DOI：10.15928/j.1674-3075.202206130225

收稿日期：2022-06-13"""" 修回日期：2023-11-21

基金項(xiàng)目：2021年安徽省舒城縣“三區(qū)”科技人才項(xiàng)目；安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)2020年度省級(jí)重點(diǎn)教學(xué)研究項(xiàng)目（2020jyxm0531）和2021年省級(jí)線下課程項(xiàng)目（2021xxkc039）；安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)2021年國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（202110364013）和2023年度動(dòng)物學(xué)教學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2023aujxtd004）。

作者簡(jiǎn)介：張一帆，2001年生，女，本科在讀，研究方向?yàn)閯?dòng)物科學(xué)。E-mail： zhangyifan_326@126.com

通信簡(jiǎn)介：張志強(qiáng)，教授。E-mail： zzq-003@163.com

摘要：探究低溫對(duì)紅耳龜（Trachemys scripta elegans）免疫功能和應(yīng)激反應(yīng)能力的影響，揭示紅耳龜適應(yīng)低溫環(huán)境的生理學(xué)和免疫學(xué)基礎(chǔ)，為深入了解其入侵生物學(xué)提供基礎(chǔ)資料。采用活體背甲下靜脈竇采血技術(shù)，測(cè)定了6℃、17℃和26℃條件下處理1、5和10 d時(shí)血液中各型白細(xì)胞百分比及嗜異性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的比值（ratio of heterophils to lymphocytes，H/L），以及第10天采血后植物血凝素（phytohemagglutinin-P，PHA-P）反應(yīng)的變化。結(jié)果顯示：（1）隨著溫度下降，第1天只有嗜堿性粒細(xì)胞的百分比顯著升高（Plt;0.05），此差異在第5天和第10天消失（Pgt;0.05）；第5天，嗜酸性粒細(xì)胞的百分比和H/L先升后降，淋巴細(xì)胞的百分比先降后升，單核細(xì)胞的百分比下降（Plt;0.05）；第10天，嗜酸性粒細(xì)胞的百分比上升，淋巴細(xì)胞、嗜異性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的百分比，以及H/L下降（Plt;0.05）；（2）隨著處理天數(shù)延長(zhǎng)，除嗜堿性粒細(xì)胞的百分比無(wú)組內(nèi)差異外（Pgt;0.05），其他類型白細(xì)胞的百分比及H/L都有組內(nèi)差異（Plt;0.05）；（3）6℃組、17℃組和26℃組對(duì)PHA-P的反應(yīng)分別在注射后48 h、24 h和48 h達(dá)到峰值，但組間差異不顯著（Pgt;0.05）。紅耳龜通過(guò)調(diào)整血液中嗜酸性粒細(xì)胞等不同類型白細(xì)胞的百分比、下降的應(yīng)激反應(yīng)能力和提前發(fā)生反應(yīng)的免疫應(yīng)答來(lái)適應(yīng)低溫的短期脅迫。

關(guān)鍵詞：紅耳龜；低溫；淋巴細(xì)胞；嗜酸性粒細(xì)胞；植物血凝素；應(yīng)激

中圖分類號(hào)：S917.4""""""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A""""""" 文章編號(hào)：1674-3075（2024）04-0148-07

