胡騫予,趙婭紅,呂怡穎,鄧晨宵,肜 磊,盧 超,余 磊,戴利利,齊 穎,高鵬華,蔡憲杰,閆 鼎,黃飛燕,韓天華

(1.昆明學院/云南省都市特色農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心,昆明 650214;2.上海煙草集團有限責任公司,上海 200082;3.云南省煙草公司麗江市公司,云南 麗江 674100)

【研究意義】近年來,關(guān)于土壤健康和土壤質(zhì)量問題逐漸成為人們關(guān)注的熱點。土傳病害頻發(fā)導致作物大量減產(chǎn),為保護土壤資源,踐行可持續(xù)發(fā)展,生物炭在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中得到廣泛應用[1]。生物炭是生物質(zhì)在缺氧或無氧條件下經(jīng)高溫裂解后產(chǎn)生的一類富含碳元素的高度羧酸酯芳香有機物[2]。因其碳質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定不易被生物降解,孔隙發(fā)達具有強吸附能力[3],施入土壤可以改變土壤理化性質(zhì),繼而影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。土壤根際微生物對環(huán)境的變化具有高敏感性[4],在一定程度上反映著土壤質(zhì)量[5]?！厩叭搜芯窟M展】馮慧琳等[6]研究表明,施用生物炭1.2 t/hm2可提高感染青枯病煙株根際土壤的碳氮比,影響根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu),降低厚壁菌門等致病菌豐度,維持根際土壤微生態(tài)的健康,促進煙株健康發(fā)育,降低發(fā)病率。王博等[7]研究表明,在減氮40%的條件下,施用生物炭可以提高煙株根系活力,促進根系發(fā)育,提高根際土壤微生物數(shù)量。許躍奇等[8]研究表明,有機肥與生物炭配施可以提高煙田褐土土壤細菌與真菌、放線菌和真菌的比值,改善土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。何甜甜等[9]研究表明,等碳量添加秸稈和生物炭,可以提高土壤呼吸速率及微生物生物量,生物炭與秸稈的交互效應為正值。楊敏等[10]研究表明,施用生物炭可以提高連作烤煙根際土壤微生物多樣性與豐富度,改良土壤微生態(tài)環(huán)境,緩解化感自毒引起的連作障礙?！颈狙芯壳腥朦c】目前,通過施用生物炭來改良修復植煙區(qū)土壤、調(diào)整微生物種群結(jié)構(gòu)、提高煙葉質(zhì)量與產(chǎn)量的研究較多?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過高通量測序技術(shù),深入討論施用不同量生物炭對煙草生長發(fā)育較關(guān)鍵的旺長期煙株根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)和種群功能的變化,以期為云南地區(qū)植煙土壤的保育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 處理設置與根際土壤樣品采集

試驗于2019年6月5日在安寧市植煙區(qū)開展,供試煙草品種為紅花大金元,供試生物炭基本理化性狀見表1。試驗設置3種處理,在常規(guī)施肥減量10%的情況下,分別施用生物炭250 g/株(A1)、300 g/株(A2)、350 g/株(A3),以常規(guī)施肥為對照(CK)。每個處理植煙100株,3次重復,隨機排列。所有處理栽培條件按照當?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)方式進行。

表1 供試生物質(zhì)炭的基本理化性狀Table 1 The basic physicochemical properties of experimental biomass charcoal

采用“S”形5點取樣法采集土壤樣品,在旺長期(移栽后30 d)采集每處理近煙株根部10 cm處、直徑3 cm、深度15 cm的根際土壤樣品約1000 g,重復3次。每份土壤樣品充分混勻后分為2份,1份裝入無菌袋中迅速放入干冰盒中,帶回實驗室放入-80 ℃冰箱保存待用。

