張 昂,張堯榆,盧志青,李麗華,董云萍,林興軍,趙青云,孫 燕,譚 軍,龍宇宙

(1. 中國熱帶農業(yè)科學院香料飲料研究所/海南省熱帶香辛飲料作物遺傳改良與品質調控重點實驗室/農業(yè)農村部香辛飲料作物遺傳資源利用重點實驗室,海南 萬寧 571533;2. 云南省董云萍專家工作站, 云南 普洱 665099;3. 云南省閆林專家工作站, 云南 普洱 665099;4. 云南農業(yè)大學熱帶作物學院,云南 普洱 665000)

【研究意義】咖啡是世界三大飲料之一,經濟價值較大。咖啡在我國種植面積超過1.2×105hm2,生豆產量達1.7×105t,其產區(qū)主要集中于云南、海南、廣東和廣西等熱帶亞熱帶地區(qū),也是我國熱帶地區(qū)重要的經濟作物。因此,大力推廣特色咖啡產業(yè)、提高咖啡種植收益,已成為推動農民致富、鄉(xiāng)村振興的主要途徑之一[1]?？Х葘儆跍\根系作物,其根系分布在10～30 cm土層中[2],傳統(tǒng)上以覆蓋栽培為主要生產模式[3],一般使用椰糠、秸稈等農林廢棄物進行覆蓋栽培,用以保持水土、改善土壤微環(huán)境、維護根系健康[4]?；兽r藥在土壤中的累積嚴重威脅咖啡植株健康,加劇咖啡園早衰減產現象。不僅如此,咖啡生果附加值低、咖啡副產物大量損失還造成環(huán)境污染與大量資源浪費。因此,采用咖啡凋落物與果皮代替?zhèn)鹘y(tǒng)覆蓋物進行生態(tài)循環(huán)栽培,既減少咖啡生產過程中化肥和除草劑等投入品用量、降低咖啡栽培勞動強度與生產成本,又推動咖啡廢棄物資源的循環(huán)利用,提高咖啡的綜合利用率,成為提高咖啡種植效益和相關產業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要舉措?！厩叭搜芯窟M展】土壤微生物作為土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分,不僅調節(jié)土壤養(yǎng)分循環(huán)和物質交換等過程,還影響動植物的生長發(fā)育以及作物的生產力,進而改變農田生態(tài)系統(tǒng)多樣性與穩(wěn)定性[5-6],成為表征土壤健康的重要指標之一。研究表明,種植模式變化主要通過改變農田微環(huán)境或影響不同生物間互作關系等途徑直接或間接調控土壤中微生物群落[7]。例如,覆蓋栽培不僅能夠通過提高土壤水分含量、促進土壤養(yǎng)分累積、增強土壤生物活性等途徑促進土壤微生物多樣性[8],還能夠通過加速有益菌之間的協(xié)同演替,進而改善土壤微生物群落結構[9-10]。覆蓋栽培同樣可能對土壤微生物群落產生消極作用,研究表明農業(yè)廢棄物覆蓋通過加速土壤致病菌群落繁殖,導致土壤微生物群落失衡,加劇土傳病害的發(fā)生[11]。因此,不同咖啡廢棄物覆蓋對咖啡園土壤微生物的影響仍需進一步探究。土壤微生物群落結構和功能的變化能夠影響作物的生長,然而作物新陳代謝或死亡分解產生的有機物、蛋白質和多糖又對土壤的理化性質、微生物群落結構和功能產生反饋作用[12]。因此伴隨咖啡廢棄物的分解過程,土壤微生物群落結構和功能存在較大差異。首先,咖啡果皮與枯落物自身性質(養(yǎng)分含量、機械強度等指標)的互異,導致其主要的分解微生物類群存在顯著差異[13]。其次,咖啡果皮和枯落物的分解產物可能具有一定的化感作用,不同土壤微生物群落對不同咖啡廢棄物分解產物的響應機制可能存在顯著差異[14]。再次,咖啡廢棄物的分解過程主要有環(huán)境因子調控的前期快速失重階段以及由土壤微生物驅動的后期長時間裂解階段[15]。在不同的分解階段,土壤微生物群落演替會受到咖啡果皮和枯落物殘量的影響[16],導致土壤微生物群落結構與功能在咖啡廢棄物的不同分解階段,隨著有機殘體的演變而發(fā)生變化[17-18]。此外,咖啡廢棄物的覆蓋同樣能夠通過改變土壤微環(huán)境進而調控土壤微生物群落結構[17, 19]。前人研究表明,咖啡園中覆蓋咖啡廢棄物能夠顯著提高土壤堿解氮和速效鉀含量,對提升土壤微生物群落多樣性具有積極作用,但過量的果皮施用會導致土壤酸化,對土壤微生物群落多樣性和結構穩(wěn)定產生消極作用[19]?！颈狙芯壳腥朦c】目前仍尚不清晰不同廢棄物對土壤微生物群落的影響,咖啡土壤微生物對咖啡果皮和枯落物覆蓋的響應機制仍需進一步探究?！緮M解決的關鍵問題】本研究通過監(jiān)測不同咖啡廢棄物覆蓋下微生物群落結構與功能差異,明確土壤理化性質及微環(huán)境與微生物群落結構及功能的內在關系,闡明咖啡廢棄物分解驅動土壤微生物群落結構變化的關鍵調控因子,為咖啡園土壤健康保育技術開發(fā)提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗地概況