免疫學(xué)參數(shù)和應(yīng)激反應(yīng)能力可指示動(dòng)物體的健康狀態(tài)，這些指標(biāo)的適應(yīng)性改變是生態(tài)免疫學(xué)（ecological immunology）關(guān)注的主要研究?jī)?nèi)容之一（Boughton et al，2011；Brock et al，2014；張志強(qiáng)，2015）。相對(duì)于其他脊椎動(dòng)物類群，對(duì)爬行動(dòng)物免疫能力與環(huán)境異質(zhì)性的關(guān)系研究起步較晚（Palackdharry et al，2017；Zimmerman et al，2017；Ferguson et al，2018；Goessling et al，2019）。目前，背甲下靜脈竇采血技術(shù)和外源植物血凝素（phytohemagglutinin-P，PHA-P）抗原注射技術(shù)，較多地被應(yīng)用于龜鱉類研究，前者具有微量、無(wú)損傷、可以連續(xù)多次采集血液的優(yōu)點(diǎn)，但也存在后續(xù)工作量較大、白細(xì)胞分型鑒定耗時(shí)較長(zhǎng)等缺點(diǎn)（Davis et al，2008；張志強(qiáng)，2015；吳海燕等，2021；Campbell amp; Ellis，2022），后者可刺激被注射部位的皮膚發(fā)生腫脹反應(yīng)，其反應(yīng)峰值與淋巴細(xì)胞等多種白細(xì)胞的數(shù)量動(dòng)態(tài)有關(guān)，反應(yīng)機(jī)制復(fù)雜（Zimmerman et al，2010a；Finger et al，2013；吳文欣等，2020），但具有操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)（Brock et al，2014；張志強(qiáng)，2015）。此外，爬行動(dòng)物和鳥(niǎo)類中，嗜異性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的比值（ratio of heterophils to lymphocytes，H/L）可反映其應(yīng)激水平，短期內(nèi)可保持相對(duì)穩(wěn)定，之后趨向于增加（Davis et al，2008；Davis amp; Maney，2018）。其中，嗜異性粒細(xì)胞類似于哺乳動(dòng)物血液中的嗜中性粒細(xì)胞，主要執(zhí)行吞噬異物和殺滅病原體的功能（Davis et al，2008）。

紅耳龜（Trachemys scripta elegans），又名巴西龜?shù)?，是世界上危害最?yán)重的入侵物種之一，分布于我國(guó)大部分淡水水域（龔世平等，2018），對(duì)半咸水的生態(tài)環(huán)境也有高度的適應(yīng)性（洪美玲等，2019）。季節(jié)性環(huán)境條件下，紅耳龜?shù)亩鄠€(gè)亞種對(duì)PHA-P的反應(yīng)、體液免疫能力和天然免疫能力變化趨勢(shì)不同（Zimmerman et al，2010b；Hernandez et al，2017；Novovesky amp; Halán，2019）；在適宜紅耳龜生存的溫度范圍內(nèi)，其稚龜對(duì)PHA-P的反應(yīng)快于烏龜（Mauremys reevesii），且數(shù)值較高（周贊等，2016），亞成體的反應(yīng)峰值隨溫度升高有前移傾向（吳文欣等，2020）。本研究模擬紅耳龜冬眠時(shí)、入眠和出眠前后及最適存活溫度，采用背甲下靜脈竇活體采血技術(shù)，測(cè)定與免疫功能相關(guān)的血液指標(biāo)和PHA-P反應(yīng)值及應(yīng)激反應(yīng)能力，旨在驗(yàn)證背甲下靜脈竇連續(xù)采血技術(shù)的可行性，揭示紅耳龜適應(yīng)低溫環(huán)境的生理學(xué)和免疫學(xué)基礎(chǔ)，為深入了解其入侵生物學(xué)提供基礎(chǔ)資料。

1"" 材料與方法

1.1"" 試驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和分組

試驗(yàn)用亞成體紅耳龜均購(gòu)于合肥市裕豐花市。選取背甲完整、大小相似、健康活潑的紅耳龜30只，不區(qū)分性別，每箱10只，共3箱，暫養(yǎng)于安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生理生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的水族箱（長(zhǎng)×寬×高= 60 cm × 36 cm × 36 cm）內(nèi)，水深10 cm。箱內(nèi)置露出水面的石塊若干，供紅耳龜曬背使用；每日12：00喂食萬(wàn)事利龜糧（粗蛋白質(zhì)含量gt;41%，粗脂肪含量≥4.5%，粗纖維含量≤6%），每隔2 d換曝氣24 h以上的自來(lái)水1次；加熱棒控制水溫為（26±1）℃。

室內(nèi)飼養(yǎng)15 d后，1箱仍飼養(yǎng)于水溫為（26±1）℃的水族箱內(nèi)，作為26℃組，即對(duì)照組；1箱移至（17±1）℃的水族箱內(nèi)，作為17℃組；1箱移入（6±1）℃的冰箱內(nèi)，作為6℃組。

