王建東,唐玉林,郭亞男,高海慧,侯鵬霞,于 洋,郭延生

(1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院動物科學(xué)研究所,銀川 750002;2.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院,銀川 750021)

【研究意義】寧夏六盤山一帶的肉牛養(yǎng)殖屬于傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè),但同時存在一家一戶的粗放養(yǎng)殖模式,飼料單一,不添加微量元素和維生素等添加劑,犢牛失明發(fā)病率在5%左右,一般不會引起死亡,如果產(chǎn)犢及時發(fā)現(xiàn),通過即時注射維生素A會減輕發(fā)病率。尚青山[1]對化隆縣新生犢牛發(fā)生維生素缺乏癥的病例研究發(fā)現(xiàn),近年來犢牛先天失明發(fā)病率不斷攀升,且完全治愈率較低,給當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖戶造成了經(jīng)濟(jì)損失。目前研究認(rèn)為犢牛失明的主要原因為機(jī)體維生素A缺乏[2-4],維生素A參與視色素的代謝演變過程,促進(jìn)視紫質(zhì)的再生成,還參與骨骼形成,缺乏會導(dǎo)致夜盲癥乃至目盲癥的發(fā)生,以及因頸椎骨的變形,顱腔擁塞或腦疝,導(dǎo)致神經(jīng)受損性失明[5-6]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】引起犢牛維生素A缺乏癥的原因主要有2種:一是母體妊娠期間進(jìn)食劣質(zhì)飼料,且未進(jìn)行有效的維生素補(bǔ)充;二是妊娠奶牛機(jī)體胃腸、肝臟功能不全,無法對脂溶性維生素進(jìn)行有效吸收,母體缺乏維生素A進(jìn)而導(dǎo)致胎兒先天缺乏[7]。研究發(fā)現(xiàn),給常年飼喂干玉米秸稈,很少吃新鮮植物飼料,日糧幾乎沒有維生素添加劑的妊娠奶牛,連續(xù)飼喂5個多月不添加維生素的低劣青貯,新生犢牛出現(xiàn)了維生素A缺乏癥[8]。也有人認(rèn)為犢牛失明還與基因突變有關(guān)。Fujimura等[9]對26例先天性失明犢牛觀察研究發(fā)現(xiàn),失明犢牛出生一段時間后,視神經(jīng)可能會萎縮,其認(rèn)為這是由一種隱性基因引起的遺傳性疾病。另外,李啟飛等[10]采用氫核磁共振代謝組學(xué)方法,對1歲以下維生素A缺乏患兒與健康兒童的尿液進(jìn)行代謝產(chǎn)物分析,發(fā)現(xiàn)差異代謝產(chǎn)物與腸道微生態(tài)平衡、消化系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、免疫相關(guān)疾病及能量代謝、生長發(fā)育密切相關(guān),說明代謝組學(xué)分析在維生素A缺乏早期篩查中具有潛在應(yīng)用價值。【本研究切入點】目前,犢牛失明沒有完全確定的病因,且研究主要集中在病理學(xué)觀察[11]、原因分析、營養(yǎng)預(yù)防和藥物治療上[12],對其進(jìn)一步的代謝產(chǎn)物和代謝通路的變化研究較少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本文通過對同一飼喂條件下,失明犢牛及其母親、正常犢牛進(jìn)行代謝組學(xué)分析,研究失明犢牛代謝產(chǎn)物和代謝通路與其母親及正常犢牛之間的異同,為進(jìn)一步探究犢牛失明原因,降低犢牛先天失明的發(fā)生率,減少養(yǎng)殖行業(yè)經(jīng)濟(jì)損失提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試驗設(shè)計

在寧夏地區(qū)某牛場,隨機(jī)選擇同圈舍出生日期接近(7±2日齡)、視力正常、初生重≥40 kg正常犢牛3頭,初生重≥40 kg、無意識撞物、眼前晃手不會眨眼、眼球較為突出、瞳孔散大呈藍(lán)色的失明犢牛(7±2日齡)及其母親(2胎以上)3對,試驗分為3組:失明犢牛組(VaS)、失明犢牛母親組(VsL)、正常犢牛組(CS),采用圍欄飼養(yǎng)方式犢牛跟隨母親母乳喂養(yǎng),產(chǎn)后母牛采用表1的飼料配方進(jìn)行飼喂,自由飲水。