實驗樣地位于海南省東部萬寧市興隆熱帶植物園(110°11′ E,18°44′ N,海拔 36 m)。該地位于南亞熱帶與熱帶氣候過渡帶,屬熱帶季風氣候,雨熱資源充足,年降水量2100 mm,年日照時長大于1750 h。該地區(qū)土壤分類主要為磚紅壤,土壤pH 6.15,有機質含量22.06 g/kg,土壤總氮含量1.49 g/kg,土壤總磷含量1.28 g/kg,土壤全鉀含量6.29 g/kg。

1.2 實驗設計

實驗采取隨機區(qū)組設計,共設置未覆蓋咖啡廢棄物(C)、覆蓋咖啡枯落物(L)、覆蓋咖啡果皮(P)和同時覆蓋咖啡枯落物及果皮(PL)4種覆蓋處理。前期通過隨機調查海南咖啡種植園現存咖啡枯落物和果皮累積量,計算得到咖啡枯落物平均累積量為301.39 g/m2,果皮的平均累積量為239.05 g/m2,本試驗按照平均累積量對咖啡廢棄物進行等量添加,具體添加量根據樹盤面積(咖啡植株垂直投影面積)進行換算。咖啡果皮覆蓋土壤表面,不進行翻耕等處理。每個覆蓋處理重復4次。所有咖啡植株采用相同的水肥處理,即統(tǒng)一按照傳統(tǒng)咖啡植株生產模式進行澆水和施肥。

1.3 實驗材料

本研究采用中粒種咖啡熱研1號(CoffeacanephoraPierre ex A. Froehner cv. Reyan No.1)?？Х瓤萋湮锸占谥袊鵁釒мr業(yè)科學院香料飲料研究所咖啡種質資源圃,咖啡果皮收集于海南省興隆華僑農場太陽河咖啡加工廠,枯落物與果皮來源于與本研究相同的品種。

1.4 實驗方法

1.4.1 取樣方法 于2021年9月對土樣進行收集,采用3點法進行采樣,以土鉆法將同一樣點的3個土鉆樣品混合獲得0～20 cm耕層土壤樣品,其中一部分混合樣品在實驗室內風干后過1 mm篩,用于測定土壤理化性質,另一部分于混合取樣后立即保存于-80 ℃超低溫冰箱,用于土壤微生物豐度和多樣性測定。

