019. 指示性生物監(jiān)測(cè)和分析在水質(zhì)凈化過(guò)程中的特性與作用[J]. 環(huán)境科技，32（5）：67-70.

寇文伯， 黃正云， 張杰， 等， 2015. 鄱陽(yáng)湖湖泊細(xì)菌群落組成及結(jié)構(gòu)：以松門(mén)山為例[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)，35（23）：7608-7614.

李秋華， 2018. 貴州高原水庫(kù)富營(yíng)養(yǎng)化特征及評(píng)價(jià)[J]. 貴州師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），36（2）：1-8.

李選文， 熊智， 喊也， 等， 2021. 西南典型喀斯特地區(qū)石漠化可培養(yǎng)石生細(xì)菌多樣性研究[J]. 干旱區(qū)資源與環(huán)境，35（7）：177-182.

宋理平， 2009. 寶石鱸營(yíng)養(yǎng)需求的研究[D]. 濟(jì)南：山東師范大學(xué).

孫嘉龍， 董澤琴， 瞿麗雅， 等， 2008. 貴州萬(wàn)峰湖浮游植物的調(diào)查及其指數(shù)評(píng)價(jià)[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，（23）：10096-10097.

王金林， 王且魯， 王萬(wàn)良， 等， 2020. 野生和養(yǎng)殖的異齒裂腹魚(yú)腸道菌群結(jié)構(gòu)分析[J]. 水產(chǎn)科學(xué)，39（4）：585-590.

王蕾， 2017. 鯉魚(yú)早期發(fā)育階段腸道菌群的分析及其免疫相關(guān)性研究[D]. 濟(jì)南：山東師范大學(xué).

王悅， 趙盼月， 陳學(xué)豪， 等， 2021. 精養(yǎng)池模式下不同生長(zhǎng)速度花鰻鱺的腸道菌群比較研究[J]. 飼料工業(yè)，42（4）：48-52.

吳金軍， 蘇友祿， 鄧益琴， 等， 2018. 我國(guó)華南海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)耐藥性流行及分布研究[C]//中國(guó)水產(chǎn)學(xué)會(huì).2018年中國(guó)水產(chǎn)學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集.

徐佳瑩， 2020. 不同地區(qū)淡水魚(yú)類(lèi)腸道菌群分析及魚(yú)類(lèi)病原菌的拮抗菌篩選[D]. 長(zhǎng)沙：湖南師范大學(xué).

楊梓琪， 程曉鈺， 王紅梅， 等， 2021. 桂林羅漢肚洞細(xì)菌群落的環(huán)境驅(qū)動(dòng)機(jī)制及群落構(gòu)建過(guò)程[J].微生物學(xué)報(bào)，61（12）：4118-4136.

趙小永， 2021. 荔波喀斯特洞穴細(xì)菌多樣性及兩株細(xì)菌的新種鑒定和性質(zhì)初探[D]. 貴陽(yáng)：貴州師范大學(xué).

朱國(guó)平， 王敏， 2021.南極海洋生物腸道微生物研究進(jìn)展[J].生態(tài)學(xué)報(bào)，41（21）：8320-8330.

鄒竹波， 查林， 張國(guó)義， 等， 2005. 萬(wàn)峰湖水質(zhì)污染與生態(tài)環(huán)境狀況的調(diào)查[J]. 黔西南民族師范高等專(zhuān)科學(xué)校學(xué)報(bào)，（3）：78-80.

Dong X R， Zhu L X， Jiang P L， et al， 2021. Seasonal biofilm formation on floating microplastics in coastal waters of intensified marinculture area[J]. Marine Pollution Bulletin，171（8）：112914.

Duman M， Mulet M， Saticioglu I B， et al， 2020. Pseudomonas sivasensis sp.nov.isolated from farm fisheries in Turkey[J]. Systematic and Applied Microbiology，43（4）：126103.

Falodun O I， Ikusika E O， 2019. Extended spectrum beta-lactamase and metallo beta-lactamase producing Pseudomonas species isolated from fish pond water in Ibadan， Nigeria[J]. International Journal of Environmental Studies，77（5）： 865-875.