表1 產(chǎn)后母牛飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Diet composition and nutritional level of postpartum cows (DM basis) (%)

1.2 樣品采集

在晨飼3 h后用負(fù)壓肝素鈉管于犢牛頸靜脈采血,失明犢牛母親采用尾根靜脈采血。血樣于3000 r/min離心15 min。分裝血漿于離心管中,液氮速凍5 min,-80 ℃保存。

1.3 代謝組學(xué)測定

1.3.1 樣品前處理 將100 μL樣品與400 μL冷甲醇乙腈(v/v,1∶1)渦流徹底混合,混合物在冰浴中超聲處理1 h后,在-20 ℃下孵育1 h,最后在4 ℃下以14 000 r/min的速度離心20 min,收集上清液并在真空LC-MS分析下干燥。將干燥的提取物溶于50%乙腈中,用一次性0.22 μm乙酸纖維素過濾每個樣品,并轉(zhuǎn)移到2 mL HPLC瓶中,在-80 ℃儲存。

1.3.2 色譜分離 整個分析過程中樣品置于4 ℃自動進(jìn)樣器中,樣品采用SHIMADZU-LC30超高效液相色譜系統(tǒng)(UHPLC),使用ACQUITY UPLC?HSS T3(2.1 mm×100.00 mm, 1.8 μm)(Waters, Milford, MA, USA)色譜柱。其中進(jìn)樣量6 μL,柱溫40 ℃,流速0.3 mL/min;色譜流動相A:0.1%甲酸水溶液,B:乙腈;色譜梯度洗脫程序如下:0～2 min,B為0%;2～6 min,B從0%線性變化至48%;6～10 min,B從48%線性變化至100%;10～12 min,B維持在100%;12.0～12.1 min,B從100%線性變化至0%;12.1～15.0 min,B維持在0%。

1.3.3 質(zhì)譜采集 每例樣品分別采用電噴霧電離(ESI)進(jìn)行正離子(+)和負(fù)離子(-)模式檢測。樣品經(jīng)UPLC分離后用QE Plus質(zhì)譜儀(Thermo Scientific)進(jìn)行質(zhì)譜分析,使用HESI源進(jìn)行離子化,其離子化條件如下:噴霧電壓:3.8 kv(+)和3.2 kv(-);毛細(xì)管溫度:320(±)℃;鞘氣:30(±)arb;輔助氣體:5(±)arb;探頭加熱器溫度:350(±)℃;S-lens RF水平:50%。

質(zhì)譜采集時間:15 min。母離子掃描范圍:70～1050 m/z,一級質(zhì)譜分辨率:70 000(質(zhì)荷比=200),AGC target:3e6,一級 Maximum IT:100 ms。二級質(zhì)譜分析按照下列方法采集:每次全掃描(full scan)后觸發(fā)采集10個最高強(qiáng)度母離子的二級質(zhì)譜圖譜(MS2 scan),二級質(zhì)譜分辨率:17 500(質(zhì)荷比=200),AGC target: 1e5,二級 Maximum IT:50 ms,MS2 Activation Type: HCD,Isolation window:2 m/z,Normalized collision energy(Setpped):20,30,40。

1.4 數(shù)據(jù)預(yù)處理

原始數(shù)據(jù)采用MSDIAL軟件進(jìn)行峰對齊、保留時間校正和提取峰面積。代謝物結(jié)構(gòu)鑒定采用精確質(zhì)量數(shù)匹配(質(zhì)量偏差Mass tolerance<20 g/kg)和二級譜圖匹配(質(zhì)量偏差Mass tolerance<0.02 Da)的方式,檢索HMDB、MassBank等公共數(shù)據(jù)庫及拜譜本地自建的代謝物標(biāo)準(zhǔn)品庫。

對提取得到的數(shù)據(jù)刪除組內(nèi)缺失值>50%的離子峰不參與后續(xù)統(tǒng)計分析;對正負(fù)離子數(shù)據(jù)分別進(jìn)行總峰面積歸一化,整合正負(fù)離子峰并應(yīng)用R軟件進(jìn)行模式識別,數(shù)據(jù)經(jīng)Unit variance scaling(UV)預(yù)處理后,進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本質(zhì)控分析