1.2"" 背甲下靜脈竇采血、血涂片制作及各型白細(xì)胞百分比的測(cè)定

26℃組、17℃組和6℃組處理至第1、5和10天時(shí)，每組各10只紅耳龜，稱量體重，測(cè)量背甲長(zhǎng)和背甲寬后，均從其背甲下靜脈竇處用預(yù)先經(jīng)過(guò)肝素鈉處理過(guò)的1 mL一次性無(wú)菌注射器采集其血液，每次采集約100 μL。采血后，均用上海運(yùn)佳黃浦制藥有限公司生產(chǎn)的濃度為2%的碘酊消毒采血部位，脫脂棉止血。

將采集后的血液迅速移至1.5 mL離心管中，用20 μL量程的移液器從離心管中取血液約20 μL，每只龜制作血涂片2張。參照吳海燕等（2021）的描述，使用快速瑞氏吉姆薩染液（南京建成生物工程有限公司，產(chǎn)品編號(hào)：D010）處理第1、5和10天時(shí)烘干后的血涂片，計(jì)數(shù)血液中嗜異性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的數(shù)量，并計(jì)算H/L。

以嗜異性粒細(xì)胞的百分比計(jì)算方法為例，其計(jì)算公式為：

H =（H1 + H2）/2"""" """"""nbsp;"""""""""""①

式中：H為嗜異性粒細(xì)胞的百分比（%），H1、H2分別為任1張血涂片中每100個(gè)白細(xì)胞中嗜異性粒細(xì)胞的數(shù)量。

H/L的計(jì)算公式如下：

R = H/L""""""""""""""""""""""""""""""" ②

式中：R為H/L，H為嗜異性粒細(xì)胞的百分比，L為淋巴細(xì)胞的百分比。

1.3"" 對(duì)PHA-P反應(yīng)的測(cè)定

第10天采血后在紅耳龜后足足墊部位一側(cè)注射PHA-P溶液，對(duì)側(cè)足同一部位注射等量滅菌后的0.7%生理鹽水，注射前后均用碘酊消毒。PHA-P的注射濃度為2.5 g/L，劑量為100 μL，測(cè)量時(shí)間點(diǎn)為注射前（0 h）和注射后6、12、24、48、72 h（吳文欣等，2020）。用瑞士產(chǎn)Tesa數(shù)顯卡尺（±0.01 mm）連續(xù)測(cè)定注射前后足墊部位皮膚組織的增厚程度。每只龜每個(gè)測(cè)量時(shí)間點(diǎn)由同一人重復(fù)測(cè)定3次。通過(guò)左、右足皮膚組織增厚的百分率來(lái)表示對(duì)PHA-P的反應(yīng)。

以注射后6 h為例，該時(shí)間點(diǎn)PHA-P反應(yīng)的計(jì)算公式為：

P =（A-B）/B × 100""""""""""""""" ③

式中：P為注射后6 h由PHA-P抗原所誘導(dǎo)的被注射部位皮膚組織的腫脹程度（%），A為注射PHA-P抗原溶液6 h后被注射足墊部位的厚度（mm），B為該時(shí)間點(diǎn)對(duì)側(cè)足足墊部位的厚度（mm）。

1.4"" 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS軟件包（SPSS 19.0 for windows）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。用雙因素方差分析（two-way ANOVA）比較6℃組、17℃組和26℃組實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)和實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)體重、背甲長(zhǎng)和背甲寬的差異。因第1、5和10天采血的均為同一只龜，第10天進(jìn)行PHA-P反應(yīng)測(cè)定的也都為同一只龜，故都采用重復(fù)測(cè)量方差分析（repeated measurement ANOVA）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析，比較采血個(gè)體6℃組、17℃組或26℃組組內(nèi)不同取樣天數(shù)間各型白細(xì)胞百分比和H/L的差異，以及同一溫度組內(nèi)不同測(cè)量時(shí)間點(diǎn)PHA-P反應(yīng)的差異。用單因素方差分析（one-way ANOVA）比較6℃組、17℃組和26℃組第1、5或10天各型白細(xì)胞百分比和H/L的差異，以及第10天PHA-P最大反應(yīng)值的組間差異。文中數(shù)值均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SE）表示，Plt;0.05為差異顯著。