Guidi L，Chaffron S， Bittner L， et al， 2016. Plankton networks driving carbon export in the oligotrophic ocean[J]. Nature，532： 465-470.

Hanson C A， Fuhrman J A， Horner-Devine M C， et al， 2012. Beyond biogeographic patterns： processes shaping the microbial landscape [J]. Nature Reviews Microbiology，10： 497-506.

Jiang Z C， Lian Y Q， Qin X Q， 2014. Rocky desertification in Southwest China： impacts， causes， and restoration[J]．Earth-Science Reviews，132（3）：1-12．

Newton R J， Jones S E， Eiler A， et al， 2011. A guide to the natural history of freshwater lake bacteria[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews，75：14-49.

Pathak A， Stothard P， Chauhan A， 2021. Comparative genomic analysis of three Pseudomonas species isolated from the eastern oyster （Crassostrea virginica） tissues， mantle fluid， and the overlying estuarine water column[J]. Microorganisms，9（3）：490.

Zhang D M， Wang X， Xiong J B， et al， 2014. Bacterioplankton assemblages as biological indicators of shrimp health status[J]. Ecological Indicators，38：218-224.

（責(zé)任編輯"" 熊美華）

Effect of"Cage"Aquaculture on"Aquatic Bacteria Community Structure"in"a Deep Karst Lake：""A Case Study of Wanfeng"Lake

GUO Qian‐qian1， LU Biao1， QIN Yan1， WANG Cong2

（1. Xingyi Normal University for Nationalities， Xingyi"" 562400， P. R. China;

2. Xingyi Local Maritime"Bureau in Guizhou Province， Xingyi"" 562400， P. R. China）

Abstract：Wanfeng Lake is in the Karst region of southwest China and is a typical Karst deep-water reservoir with a surface area of 176 km2. The lake provides important functions， including water supply， hydropower， irrigation， aquaculture， flood control， tourism， and natural ecological regulation. However， large scale cage aquaculture in Wanfeng Lake has seriously affected the ecological environment. Changes in microbial community structure reflect the changes resulting from aquaculture， so studying the structure is important for managing and maintaining the aquatic ecology of lakes. In this study， we investigated bacterial diversity and community structure in waters of the cage aquaculture area of Wanfeng Lake using high-throughput RNA sequencing and explored the impact of cage culture on the bacterial community of Karst deep-water lakes. The study area includes a cage aquaculture area of 5 000 m2 and the water depth was over 50 m. In June 2019， water samples were collected at the surface， middle （25 m） and bottom （50 m） at six sampling sites： 1 000 m upstream of the cage site， at the cage site， and four sites downstream of the cages （200 m， 400 m， 600 m and 800 m）. The microbial community composition and diversity of all samples were analyzed and water quality parameters were determined， including water temperature， pH， chemical oxygen demand （COD）， ammonia nitrogen and total phosphorus. A total of 699 microbial genera from 38 phyla were identified in the 18 samples， with dominance by Flavobacterium and Pseudomonas. However， Lactobacillus， Barnesiella， Shewanella and Sphingomonas were the dominant genera in the bottom layer at the cage site. Based on similarity in community structure， the microbial communities clustered generally into three groups： 1 000 m above the cage site， at the cage site， and below the cage site （200 m， 400 m， 600 m， 800 m）. The key factor in bacterial community structure was horizontal distance to the cages， and the range of aquaculture influence was within 800 m. Microbial community diversity was highest in the bottom layer of the water at the cage site. Cage aquaculture adds numerous bacterial species to the water below the cages that significantly increases bacterial community diversity. Correlation analysis shows that pH， total phosphorus and COD were the key environmental factors affecting the bacterial community. These findings provide a reference for sustainably developing the lake fishery and protecting the ecological environment of Wanfeng Lake.

Key words： high-throughput RNA sequencing; cage aquaculture; bacterial community structure; Wanfeng Lake