采用正離子模式(ESI+)和負(fù)離子模式(ESI-) ESI檢測,每5個樣品檢測一個質(zhì)量控制(QC)樣品,以驗證系統(tǒng)的可靠性。將質(zhì)控樣品的全離子色譜(TIC)光譜疊加比較,結(jié)果表明,質(zhì)譜儀的響應(yīng)強(qiáng)度和保留時間重疊(圖1),表明該方法具有較好的穩(wěn)定性和較低的由儀器誤差引起的變化。峰間分離良好,說明色譜和質(zhì)譜條件適合本研究樣品的測定。

圖1 正負(fù)離子模式下全離子色譜(TIC)光譜Fig.1 Total ion chromatography (TIC) spectrum in positive and negative ion mode

2.2 OPLS-DA分析

正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)運用偏最小二乘回歸建立代謝物表達(dá)量與樣品類別之間的關(guān)系模型,來實現(xiàn)對樣品類別的預(yù)測[13]。由OPLS-DA得分圖(圖2)和模型驗證得分(表2)可知,OPLS-DA模型參數(shù)R2Y>0.9、Q2>0.5,說明OPLS-DA模型沒有發(fā)生過擬合,模型穩(wěn)定可靠。

A:VaL.vs.VaS為正負(fù)離子模式OPLS-DA得分圖;B:VaS.vs.CS為正負(fù)離子模式OPLS-DA得分圖。A: VaL.vs.VaS is positive and negative ion mode OPLS-DA score graph; B: VaS.vs.CS is positive and negative ion mode OPLS-DA score graph.圖2 OPLS-DA得分圖Fig.2 OPLS-DA score chart

表2 比對組的OPLS-DA模型評價參數(shù)Table 2 Evaluation parameters of the OPLS-DA model for the comparison group

2.3 差異代謝物篩選

2.3.1 單變量統(tǒng)計分析 本研究共注釋到667種代謝產(chǎn)物,其中正離子模式下399種,負(fù)離子模式下268種。將OPLS-DA的VIP值>1和單變量統(tǒng)計分析P<0.05作為顯著性差異代謝物的標(biāo)準(zhǔn),VaL.vs.VaS比較組共篩選出256種差異代謝物,其中正離子模式下144種,負(fù)離子模式下112種(圖3-A)。VaS.vs.CS比較組共篩選出177種差異代謝物,其中正離子模式下108種,負(fù)離子模式下69種(圖3-B)。

A:VaL.vs.VaS為正負(fù)離子模式火山圖;B:VaS.vs.CS為正負(fù)離子模式火山圖。A: VaL.vs.VaS is positive and negative ion mode volcano map; B: VaS.vs.CS is positive and negative ion mode volcano map.圖3 正負(fù)離子模式火山圖Fig.3 Positive and negative ion mode volcano map

2.3.2 失明犢牛與其母親之間差異代謝物篩選 為進(jìn)一步直觀展示樣本之間的關(guān)系和不同樣本之間代謝物的表達(dá)差異,本研究對所有代謝物表達(dá)量呈顯著差異的進(jìn)行層次聚類(Hierarchical clustering),根據(jù)VIP值對top50差異代謝物表達(dá)量進(jìn)行可視化分析。由圖4可知,其中VaS.vs.VaL比較組上調(diào)的代謝物有14個,包括2-氮己環(huán)酮(2-Piperidone)、D-肉堿(D-Carnitine)、環(huán)(脯氨酸-亮氨酸)二肽[Cyclo(Leu-Pro)]、鼠李糖(Rhamnose)、脯氨酸-羥脯氨酸(Proline-Hydroxyproline)、黃單酸(Xanthomonic acid)等。表達(dá)量下調(diào)的代謝物有36個,包括4-羥基喹啉(4-hydroxyquinoline)、鞣花酸(Ellagic acid)、氫化可的松(Hydrocortisone)、甘膽酸(Glycohyocholic acid)、視紫紅質(zhì)(Rhodopin)、甘氨膽酸(Glycocholic acid)、二十烷酸(Icosanoic acid)、油酸甘油酯(Monoolein)等。

