蔣漢文，蘇曙光，陳銳忠，黃小宇，黃嘉儀

作者單位：廣州市番禺區(qū)婦幼保健院病理科，廣東 廣州511402

陰道結(jié)節(jié)性惡性黑色素瘤（vagina nodular malignant melanoma，VNMM）是一種來源于女性生殖系統(tǒng)的惡性腫瘤。其具有生長迅速、侵襲性強(qiáng)［1］、惡性程度高、容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，過度的創(chuàng)傷及激惹均可能促使腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移播散。由于VNMM位置隱秘，早期臨床癥狀不明顯，難以被發(fā)現(xiàn)。惡性黑色素瘤作為不建議進(jìn)行組織活檢的極少數(shù)惡性腫瘤，臨床醫(yī)師如有懷疑，則應(yīng)在充分手術(shù)準(zhǔn)備下進(jìn)行擴(kuò)大切除及淋巴結(jié)清掃，否則會(huì)嚴(yán)重影響病人預(yù)后。與皮膚惡性黑色素瘤不同的是，由于陰道部位特殊，術(shù)后難以恢復(fù)。臨床醫(yī)師在沒有明確的病理診斷前禁止行根治術(shù)治療。因此術(shù)前通過無創(chuàng)檢查明確VNMM病理診斷具有重要意義，但國內(nèi)外均未有關(guān)于脫落細(xì)胞學(xué)診斷黏膜型惡性黑色素瘤的病例報(bào)道及病理研究。為此我們回顧1例VNMM的液基細(xì)胞學(xué)標(biāo)本，通過臨床資料、細(xì)胞學(xué)形態(tài)、免疫細(xì)胞化學(xué)及組織學(xué)對(duì)照等闡述VNMM的發(fā)病機(jī)制并總結(jié)其形態(tài)特征，為黏膜型惡性黑色素瘤無創(chuàng)性診斷提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2021年11月廣州市番禺區(qū)婦幼保健院病理科1例具有組織學(xué)及免疫組化對(duì)照的VNMM液基細(xì)胞學(xué)涂片及臨床資料。

1.2 方法 ①使用取樣毛刷刷取陰道壁腫物表面脫落的細(xì)胞并置于液基保存瓶內(nèi)固定。②液基保存瓶內(nèi)的細(xì)胞采用沉降法把細(xì)胞沉降至玻片后，行巴氏染色。③液基保存瓶剩余的保存液行離心處理，獲取沉淀物后經(jīng)4%中性緩沖福爾馬林固定，常規(guī)脫水處理，石蠟包埋，制成細(xì)胞蠟塊，切片厚度為3 μm，細(xì)胞切片經(jīng)蘇木精-伊紅（HE）染色。免疫細(xì)胞化學(xué)采用EnVision兩步法，行可溶性酸性蛋白（S-100）、人類黑色素瘤45蛋白（HMB45）、黑色素細(xì)胞分化標(biāo)志物（Melan A）及細(xì)胞角蛋白（CK）染色。④陰道活檢標(biāo)本經(jīng)4%中性緩沖福爾馬林固定，常規(guī)脫水處理，石蠟包埋，制成組織蠟塊，切片厚度為3 μm，組織切片經(jīng)HE染色。免疫組織化學(xué)采用EnVision兩步法，行S-100、HMB45、Melan A、CK、P63抑癌基因蛋白（P63）、雌激素受體（ER）及孕激素受體（PR）染色。免疫組織化學(xué)EnVision試劑盒及PR、ER染色購自羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司，S-100、HMB45、Melan A、CK及P63抗體均購自廈門通靈生物醫(yī)藥科技有限公司。以已知陽性切片作為陽性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料 女，52歲，主訴兩癌篩查時(shí)發(fā)現(xiàn)陰道結(jié)節(jié)狀腫物2 d，無陰道流血。體查發(fā)現(xiàn)陰道內(nèi)見右側(cè)壁近穹隆處見一約2 cm藍(lán)色腫物，黏膜糜爛，質(zhì)軟。陰道壁近陰道口處見不規(guī)則色素沉著，子宮、附件及全身皮膚均未見病變。陰道超聲提示陰道上1/3段黏膜下腫物，長徑約2.3 cm。既往史：高血壓病史2年余，否認(rèn)陰道、宮頸、宮腔及附件等部位疾病。