2"" 結(jié)果與分析

2.1"" 溫度和取樣時(shí)間點(diǎn)對(duì)紅耳龜體重、背甲長(zhǎng)和背甲寬的影響

溫度對(duì)紅耳龜?shù)捏w重（F2，54=0.034，Pgt;0.05）、背甲長(zhǎng)（F2，54=0.029，Pgt;0.05）和背甲寬（F2，54=0.278，Pgt;0.05）均無(wú)明顯影響，取樣時(shí)間點(diǎn)也不影響其體重（F1，54=0.001，Pgt;0.05）、背甲長(zhǎng)（F1，54=0.285，Pgt;0.05）和背甲寬（F1，54=0.013，Pgt;0.05），溫度和取樣時(shí)間點(diǎn)對(duì)其體重（F2，54=0.004，Pgt;0.05）、背甲長(zhǎng)（F2，54=0.029，Pgt;0.05）和背甲寬（F2，54=0.051，Pgt;0.05）都無(wú)明顯的交互作用（圖1）。

2.2"" 同一溫度組內(nèi)不同取樣時(shí)間點(diǎn)間各型白細(xì)胞百分比和H/L的變化

重復(fù)測(cè)量方差分析結(jié)果表明，第1天6℃組嗜酸性粒細(xì)胞（F2，18=4.650，Plt;0.05）的百分比顯著低于第5天和第10天，但第1天單核細(xì)胞（F2，18=8.912，Plt;0.05）和嗜異性粒細(xì)胞（F2，18=7.277，Plt;0.05）的百分比以及H/L（F2，81=5.481，Plt;0.05）顯著高于第5天和第10天，淋巴細(xì)胞（F2，18=0.196，Pgt;0.05）和嗜堿性粒細(xì)胞（F2，18=2.424，Pgt;0.05）的百分比無(wú)變化。第5天17℃組嗜酸性粒細(xì)胞（F2，18=7.962，Plt;0.05）的百分比顯著高于第1天和第10天，第1天單核細(xì)胞的百分比（F2，18=3.917，Plt;0.05）顯著高于第10天，第1天和第10天淋巴細(xì)胞的百分比（F2，18=8.025，Plt;0.05）都顯著高于第5天，嗜異性粒細(xì)胞（F2，18=1.307，Pgt;0.05）和嗜堿性粒細(xì)胞（F2，18=0.968，Pgt;0.05）的百分比無(wú)變化，第5天H/L（F2，81=4.197，Plt;0.05）顯著高于第10天。第10天26℃組嗜酸性粒細(xì)胞（F2，18=6.391，Plt;0.05）的百分比顯著低于第1天和第5天，第10天單核細(xì)胞（F2，18=5.867，Plt;0.05）、淋巴細(xì)胞（F2，18=5.052，Plt;0.05）和嗜異性粒細(xì)胞（F2，18=3.761，Plt;0.05）的百分比顯著高于第5天，嗜堿性粒細(xì)胞（F2，18=2.114，Pgt;0.05）的百分比和H/L（F2，81=2.581，Pgt;0.05）無(wú)變化（表1）。

2.3"" 同一取樣時(shí)間點(diǎn)不同溫度組間各型白細(xì)胞百分比和H/L的變化

單因素方差分析結(jié)果表明，第1 天嗜堿性粒細(xì)胞的百分比6℃組顯著高于26℃組（F2，29=5.513，Plt;0.05），單核細(xì)胞（F2，29=2.532，Pgt;0.05）、淋巴細(xì)胞（F2，29=2.060，Pgt;0.05）、嗜異性粒細(xì)胞（F2，29=0.384，Pgt;0.05）、嗜酸性粒細(xì)胞（F2，29=0.426，Pgt;0.05）的百分比和H/L（F2，29=2.511，Pgt;0.05）均無(wú)顯著的組間差異。第5天，嗜酸性粒細(xì)胞（F2，29=9.341，Plt;0.05）的百分比17℃組最高，6℃組居中，26℃組最低；淋巴細(xì)胞的百分比（F2，29=8.453，Plt;0.05）6℃組和26℃組都顯著高于17℃組；單核細(xì)胞的百分比（F2，29=4.069，Plt;0.05）6℃組顯著低于26℃組；H/L（F2，29=4.530，Plt;0.05）17℃組顯著高于6℃組和26℃組；嗜異性粒細(xì)胞（F2，29=3.111，Pgt;0.05）和嗜堿性粒細(xì)胞的百分比（F2，29=0.560，Pgt;0.05）均無(wú)顯著的組間差異。第10天，嗜酸性粒細(xì)胞的百分比（F2，29=11.529，Plt;0.05）6℃組和17℃組顯著高于26℃組；單核細(xì)胞（F2，29=19.116，Plt;0.05）、淋巴細(xì)胞（F2，29=6.954，Plt;0.05）、嗜異性粒細(xì)胞（F2，29=7.850，Plt;0.05）的百分比和H/L（F2，29=3.532，Plt;0.05）26℃組顯著高于6℃組和17℃組；嗜堿性粒細(xì)胞的百分比（F2，29=0.655，Pgt;0.05）無(wú)明顯的組間差異（表1）。