1.2 土壤總DNA提取及PCR擴增

煙株根際土壤樣本DNA的提取參照 PowerSoil?DNA土壤基因組DNA試劑盒說明書。選用1 ng/μL DNA作為模板,ITS1基因PCR擴增選用真菌ITS基因特異性引物 ITS1F (5′-CTTGGTCATTT-AGAGGAAGTAA-3′)和 ITS2R(5′-TGCGTTCTTCATC GATGC-3′)[11]。擴增程序:預變性,95 ℃ 3 min;變性,95 ℃ 3 s;退火,55 ℃ 30 s;延伸,72 ℃ 45 s;再延伸,72 ℃ 10 min,共36個循環(huán),擴增體系為20 μL。擴增產(chǎn)物進行質(zhì)量檢測后純化回收(參照AxyPrep DNA試劑盒方法),委托上海美吉生物進行Illumina MiSeq測序。

1.3 測序數(shù)據(jù)的處理與統(tǒng)計分析

剔除下機數(shù)據(jù)中的標簽及引物序列,進行序列拼接得到原始數(shù)據(jù);使用軟件 Usearch(version 7.0)進行過濾,去嵌合體序列,得到有效序列;利用軟件Mothur 繪制稀釋度曲線(圖1),判定此次測序量能否真實反映樣品中真菌實際情況;同時計算文庫覆蓋率、Chao1、ACE、Shannon、Simpson指數(shù),對根際土壤真菌群落中的物種多樣性和豐富度進行評價;在 97%相似性水平上用軟件 Uparse 進行 OTUs 聚類分析;利用 SILVA 數(shù)據(jù)庫和軟件 RDP classifier對物種進行注釋,并運用 Student’sT檢驗對排名前10 菌屬的相對豐度數(shù)據(jù)進行假設檢驗;使用軟件Qiime 進行主成分分析;采用FUNGuild進行真菌功能預測;運用軟件Excel 2017、SPSS 23.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。

圖1 稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤樣品測序深度驗證

通過對4組根際土壤進行Illumina MiSeq高通量測序分析,共得到有效序列18 7920條,平均覆蓋率超過99%,當測序深度達到40 000時,曲線趨于平緩,說明序列數(shù)的進一步增加不會引起較多新 OTU 的出現(xiàn)。本次對煙株根際土壤的測序深度趨于飽和,真菌群落置信度較高,能夠較為全面的反映根際土壤樣品真菌群落與結(jié)構(gòu)的真實情況。

2.2 真菌的OTU豐度和α多樣性

由表2可知,各處理真菌群落Shannon指數(shù)表現(xiàn)為A3>A2>A1>CK,Simpson指數(shù)表現(xiàn)為A2>CK>A1>A3,ACE指數(shù)與Chao1指數(shù)均表現(xiàn)為A3>CK>A2>A1。Coverage值均在99.19%以上,反映出測序結(jié)果可以代表樣本真實情況。由α多樣性指數(shù)可以看出,A3處理真菌群落多樣性及豐富度最高。

表2 不同處理根際土壤真菌α多樣性Table 2 α diversity of fungi in different treatments of rhizosphere soils

2.3 OTU水平樣品主成分分析

主成分分析中,2個主坐標成分是PC1和PC2,PC1主坐標成分表示盡可能最大程度地解釋數(shù)據(jù)變化,PC2主坐標成分解釋余下變化度中比例最大的主坐標成分,樣本間距離表示樣本間相似程度,距離越近說明真菌群落間差異越小。如圖2所示,主成分1解釋真菌群落變異的45.58%,主成分2解釋變異的35.26%,兩者共同解釋80.84%。