2.2 細(xì)胞病理學(xué) 液基細(xì)胞學(xué)由于細(xì)胞多形性、未見特征性的腺樣結(jié)構(gòu)，被誤診為非角化性鱗狀細(xì)胞癌（圖1～5）。行細(xì)胞蠟塊（圖6）及免疫細(xì)胞化學(xué)顯示HMB45（圖7）及Melan A（圖8）染色均顯示腫瘤細(xì)胞強(qiáng)陽性表達(dá)，而S-100則顯示個(gè)別細(xì)胞弱陽性表達(dá)，CK陰性表達(dá)。

2.3 組織病理學(xué) 陰道鏡下組織學(xué)活檢診斷為VNMM（圖9～12），伴陰道口黏膜層Paget's樣浸潤。HMB45及Melan A染色均顯示彌漫強(qiáng)陽性，而S-100顯示腫瘤深層（血供較好）細(xì)胞彌漫強(qiáng)陽，近黏膜表面（血供較差）的腫瘤細(xì)胞個(gè)別細(xì)胞散在陽性。

3 討論

女性生殖道惡性黑色素瘤主要包括結(jié)節(jié)型、淺表擴(kuò)散型及惡性雀斑型。而原發(fā)性陰道惡性黑色素瘤（primary malignant melanoma of the vagina，PMMV）在女性所有黑色素瘤中僅占0.3%～0.8%，5年生存率僅為5%～25%［1］。世界首宗PMMV由HAWK于1946年報(bào)道［2］，當(dāng)時(shí)HAWK認(rèn)為來源于上皮并以“黑色素癌”來描述這種具有黑色素顆粒的惡性腫瘤。由于惡性黑色素瘤的腫瘤細(xì)胞黏附性差，在早期階段就同時(shí)具備淋巴道及血道轉(zhuǎn)移能力。腫瘤在損傷、外力擠壓及局灶活檢取樣的情況下均可能提高其脈管轉(zhuǎn)移的概率，即使在活檢術(shù)后完整切除也會(huì)增加復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。因此無創(chuàng)性術(shù)前診斷具有相當(dāng)重要的意義。

3.1 起源 黑色素細(xì)胞是從胚胎發(fā)育過程中的神經(jīng)嵴細(xì)胞演變而來，并遷徙至表皮基底層待發(fā)育成熟后進(jìn)行黑色素顆粒合成。由于人體在胚胎發(fā)育過程中神經(jīng)嵴細(xì)胞在遷徙過程中可發(fā)生于黏膜或軟組織異位或迷路，所以少數(shù)人群在口腔、鼻腔、鼻竇、食道、喉、陰道、子宮頸、直腸和肛門的黏膜中可以發(fā)現(xiàn)黑色素細(xì)胞的存在［3］。目前，VNMM被認(rèn)為起源于這些迷路于陰道黏膜內(nèi)的黑色素細(xì)胞。

3.2 病因 由于陰道黏膜并非日光照射部位，因此暴露于紫外線照射導(dǎo)致BRAF-V600E基因突變的理論并不能解析這類黏膜型惡性黑色素瘤的發(fā)病機(jī)制。最新文獻(xiàn)［4］表明，發(fā)生于肛門和生殖器黏膜的惡性黑色素瘤通常是由KIT（32%）、TP53（22%）和NF1（19%）等基因改變導(dǎo)致。由于黏膜型惡性黑色素瘤大多發(fā)生于容易損傷并與機(jī)械摩擦相關(guān)的部位，如口腔、肛門、陰道及外陰等。暗示著長期黏膜糜爛、潰瘍可能是其誘發(fā)因素。受損組織產(chǎn)生的組織修復(fù)相關(guān)因子持續(xù)作用于黑色素細(xì)胞，使其發(fā)生增殖。而過度的增殖會(huì)提高上述基因發(fā)生改變的風(fēng)險(xiǎn)。這類負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、生長發(fā)育及凋亡的基因發(fā)生調(diào)控異常，最終發(fā)展為惡性黑色素瘤。

3.3 臨床表現(xiàn) 本例提示VNMM可以表現(xiàn)為陰道流血或無任何臨床癥狀，陰道見藍(lán)色結(jié)節(jié)狀腫物。有文獻(xiàn)［5］報(bào)道當(dāng)色素較多時(shí)通常表現(xiàn)為黑色，腫物質(zhì)軟，黏膜表面糜爛。超過一半的病例為無色素性息肉樣病變。