1.4.2 土壤理化性質測定方法 土壤含水量(Soil moisture content,SM)和容重(Bulk density,BD)測定固定體積下土壤鮮重和干重,土壤含水量=(土壤干重/土壤鮮重)×100%,土壤容重=土壤干重/土壤體積。土壤pH使用FE28型pH計測定,有機質(Soil organic matter,SOM)采用總有機碳分析儀(Multi N/C 3100)測定,堿解氮(Alkali hydrolyzed nitrogen, SAN)采用堿解擴散法測定,速效磷(Soil available phosphorus, SAP)采用紫外分光光度計法測定, 速效鉀(Soil available potassium, SAK)采用火焰光度計法測定。具體測定方法參照鮑士旦[20]主編的《土壤農化分析》(第三版)。

1.4.3 土壤微生物測定方法 土壤總DNA采用DNA提取試劑盒提取和純化[20]。具體方法是利用標記有barcode的引物序列(細菌:967F/1046R;真菌:ITS1F12/ITS2)擴增相應土壤細菌 16SrRNAV3-4區(qū)片段和真菌 ITS-1 序列片段,以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測產物片段長度,根據定量檢測結果,將擴增產物混合為1個樣本,構建克隆文庫;利用Illumina MiSeq高通量平臺測序,數據經Flash軟件雙端序列拼接、質控、去接頭后獲得優(yōu)化序列,基于優(yōu)化序列進行 OTU聚類,獲得 OTU豐度表,用于后續(xù)細菌多樣性指數及細菌群落構成分析。FAPROTAX(v1.2.1)和FUNGuild(v1.0)軟件分別用于預測和分析具有不同功能的土壤細菌和真菌群落的相對豐度[21]。

1.5 數據分析

采用SAS v8軟件進行雙因素方差分析,以枯落物覆蓋和果皮覆蓋為2個固定因素,區(qū)組為隨機因素,比較土壤理化性質指標和細菌豐度、細菌豐富度、細菌多樣性指數、真菌豐度、真菌豐富度、真菌多樣性指數等土壤微生物群落指標在不同處理下是否存在顯著差異[22]。采用SPSS 23.0軟件進行線性相關分析,用于計算不同土壤指標與土壤微生物群落之間的相關關系[23];使用CANOCO 5.0軟件進行典型相關分析(CCA),用于明確影響土壤微生物群落結構的主要環(huán)境因子,分析過程中選擇 manual forward selection 程序使用具有499個排列的蒙特卡羅測試,以確定環(huán)境變量參數的顯著性[23-24]。Spearman的等級相關性分析用于測試土壤微生物優(yōu)勢群落與土壤理化性質之間的關聯(lián)度[23-24]。使用Origin 9.1和R 4.0.3進行數據繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同咖啡廢棄物覆蓋對土壤理化性質及微環(huán)境的影響

雙因素方差分析結果(表1)表明咖啡果皮與枯落物覆蓋處理不影響土壤pH、溫度、水分含量、有機質含量和速效磷含量,且兩種處理對上述指標的影響不存在交互效應?？Х裙じ采w顯著提高土壤速效鉀含量和土壤堿解氮含量(P<0.05,下同),但咖啡枯落物覆蓋不影響上述2個指標,且兩種處理對上述指標的影響不存在交互效應(表1～2)。

表1 不同覆蓋模式對土壤微環(huán)境及理化性質的雙因素方差分析結果(F值)Table 1 Results of two-way ANOVA on soil micro-climate, physical and chemical properties under different mulching patterns (F value)

表2 不同咖啡廢棄物覆蓋模式下土壤理化性質Table 2 Soil physicochemical properties under different mulching patterns

2.2 不同咖啡廢棄物覆蓋對土壤微生物群落多樣性的影響

咖啡果皮與枯落物覆蓋處理不影響細菌群落豐度、真菌群落豐度、真菌豐富度和多樣性,且兩種處理對上述指標的影響不存在交互效應(表3)?？Х裙わ@著提高細菌群落豐富度和細菌群落多樣性,但咖啡枯落物蓋不影響上述2個指標,且兩種覆蓋處理對上述指標的影響不存在交互效應(表3,圖1)。表明,相比于真菌群落,細菌群落對咖啡廢棄物覆蓋的響應更加敏感,且果皮覆蓋對細菌群落豐富度和多樣性的促進作用更加顯著。