2.4"" 溫度對(duì)PHA-P反應(yīng)的影響

溫度顯著影響紅耳龜對(duì)PHA-P的反應(yīng)值（F2，15=89.374，Plt;0.05），但6℃組、17℃組和26℃組的PHA-P最大反應(yīng)值未見(jiàn)顯著的組間差異（F2，15=0.065，Pgt;0.05，圖2）。6℃組（F5，35=2.375，Pgt;0.05，圖2-A）和26℃組（F5，35=2.053，Pgt;0.05，圖2-C）都在注射后48 h最高，24 h其次，0 h最低，但不同測(cè)量時(shí)間點(diǎn)均無(wú)顯著的組間差異；17℃組注射后24 h最高，48 h與24 h接近，顯著高于0 h和72 h（F5，35=2.559，Plt;0.05，圖2-B）。

3"" 討論

3.1"" 關(guān)于背甲下靜脈竇連續(xù)采血技術(shù)的普適性

活體背甲下靜脈竇采血技術(shù)曾被用于龜類（Barrows et al，2004）、海龜類（夏中榮，2018）和最適溫度處理?xiàng)l件下活體紅耳龜?shù)膯未尾裳▍呛Ｑ嗟龋?021）；本研究發(fā)現(xiàn)，26℃組、17℃組和6℃分別處理紅耳龜1、5和10天均可快速采到約0.1 mL血液，不但能滿足制作血涂片的要求，也為連續(xù)監(jiān)測(cè)同一溫度不同時(shí)間段對(duì)紅耳龜生理狀態(tài)的影響提供了可能性。背甲下靜脈竇采血技術(shù)不影響紅耳龜?shù)恼Ｉ顒?dòng)、無(wú)損傷且操作簡(jiǎn)單，建議推廣應(yīng)用于其他龜類研究。

3.2"" 溫度和時(shí)間對(duì)紅耳龜各型白細(xì)胞百分比的影響

在20℃至28℃的溫度范圍內(nèi)，經(jīng)6周處理后，紅耳龜血液中嗜堿性粒細(xì)胞的百分比28℃和20℃組都高于24℃組，但嗜異性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的百分比未見(jiàn)明顯變化（吳海燕等，2021）。本研究中，隨溫度下降，第1天紅耳龜只有嗜堿性粒細(xì)胞顯著增高，26℃組、17℃組和6℃組均不隨處理天數(shù)延長(zhǎng)而變化，說(shuō)明1 d的溫度刺激即可有效激發(fā)嗜堿性粒細(xì)胞增殖（Davis et al，2008）；季節(jié)性環(huán)境條件下，黃腹彩龜（Trachemys scripta scripta）（Hernandez et al，2017）和某種彩龜屬動(dòng)物（Trachemys spp.）（Novovesky amp; Halán，2019）冬季嗜堿性粒細(xì)胞的百分比顯著高于夏季。各溫度組嗜異性粒細(xì)胞占比均不足2%，隨溫度下降，只在第10天下降明顯，這與黃腹彩龜?shù)龋℉ernandez et al，2017；Novovesky amp; Halán，2019）嗜異性粒細(xì)胞的百分比夏季顯著高于冬季相似，但17℃組組內(nèi)無(wú)明顯變化，26℃組隨處理時(shí)間延長(zhǎng)而增加，6℃組下降，說(shuō)明低溫會(huì)抑制嗜異性粒細(xì)胞的增殖。單核細(xì)胞的百分比第1、5和10天總體上隨溫度降低都呈下降趨勢(shì)，尤其是在第5和10天，隨處理天數(shù)延長(zhǎng)26℃組先降后升，17℃組和6℃組下降明顯，可能與低溫抑制感染有關(guān)（成令忠等，2003）。