3.4 細(xì)胞病理學(xué) 本例VNMM在液基細(xì)胞學(xué)涂片中，腫瘤細(xì)胞主要以單個(gè)彌散分布，偶見排列松散且缺乏黏附性的細(xì)胞團(tuán)，無特殊排列結(jié)構(gòu)。細(xì)胞形態(tài)多樣，可呈上皮樣、橫紋肌樣（圖1），胞質(zhì)濃稠、無角化現(xiàn)象。腫瘤細(xì)胞體積大小不一，常見較多雙核及多核腫瘤細(xì)胞（圖2），有特征性的“八字狀”雙核細(xì)胞（圖3），偶見高度異型的多核瘤巨細(xì)胞。細(xì)胞核染色質(zhì)增粗，出現(xiàn)粗顆粒，可見特征性的核內(nèi)包涵體（圖4）及明顯核仁，個(gè)別細(xì)胞見病理性核分裂。部分腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)見具有提示性意義的黑色素顆粒（圖5）。

3.5 組織病理學(xué) Wohlmuth等［6］行最大宗病例研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)陰道惡性黑色素瘤表現(xiàn)為結(jié)節(jié)型，而淺表擴(kuò)散型及惡性雀斑型少見。通常鏡下形態(tài)顯示惡性細(xì)胞排列成片狀、巢狀及條索狀，細(xì)胞黏附性低。細(xì)胞形態(tài)多樣，從橢圓形到紡錘狀再到多邊形不等［1］。本例除上述的改變外，還見橫紋肌樣或上皮樣腫瘤細(xì)胞，含豐富嗜酸性胞質(zhì)。細(xì)胞核深染、見八字狀核（圖9）、雙核和多核巨細(xì)胞（圖10），有明顯的核仁、核內(nèi)包涵體（圖11）和豐富的核分裂象。細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)或間質(zhì)中可見黑色素顆粒（圖12），腫瘤細(xì)胞形態(tài)與液基細(xì)胞學(xué)涂片特征一致。

3.6 免疫細(xì)胞化學(xué)及免疫組織化學(xué) 細(xì)胞蠟塊（圖6）顯示免疫細(xì)胞化學(xué)HMB45（圖7）及Melan A（圖8）染色細(xì)胞胞質(zhì)呈強(qiáng)陽性表達(dá)，與免疫組織化學(xué)結(jié)果一致。但免疫細(xì)胞化學(xué)S-100僅個(gè)別細(xì)胞呈弱陽性表達(dá)，與免疫組織化學(xué)產(chǎn)生明顯差異，其主要原因是S-100參與細(xì)胞內(nèi)一系列活動(dòng)調(diào)節(jié)反應(yīng)，包括細(xì)胞增殖與分化，因此位于陰道壁表面的腫瘤細(xì)胞由于血供較少，細(xì)胞活性下降，導(dǎo)致S-100合成減少。讓我們關(guān)注到腫瘤微環(huán)境的異質(zhì)性會(huì)影響脫落細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)表達(dá)。其余標(biāo)記如CK、P63、ER、PR均陰性。