誤差棒表示標準誤(SE)。Error bar represents SE.圖1 不同咖啡廢棄物覆蓋模式下土壤微生物群落豐度、豐富度和多樣性指數Fig.1 Soil microbial community abundance, richness and diversity under different mulching patterns

表3 不同覆蓋模式對土壤微生物群落多樣性與結構的雙因素方差分析結果(F值)Table 3 Results of two-way ANOVA on soil microbial community diversity and structure under different mulching patterns (F value)

2.3 不同咖啡廢棄物覆蓋對土壤微生物群落組成與結構的影響

一般將相對豐度大于1%的菌門視為優(yōu)勢菌門。本研究中變形菌門、放線菌門、酸桿菌門、綠彎菌門、厚壁菌門、芽單胞菌門、粘球菌門、Methylomirabilota、擬桿菌門、藍細菌門和疣微菌門是細菌群落中的優(yōu)勢菌門。不同咖啡廢棄物覆蓋下細菌群落放線菌門、酸桿菌門、綠彎菌門、芽單胞菌門、厚壁菌門、粘球菌門、Methylomirabilota、擬桿菌門和疣微菌門豐度并未存在顯著差異。果皮覆蓋顯著提高變形菌門豐度以及厚壁菌門豐度,卻顯著降低藍細菌門豐度。咖啡枯落物覆蓋顯著提高厚壁菌門豐度,卻顯著降低藍細菌門豐度,并且兩種廢棄物覆蓋僅對放線菌門、厚壁菌門、芽單胞菌門和藍細菌門的影響存在交互作用(圖2)。

圖2 不同咖啡廢棄物覆蓋模式下土壤微生物優(yōu)勢菌門相對豐度Fig.2 Relative abundance of dominant microbe in soil under different mulching patterns

本研究中子囊菌門、擔子菌門、壺菌門、羅茲菌門、毛霉菌門和球囊菌門是真菌群落中的優(yōu)勢菌門。咖啡果皮覆蓋對所有真菌優(yōu)勢菌門均無影響,但咖啡枯落物覆蓋卻顯著提高子囊菌門豐度,并且顯著降低放線菌門豐度。兩種廢棄物覆蓋僅對子囊菌門的影響存在交互作用(圖2)。

2.4 不同咖啡廢棄物覆蓋對土壤微生物群落功能的影響

由表4可知,對細菌功能而言,咖啡枯落物覆蓋顯著促進化學自養(yǎng)氮循環(huán)相關功能細菌多度增加,卻顯著減少光自養(yǎng)細菌相對豐度和有機質降解相關細菌相對豐度。咖啡果皮覆蓋同樣分別顯著提高化能自養(yǎng)和氮循環(huán)細菌的相對豐度,卻顯著減少光自養(yǎng)相關功能細菌的相對豐度。對真菌功能而言,咖啡枯落物覆蓋顯著降低菌根真菌的相對豐度?？Х裙じ采w處理在顯著提高菌根真菌的相對豐度的同時卻顯著降低病原體真菌的相對豐度。

表4 不同咖啡廢棄物覆蓋模式下土壤微生物群落功能Table 4 Soil microbial functions under different mulching patterns

2.5 土壤非生物因子與土壤微生物多樣性和結構的相關性分析

土壤理化性質與微生物豐度、豐富度和多樣性的相關性分析(圖3)表明,細菌豐度與土壤濕度(R=0.54,P<0.05)呈顯著負相關。細菌豐富度(R=0.55,P<0.05)、多樣性(R=0.50,P<0.05)與土壤速效鉀含量呈顯著正相關。真菌群落豐度、豐富度和多樣性對土壤非生物因子變化的響應不敏感。

“*”表示P<0.05, “**”表示P<0.01。‘*’ represents P<0.05, and ‘**’ represents P<0.01.圖3 不同咖啡廢棄物覆蓋下咖啡微生物群落指標與環(huán)境因子相關性分析Fig.3 Correlation analysis of soil microbial community index and environmental factor under different mulching patterns