隨溫度下降，嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的百分比第1天均無(wú)顯著變化，第5天前者先升后降，后者先降后升，第10天前者增高，后者降低。隨處理時(shí)間延長(zhǎng)，26℃組和17℃組嗜酸性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的百分比變化趨勢(shì)相反，但6℃組嗜酸性粒細(xì)胞的百分比第5和10天顯著高于第1天，淋巴細(xì)胞的百分比未見(jiàn)明顯變化。嗜酸性粒細(xì)胞具有殺傷細(xì)菌、寄生蟲(chóng)的功能，也是免疫反應(yīng)和過(guò)敏反應(yīng)過(guò)程中極為重要的細(xì)胞，主要執(zhí)行天然免疫功能（成令忠等，2003），而淋巴細(xì)胞可分為T(mén)細(xì)胞、B細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞3類，T細(xì)胞受抗原刺激激活后參與細(xì)胞免疫，B細(xì)胞激活后與體液免疫有關(guān)（Davis et al，2008），兩者間潛在的權(quán)衡關(guān)系可能有利于維持適應(yīng)性免疫與天然免疫處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。沙漠地鼠龜（Gopherus agassizii）淋巴細(xì)胞的百分比在秋、冬季升高而嗜酸性粒細(xì)胞的百分比卻在夏季最高（Sandmeier et al，2016）；進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)證明，在偏離最適溫度范圍后，沙漠地鼠龜淋巴細(xì)胞的吞噬活性隨溫度下降而增強(qiáng)，這可能與呼吸類病原體增多有關(guān)（Slama et al，2022）。

3.3"" 溫度和時(shí)間對(duì)紅耳龜H/L及PHA-P反應(yīng)的影響

與血漿皮質(zhì)酮含量等激素類指標(biāo)可快速指示脊椎動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng)狀態(tài)不同，H/L變化更穩(wěn)定、需時(shí)更長(zhǎng)（Davis amp; Maney，2018；Flower et al，2018）。隨溫度下降，第1天紅耳龜H/L無(wú)明顯變化，第5天和第10天分別在17℃組和26℃組最高；隨處理時(shí)間延長(zhǎng)，26℃組H/L無(wú)明顯變化，17℃組第5天顯著高于第10天，6℃組第1天最高，說(shuō)明紅耳龜H/L變化受低溫影響波動(dòng)較大，尤其在入眠或出眠前后，這有助于紅耳龜快速適應(yīng)多變的溫度。研究表明，分布于我國(guó)南北兩地的黃喉擬水龜（Mauremys mutica）1齡幼龜，在其冬眠期間分別進(jìn)行急性高溫脅迫處理，發(fā)現(xiàn)南方種群更易受到冬眠期間溫度波動(dòng)的影響，表現(xiàn)出了更強(qiáng)的氧化應(yīng)激反應(yīng)（陳威等，2019）；模擬熱浪侵襲1周后再恢復(fù)至初始水平，黃喉擬水龜幼龜肝、脾臟指數(shù)下降，血漿溶菌酶活性和血清補(bǔ)體C4水平升高，恢復(fù)至常溫后這些指標(biāo)可恢復(fù)至初始水平，但抗氧化能力、熱休克蛋白含量和免疫力變化不大，可在一定程度上緩沖熱浪的威脅（Li et al，2021）。24℃組和28℃組紅耳龜H/L低于20℃組和32℃組，但同時(shí)表現(xiàn)出較高的血漿殺菌能力（吳海燕等，2021）。