圖2 OTU水平樣品主成分分析Fig.2 PCoA on OTU level

2.4 真菌群落結(jié)構(gòu)及差異

門水平(圖3-A)上,子囊菌門(Ascomycota)在各處理中均占絕對優(yōu)勢,其次是擔子菌門(Basidiomycota)和被孢霉門(Mortierellomycota)。子囊菌門的相對豐度隨著生物炭施用量的增大而逐漸降低,A1、A2、A3較CK(78.63%)分別降低2.72%、15.66%、17.50%;與子囊菌相反,擔子菌門的相對豐度與生物炭的施用量呈正相關(guān),隨著生物炭施用量的增大各處理較CK(6.53%)相對豐度分別提高9.65%、75.65%、191.58%。被孢霉門在CK中的相對豐度為10.17%,A2處理較CK增加45.33%,A1、A3處理較CK分別降低34.81%、8.46%,無明顯變化趨勢;A1、A2、A3處理中未知分類的真菌門的相對豐度較CK(3.59%)分別增加35.93%、72.98%、54.60%;壺菌門在CK中的相對豐度為0.79%,A1處理中增加479.75%,A2、A3處理較CK分別降低58.23%、13.92%,無明顯變化趨勢。

圖3 門和綱水平上的相對豐度Fig.3 Community abundance on phylum and class level

綱水平(圖3-B)上,檢測出主要的種群有糞殼菌綱(Sordariomycetes)、散囊菌綱(Eurotiomycetes)、座囊菌綱(Dothideomycetes)和被孢霉綱(Mortierellomycetes)等。其中糞殼菌綱、散囊菌綱、座囊菌綱和錘舌菌綱為子囊菌門;傘菌綱(Agaricomycetes)、銀耳綱(Tremellomycetes)為擔子菌門;根囊壺菌綱(Rhizophlyctidomycetes)為壺菌門。在施用生物炭處理中,糞殼菌綱相對豐度表現(xiàn)為CK(33.35%)>A2(31.92%)>A1(29.94%)>A3(24.97%);散囊菌綱相對豐度表現(xiàn)為CK(25.63%)>A3(19.73%)>A1(14.99%)>A2(13.61%),表明施用生物炭處理降低了糞殼菌綱和散囊菌綱相對豐度。傘菌綱相對豐度表現(xiàn)為A3(13.83%)>A2(5.37%)>CK(2.38%)>A1(1.53%);銀耳菌綱相對豐度表現(xiàn)為A2(6.03%)>A1(5.19%)>A3(4.47%)>CK(3.76%),表明施用生物炭處理提高了傘菌綱和銀耳菌綱的相對豐度。被孢霉綱相對豐度表現(xiàn)為A2(14.52%)>CK(10.09%)>A3(9.23%)>A1(6.58%);錘舌菌綱相對豐度表現(xiàn)為A1(8.64%)>CK(2.96%)>A3(1.56%)>A2(0.62%),表明施用生物炭處理對被孢霉綱和根囊壺菌綱無明顯的影響。

由圖4可知,屬水平上,主要檢測出被孢霉屬(Mortierella)、青霉菌屬(Penicillium)和鐮刀菌屬(Fusarium)等合并相對豐度大于3%的菌屬16類。

圖4 屬水平上的相對豐度Fig.4 Community abundance on genus level

青霉菌屬在各處理中相對豐度表現(xiàn)為CK(16.65%)>A3(11.71%)>A1(8.97%)>A2(2.55%);未知分類毛殼菌科屬在各處理中相對豐度表現(xiàn)為CK(5.37%)>A1(5.02%)>A2(1.63%)>A3(1.59%);枝孢瓶霉屬在各處理中相對豐度表現(xiàn)為CK(3.13%)>A3(2.43%)>A1(2.35%)>A2(2.32%);表明青霉菌屬、未知分類毛殼菌科屬和枝孢瓶霉屬生物炭處理的相對豐度均低于對照。鐮刀菌屬在各處理中相對豐度表現(xiàn)為A2(8.28%)>A1(5.94%)>A3(5.83%)>CK(5.82%);未分類的真菌菌群各屬在各處理中相對豐度表現(xiàn)為A2(6.21%)>A3(5.55%)>A1(4.88%)>CK(3.59%);Saitozyma在各處理中相對豐度表現(xiàn)為A2(4.38%)>A1(3.61%)>A3(2.93%)>CK(2.28%);錐蓋傘屬在各處理中相對豐度表現(xiàn)為A3(5.01%)>A2(3.52%)>A1(0.80%)>CK(0.00);附球菌屬在各處理中相對豐度表現(xiàn)為A2(5.15%)>A3(1.17%)>A1(0.36%)>CK(0.36%);表明鐮刀菌屬、未分類的真菌菌群、Saitozyma、錐蓋傘屬、附球菌屬5個屬的菌群在生物炭處理中的相對豐度均高于對照。被孢霉屬在各處理中相對豐度表現(xiàn)為A2(14.52%)>CK(10.09%)>A3(9.23%)>A1(6.58%); 未分類的子囊菌群體各屬在各處理中相對豐度表現(xiàn)為A1(15.03%)>A2(6.83%)>CK(5.34%)>A3(4.95%),表明這2種菌屬受生物炭影響較小。