采用典型相關分析(CCA)進一步分析各土壤非生物因子與微生物群落結構之間的關系。影響細菌群落優(yōu)勢菌門最大的土壤理化指標為SAK(F=3.20,P=0.03)和SOM(F=3.00,P=0.03,圖4-a)。所有的環(huán)境變量共同解釋了樣本間細菌群落變異的53.41%,影響順序為 SAK>SOM>SM>pH>SAN>SAP>ST。CCA的前2個排序軸分別解釋總方差的44.73%和8.68%。影響真菌群落優(yōu)勢菌門的環(huán)境變量順序為SOM>SM>SAK>SAN>pH>ST>SAP(圖4-b)。所有環(huán)境變量共同解釋樣本間真菌群落變異的36.62%,CCA的前2個排序軸分別解釋總方差的25.08%和11.54%。

圖中a為細菌,b為真菌。“Prote”代表變形桿菌門,“Acti”代表放線菌門,“Acid”代表酸桿菌門,“Chlo”代表綠彎菌門,“Firm”代表厚壁菌門,“Gemm”代表芽單胞菌門,“ Myxo”代表粘球菌門,“Meth”代表Methylomirabilota,“Bact”代表擬桿菌門,“Cyan”代表藍細菌門,“Verr”代表疣微菌門,“Asco”代表子囊菌門,“Basi”代表擔子菌門,“Chyt”代表壺菌門,“Roze”代表羅茲菌門,“Mort”代表毛霉菌門,“Glom”代表球囊菌門。In the figure, a is bacteria, and b is fungi. ‘Prote’ represents Proteobacteria,‘Acti’ represents Actinobacteriota,‘Acid’ represents Acidobacteriota,‘Chlo’ represents Chloroflexi,‘Firm’ represents Firmicutes,‘Gemm’ represents Gemmatimonadota, ‘Myxo’ represents Myxococcota,‘Meth’ represents Methylomirabilota,‘Bact’ represents Bacteroidota,‘Cyan’ represents Cyanobacteria,‘Verr’ represents Verrucomicrobiota,‘Asco’ represents Ascomycota,‘Basi’ represents Basidiomycota,‘Chyt’ represents Chytridiomycota,‘Roze’ represents Rozellomycota,‘Mort’ represents Mortierellomycota and ‘Glom’ represents Glomeromycota.圖4 土壤微生物群落優(yōu)勢菌門與環(huán)境因子的典型分析(CCA)Fig.4 Canonical correlation analysis (CCA) of dominant soil microbial community phyla and environmental factors

3 討 論

3.1 土壤理化性質對不同咖啡廢棄物覆蓋的響應

在不同的農田生態(tài)系統(tǒng)中,覆蓋栽培模式對土壤理化性質的影響存在較大差異。其差異主要與生態(tài)系統(tǒng)微環(huán)境變化和覆蓋物的分解特性密切相關[25]。而在同一農田生態(tài)系統(tǒng)中,不同的覆蓋材料對土壤理化性質的影響主要歸因于分解特性的差異和對土壤微環(huán)境的調控[26]。本研究中,咖啡果皮覆蓋顯著提高土壤速效鉀和堿解氮含量,主要歸因于咖啡果皮中氮和鉀含量較高[1]。而枯落物對土壤理化性質的中性效應可能與咖啡葉片較低的碳氮比有關。前期研究表明,具有較高氮含量的葉片在分解初期具有較快的分解速率[27]。在本試驗采樣期間,咖啡枯落物已進入分解后期,其纖維素和木質素分解較慢,因此對土壤養(yǎng)分含量的影響較小。一般認為農林廢棄物覆蓋能夠通過調控土壤水分和降低土壤溫度進而影響土壤養(yǎng)分含量及理化性質,但在本研究中,土壤溫濕度和pH并非調控不同咖啡廢棄物覆蓋下土壤性質的主要因子。