本研究發(fā)現(xiàn)，與26℃組相比，10 d的17℃低溫刺激使紅耳龜對(duì)PHA-P的反應(yīng)提前至注射后24 h，但更低的6℃卻無(wú)前移或后延效應(yīng)。普通麝香龜（Sternotherus odoratus）的天然免疫能力對(duì)低溫較為敏感，暴露于5℃或10℃條件下48 h后殺菌能力和吞噬能力均有所增強(qiáng)（Goessling et al，2019），而溫度驟變可使中華鱉（Pelodiscus sinensis）機(jī)體血漿的皮質(zhì)酮水平增加，抑菌能力降低（申思仙等，2018）。紅耳龜亞成體20℃組對(duì)PHA-P的反應(yīng)在48 h、24℃組和28℃組在24 h和48 h、32℃組在24 h時(shí)最高，隨溫度升高反應(yīng)峰值前移但無(wú)明顯的組間差異，PHA-P的最大反應(yīng)值與血液中淋巴細(xì)胞的百分比升高有關(guān)（吳文欣等，2020）。灣鱷（Crocodylus porosus）在注射PHA-P后12 h趾蹼部位皮膚組織中粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的數(shù)量均高于對(duì)照組（Finger et al，2013）。對(duì)分布于北美地區(qū)的紅耳龜，從4月底至9月初逐月監(jiān)測(cè)其PHA-P反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)PHA-P的反應(yīng)峰值出現(xiàn)于5月底（Zimmerman et al，2010b）。17℃處理促使紅耳龜對(duì)PHA-P的反應(yīng)提前至注射后24 h，可能有助于提高其細(xì)胞免疫和體液免疫能力，來(lái)應(yīng)對(duì)多變的環(huán)境溫度。

4"" 結(jié)論

活體背甲下靜脈竇采血技術(shù)和外源注射PHA-P抗原的方法對(duì)紅耳龜傷害較小或無(wú)損傷，建議推廣應(yīng)用于其他龜類研究。低溫導(dǎo)致紅耳龜應(yīng)激反應(yīng)能力下降、嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的百分比等多種免疫指標(biāo)之間存在權(quán)衡關(guān)系，這些變化是其適應(yīng)低溫脅迫的生理學(xué)基礎(chǔ)之一。

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（責(zé)任編輯"" 熊美華）

Effects of Low Temperature on Hematological Indices and Response to

Phytohemagglutinin in the Red-eared Slider Turtle， Trachemys scripta elegans

ZHANG Yi‐fan， LIN Han‐yu， LI Song‐ming， WU Liang， DIAO Ying‐zhu， ZHANG Zhi‐qiang

（College of Animal Science and Technology， Anhui Agricultural University，" Hefei" 230036， P.R. China）

Abstract：In this study， we explored the effects of low temperatures on immune function and stress response in the red-eared slider turtle， Trachemys scripta elegans. Our aim was to reveal the physiological and immunological mechanisms of their adaptation to low-temperature environments， and provide basic data on their biological behavior as an invasive species. Healthy red-eared slider turtles purchased at the flower fair were exposed to three water temperatures （6℃， 17℃， and 26℃） for 10 days， with 10 turtles in each group. On day 1， 5 and 10， blood samples were collected from the dorsal cervical sinus and body mass， carapace length and width were measured. The percentage of different leukocytes and the ratio of heterophils to lymphocytes （H/L） were determined， and their response to the antigen， phytohemagglutinin-P （PHA-P）， was measured on day 10 after collecting blood samples. Results were as follows： （1） Temperature and time had no significant effects on or interaction with body mass， carapace length and width. On day 1， the percentage of basophils significantly increased at 6℃ and 17℃ （Plt;0.05）， but this effect was not observed on day 5 and day 10 （Pgt;0.05）. On day 5， the percentage of eosinophils and H/L increased and then decreased， the percentage of lymphocytes initially decreased and then increased， while the percentage of monocytes tended to decrease （Plt;0.05）. On day 10， the percentage of eosinophils increased， but the percentage of lymphocytes， heterophils and monocytes， and H/L decreased （Plt;0.05）. （2） After 10 days， the percentage of leukocytes， except for the basophils and H/L， showed significant differences within temperature groups （Plt;0.05）. （3） The response of the red-eared slider turtles to the PHA-P antigen peaked at 48 h， 24 h， and 48 h after injection in the 6℃， 17℃， and 26℃ groups， respectively， with no significant differences among the temperature groups （Pgt;0.05）. Red-eared slider turtles adapt to short-term low temperature stress by adjusting the proportions of different types of leukocytes， reducing stress response capacity， and altering immune response timing.

Key words：Trachemys scripta elegans; low temperature; lymphocytes; eosinophils; phytohemagglutinin; stress response