屬分類水平上,根據(jù)所有樣品的物種注釋及豐度信息,選取根際土壤真菌豐度排名前35的物種,并按照其豐度信息繪制熱圖(圖5),結(jié)果發(fā)現(xiàn)CK與A3處于同一分支,表明2組樣品真菌群落結(jié)構(gòu)相似。在所有樣品中,錐蓋傘屬、未知傘菌綱屬、附球菌屬聚為一類,相對豐度與生物炭的施用量呈正相關(guān)。樹粉孢屬、淡紫紫孢菌、Rhizophlyctis受生物炭影響較大,三者在A1處理中的相對豐度最高。Paraboeremia、Phialophora在CK和A3處理中相對豐度較低,在A2處理中相對豐度較高,無明顯變化。

圖5 屬水平真菌群落分布Fig.5 Community analysis on genus level

2.5 煙株根際土壤真菌功能預測分析

如圖6所示,對4組樣品利用FUNGuild進行真菌功能預測,以營養(yǎng)方式分類,包括病理營養(yǎng)型(Pathotroph)、腐生營養(yǎng)型(Saprotroph)和共生營養(yǎng)型(Symbiotroph),基于營養(yǎng)方式進一步補充細分,可見未定義腐生營養(yǎng)型(Undefined Saprotroph)、未知營養(yǎng)型(Unknown)、植物內(nèi)生-垃圾腐生-土壤腐生-未定義腐生營養(yǎng)型(Endophyte-Litter Saprotroph-Soil Saprotroph-Undefined Saprotroph)這3種營養(yǎng)型群類豐度較高。其中,未定義腐生營養(yǎng)型群類對應真菌有青霉菌屬、木霉菌屬(Trichoderma)、枝孢瓶霉屬等;植物內(nèi)生-垃圾腐生-土壤腐生-未定義腐生營養(yǎng)型群類對應的只有被孢霉屬。動植物病原-植物病原-未定義腐生營養(yǎng)型(Animal Pathogen-Plant Pathogen-Undefined Saprotroph)群類豐度在A2和A3處理中有上升趨勢;動物病原-排泄物腐生菌-植物內(nèi)生-體表附生-植物腐生-木質(zhì)腐生營養(yǎng)型(Animal Pathogen-Dung Saprotroph-Endophyte-Epiphyte-Plant Saprotroph-Wood Saprotroph )群類對應毀絲霉屬(Myceliophthora)、Mycothermus、毛霉菌屬(Mucor)、Dichotomopilus、毛科菌屬(Chaetomium)、Melanocarpus,豐度隨生物炭施用量的增加而下降;植物病原營養(yǎng)型(Plant Pathogen)群類對應不整球殼屬(Plectosphaerella)、赤霉屬(Gibberella)、Curvularia、麥角菌屬(Clavicep)和Aplosporella等植物病原真菌,這些種群豐度的降低表明施加生物炭可以減緩連作導致的煙草土傳真菌病害。

圖6 土壤真菌FUNGuild功能分類統(tǒng)計Fig.6 Functional classification and statistics of soil fungi by FUNGuild