3.7 鑒別診斷 在液基細(xì)胞涂片中，由于不能完整觀察腫瘤整體形態(tài)結(jié)構(gòu)，診斷只能依據(jù)細(xì)胞學(xué)形態(tài)、細(xì)胞團(tuán)微結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞間黏附性，診斷難度遠(yuǎn)大于組織學(xué)。鑒別診斷包括：①非角化性鱗狀細(xì)胞癌，陰道最常見的惡性腫瘤。腫瘤常以無結(jié)構(gòu)的細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)，細(xì)胞擁擠，核質(zhì)比高。細(xì)胞核增大、深染、染色質(zhì)呈粗塊狀，偶見多核及巨核細(xì)胞，有明顯核仁，胞質(zhì)無角化現(xiàn)象，未見核內(nèi)包涵體，腫瘤素質(zhì)明顯。②陰道腺癌，雖然少見，但不乏文獻(xiàn)報(bào)道。與其他惡性腫瘤不同的是，腺癌通常有特征性的細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)。如子宮內(nèi)膜樣腺癌［7-8］，細(xì)胞團(tuán)具有葡萄串樣結(jié)構(gòu)，三維立體感強(qiáng)，細(xì)胞體積較小，具有透明的胞質(zhì)、可見泡狀核和明顯的核仁。細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可出現(xiàn)“中性粒細(xì)胞口袋” 的特征。而宮頸普通型腺癌，通常見于陰道殘端或原發(fā)于宮頸腺癌累及，細(xì)胞團(tuán)表現(xiàn)為具有“菊形團(tuán)”或“飛羽狀”結(jié)構(gòu)。腫瘤細(xì)胞呈高柱狀，細(xì)胞核拉長呈棒狀并偏位于細(xì)胞的一端，擁擠重疊。③橫紋肌肉瘤（rhabdomyosarcoma，RMS），其好發(fā)于陰道，但臨床較為少見，各類亞型中以胚胎性橫紋肌肉瘤（embryonal rhabdomyosarcoma，ERMS）占比最高，占75%以上［9］，通常見于兒童。其中分化型與中間型ERMS均可見圓形、梭形、上皮樣及橫紋肌樣的腫瘤細(xì)胞、部分病例可見形態(tài)多樣的瘤巨細(xì)胞（間變性）及多核細(xì)胞。相比ERMS，多形性橫紋肌肉瘤（pleomorphic rhabdomyosarcoma，PRMS）發(fā)病年齡與形態(tài)更接近VNMM，也是主要鑒別診斷之一，但發(fā)生于陰道的更為罕見。鏡下具有高度異型橫紋肌母細(xì)胞［10］，細(xì)胞多形性非常突出，可見胞質(zhì)豐富的瘤巨細(xì)胞、多核細(xì)胞，細(xì)胞核高度異型、核仁大而明顯并見大量核分裂像。各型RMS免疫組化均可表達(dá)Myogenin、MyoD1、Desmin等橫紋肌源性標(biāo)記。④陰道藍(lán)痣，極為罕見［11］，臨床表現(xiàn)為斑片狀痣樣腫物，由于外觀顏色與NVMM相同呈藍(lán)色，臨床醫(yī)師很容易誤診為惡性黑色素瘤。由于藍(lán)痣不會(huì)侵襲陰道黏膜上皮，因此表面黏膜完整，在液基細(xì)胞學(xué)中表現(xiàn)為大量正常的鱗狀上皮，未見色素性細(xì)胞及異型細(xì)胞。⑤絨毛膜細(xì)胞癌，原發(fā)于陰道［12］十分罕見，多見于生育年齡的婦女，伴血液β-hCG升高。鏡下見大量散在的核型不規(guī)則的瘤巨細(xì)胞，細(xì)胞異型性極大，其中見大而深染的多核細(xì)胞，伴有大而形態(tài)多樣的單核細(xì)胞，核大、深染、多形性明顯。細(xì)胞具有中等到豐富的淡染或空泡樣的胞質(zhì)［13］。

3.8 治療 惡性黑色素瘤的治療主要以手術(shù)方式為主，并需要一次性完全切除。保守性術(shù)式和廣泛性術(shù)式是國內(nèi)VNMM手術(shù)方式的主要分類［14］。其中，保守性術(shù)式包含局部擴(kuò)大切除術(shù)（切緣距腫瘤邊緣1～2 cm）及部分陰道切除術(shù)。廣泛性術(shù)式包含外陰陰道廣泛切除術(shù)、根治性子宮及全陰道切除術(shù)及盆腔臟器去除術(shù)等。而在美國，其手術(shù)切緣的范圍可根據(jù)Breslow厚度為標(biāo)準(zhǔn)［6］，原位黑色素瘤的切緣為0.5～1.0 cm；Breslow厚度≤1 mm的侵襲性黑色素瘤切緣為1 cm；Breslow厚度為1.01～2.00 mm的手術(shù)切緣為1～2 cm；Breslow厚度≥2.01 mm的手術(shù)切緣為2 cm，并可同時(shí)進(jìn)行前哨淋巴結(jié)活檢。但讓人意外的是，回顧性數(shù)據(jù)表明，而更激進(jìn)的手術(shù)方案（根治性手術(shù)）不具有更大的收益［6］。此外，VNMM的治療除了放療、化療等傳統(tǒng)方案，還包括靶向治療及免疫學(xué)治療等。如免疫療法PD-1/PD-L1抑制劑［15］及靶向藥物納武單抗也相繼用于惡性黑色素瘤的治療［16］。

綜上所述，在婦科液基細(xì)胞學(xué)中觀察到腫瘤細(xì)胞具有明顯的大核仁、核內(nèi)包涵體及胞質(zhì)內(nèi)含色素顆粒是十分罕見。這種特征性改變不會(huì)在鱗狀細(xì)胞癌或腺癌中出現(xiàn)。結(jié)合臨床提示藍(lán)色或黑色的結(jié)節(jié)狀外觀，應(yīng)首先考慮惡性黑色素瘤可能。