3.2 不同咖啡廢棄物覆蓋對土壤微生物群落多樣性的影響

土壤微生物群落是農田生態(tài)系統(tǒng)重要的組成部分[28],主要參與土壤中有機質的分解、腐殖質的形成和養(yǎng)分循環(huán)等生態(tài)過程[29]。土壤養(yǎng)分含量在微生物群落結構裝配過程中同樣具有重要作用,是主導微生物群落演替以及維持土壤微生物多樣性的重要因子[30]。一般認為,覆蓋作物能夠通過增加分解底物顯著促進部分功能微生物基因豐度,提高細菌群落多樣性[8, 31]。本試驗中咖啡果皮覆蓋通過加速鉀和氮在土壤中的累積,顯著提高細菌豐度以及多樣性,支持上述論點。盡管土壤溫度、容重、含水量、孔隙度同樣對土壤細菌的多樣性具有較大影響[32],但在本研究中細菌多樣性并不響應于土壤溫濕度以及pH的變化,表明在不同咖啡廢棄物覆蓋下,上述土壤性質及微環(huán)境并非是驅動細菌演替的主要因子。此外,一般認為細菌和真菌群落對土壤性質等環(huán)境因子的響應存在顯著差異[33]。本研究中土壤真菌群落多樣性對咖啡廢棄物覆蓋不敏感,與前期研究結果保持一致。

3.3 不同咖啡廢棄物覆蓋對土壤微生物群落結構與功能的影響

微生物組成與結構變化是廢棄物覆蓋條件下生態(tài)系統(tǒng)特性和環(huán)境因素綜合作用的結果,其中凋落物質量是重要影響因素之一[34]。此外,土壤性質與水熱條件差異也是引起微生物組成與結構的重要影響因素之一[35]。前人研究表明,細菌中最龐大的菌門是變形菌門細菌,具有廣泛的生理代謝功能,能夠適應多種復雜的環(huán)境[36-37]。變形菌門細菌作為嗜養(yǎng)菌,富含碳的環(huán)境中能夠刺激其快速增長[38],因此咖啡果皮覆蓋通過為變形菌提供充足的代謝底物,促進其生長和繁殖。厚壁菌門細菌多為化能異養(yǎng)型細菌,能夠促進土壤有機質分解,其豐度與土壤速效磷、速效鉀和堿解氮呈正相關[23],因此本研究中兩種覆蓋栽培通過增加土壤速效養(yǎng)分含量進而提高了厚壁菌門細菌豐度。藍細菌門細菌是一類通過產氧光合作用獲取能量的細菌,但其中也有部分是異養(yǎng)型細菌咖啡廢棄物的覆蓋通過增加土壤異養(yǎng)代謝底物顯著增強異養(yǎng)型微生物競爭優(yōu)勢,引起藍細菌門的相對比例顯著下降[39]。

本研究中土壤真菌群落除子囊菌門、擔子菌門外對咖啡廢棄物覆蓋的響應不敏感。子囊菌門真菌的主要功能是加速纖維素或木質素的分解[40],因此,在咖啡枯落物分解后期剩余纖維素含量較高的葉柄和枯枝等殘體,能夠引起子囊菌門相對比例的提高。擔子菌門的功能較復雜,其中部分是作物致病菌[41]。因此,咖啡枯落物覆蓋后降低擔子菌門相對豐度可能對維持咖啡能作物健康有潛在的積極作用。

4 結 論

本研究中咖啡果皮與枯落物覆蓋均不影響土壤真菌群落,并且細菌群落豐富度與多樣性對咖啡枯落物覆蓋的響應不敏感?？Х裙じ采w顯著提高土壤速效鉀和堿解氮含量以及促進土壤細菌群落豐富度與多樣性,并提高變形桿菌門和厚壁菌門細菌以及降低藍細菌門細菌相對豐度,但土壤微生物主要功能未發(fā)生較大改變?？Х裙さ酿B(yǎng)分分解與遷移直接驅動土壤微生物群落多樣性的提高以及維持結構與功能的相對穩(wěn)定?？Х裙じ采w栽培有助于咖啡園土壤健康保育以及咖啡種植產業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。