3 討 論

本研究通過不同生物炭施用量探究其對煙株根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明,施用生物炭可以提高煙株根際土壤真菌多樣性,Shannon指數(shù)隨生物炭施用量的增加而上升,A1、A2、A3處理較CK分別增加1.09%、6.33%、6.55%;Chao1、ACE指數(shù)均在A3處理中最高。土壤理化性質(zhì)與土壤微生物的存活息息相關(guān),微生物依賴于土壤所供給的有機質(zhì),并且對土壤生態(tài)環(huán)境的變化具有高敏感性[9-10]。生物炭中的空隙可以提高土壤的透氣性,增加土壤養(yǎng)分含量,為微生物提供更適宜的生存環(huán)境。研究普遍認為,微生物群落結(jié)構(gòu)越復雜,總體水平越高,越有利于維持土壤生態(tài)系統(tǒng)的平衡。相反,微生物群落總體水平降低,豐富度及多樣性指數(shù)降低,則會導致土壤生態(tài)系統(tǒng)抗逆性[12-13]、響應脅迫的修復能力變差[14]。本研究中A3處理煙株根際土壤真菌多樣性和豐富度有所提高,在一定程度上有利于維持根際土壤微生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和抗逆性。

本研究中,各處理根際土壤優(yōu)勢菌群為子囊菌門、擔子菌門、被孢霉門,與前人研究結(jié)果相同[15-16]。其中,擔子菌門與生物炭施用量呈正相關(guān),子囊菌門與施用生物炭量呈負相關(guān),施用生物炭后優(yōu)勢真菌種群結(jié)構(gòu)和豐度發(fā)生改變,這一改變可能與真菌的不同生態(tài)策略有關(guān)[17]。子囊菌門大多數(shù)為腐生菌,其相對豐度與土壤含水量呈正相關(guān),施用生物炭改變了土壤結(jié)構(gòu),透氣性增強可能是造成其相對豐度下降的原因;擔子菌門腐生或寄生,在潮濕的土壤中分解木質(zhì)纖維素[18],且擔子菌門可與植株根系共生形成菌根,提高植株對養(yǎng)分的吸收和利用。錐蓋傘屬(傘菌綱)多腐生于中性或略堿性營養(yǎng)豐富的土壤中[19],對土壤中的纖維素具有強分解活力。擔子菌門(Saitozyma)相對豐度在施用生物炭后顯著提高,該類真菌可有效修復土壤污染,促進土壤中氮、磷、鉀元素的礦化[20]。糞殼菌綱和散囊菌綱是導致果樹和林木煤污病的致病真菌,而糞殼菌綱下屬麥角菌屬的衍生物麥角酸能夠?qū)е伦魑餃p產(chǎn)、人和家畜中毒,此類菌群相對豐度的降低表明生物炭可以改良土壤環(huán)境,減少有害菌數(shù)量。

FUNGuild真菌功能預測表明,在所有處理中未定義腐生真菌、未知營養(yǎng)型、腐生營養(yǎng)型-共生營養(yǎng)型真菌相對豐度較高。植物內(nèi)生-垃圾腐生-土壤腐生-未定義腐生營養(yǎng)型、動植物病原-植物病原-未定義營養(yǎng)型相對豐度變化較大。植物病原營養(yǎng)型中不整球殼屬(Plectosphaerella)、赤霉屬(Gibberella)、Curvularia、麥角菌屬(Clavicep)和Aplosporella等植物病原真菌相對豐度隨生物炭施用量的增加而降低。

4 結(jié) 論

施用生物炭提高了煙草根際土壤真菌的多樣性,改善了土壤真菌的群落結(jié)構(gòu),表現(xiàn)為擔子菌門相對豐度提高,子囊菌門相對豐度降低;腐生營養(yǎng)型和病理營養(yǎng)型真菌相對豐度降低,錐蓋傘屬、Saitozyma等有益菌相對豐度提高。表明合理施用生物炭可以改良土壤真菌群落結(jié)構(gòu),促進植煙土壤的生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定。