橫坐標(biāo)表示樣本名稱及分組,縱坐標(biāo)表示差異代謝物。右側(cè)的樹狀結(jié)構(gòu)表示差異代謝物之間的相似度聚類關(guān)系,分枝越短關(guān)系越大,后面矩形依次為相對表達(dá)量、FC、P-value和VIP,顏色從綠、藍(lán)到紅表示代謝物的表達(dá)豐度從低到高,差異倍數(shù)由低到高,**代表P-value<0.005,***代表P-value<0.001。下同。The horizontal coordinates indicate the sample names and groupings, and the vertical coordinates indicate the differential metabolites. The tree structure on the right side indicates the similarity clustering relationship between the differential metabolites, the shorter the branches the greater the relationship, followed by rectangles in order of relative expression, FC, P-value and VIP, the color from green, blue to red indicates the expression abundance of metabolites from low to high, the difference ploidy from low to high,** indicates P-value<0.005, and *** indicates P-value<0.001.The same as below.圖4 失明犢牛與其母親之間差異代謝物聚類Fig.4 Differential metabolite clustering between blind calves and their mothers

2.3.3 失明犢牛與正常犢牛之間差異代謝物篩選 由圖5可知,VaS.vs.CS比較組上調(diào)的代謝物有32個,包括4-吡哆醇酸(4-Pyridoxic acid)、3-(4-羥基苯基)乳酸[3-(4-Hydroxyphenyl)lactate]、鵝去氧膽酸(Chenodeoxycholic acid)、木質(zhì)纖維素酸(Lignoceric acid)、脫氧膽酸(Deoxycholic acid)、LTC4、亮肽酶素(Leupeptin)、脯氨酸-羥脯氨酸(Proline-Hydroxyproline)、腎磷脂酸(Nephromopsic acid)等。表達(dá)量下調(diào)的代謝物有18個,包括L-谷氨酸(L-Glutamic acid)、亞油酸(Linoleic acid)、N-(2-呋喃基)甘氨酸[N-(2-Furoyl)Glycine]、棕櫚酰乙酰胺(Palmitoyl ethanolamide)、5-羥甲基尿苷(5-Hydroxymethyluridine)、鼠李糖(Rhamnose)、脂肪酸(FA 18:3+1O)、黃嘌呤(Xanthosine)、多酚(APolyphyllin A)等。

圖5 失明犢牛與正常犢牛之間差異代謝物聚類Fig.5 Differential metabolite clustering between blind and normal calves

2.4 差異代謝物功能分析

2.4.1 失明犢牛與其母親之間差異代謝物功能分析 依據(jù)代謝物的結(jié)構(gòu)與功能,對比較組篩選得到的差異代謝物進(jìn)行分類統(tǒng)計(圖6)。VaS組與VaL組相比,差異代謝物注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫物質(zhì)主要種類為類固醇(Steroids,18.84%)、生物堿(Alkaloids,14.49%)、萜類化合物(Terpenoids,11.59%)、多肽類(Peptides,8.70%)和PK聚酮肽(PK Polykeides,8.70%)。由圖7可知,VaS組與VaL組相比,P<0.05差異代謝通路共有30個,矯正后P<0.05的差異代謝通路共有10個,主要包括膽汁分泌(Bile secretion)、初級膽汁酸生物合成(Primary bile acid biosynthesis)、戊糖磷酸途徑(Pentose phosphate pathway)、維生素B6代謝(Vitamin B6 metabolism)、組氨酸代謝(Histidine metabolism)、氨基酸的生物合成(Biosynthesis of amino acids)等(表3),其中膽汁分泌代謝通路分布差異代謝物最多,與其母親相比,失明犢牛有4個代謝物顯著上調(diào),9個代謝產(chǎn)物顯著下調(diào)。

不同顏色表示KEGG一級分類,沒有注釋到分類信息的代謝物未被統(tǒng)計;圖例標(biāo)明分類名稱、差異代謝物數(shù)量以及餅圖中所占百分比。下同。Different colors indicate KEGG level 1 classification, and metabolites without annotated classification information are not counted; Legend indicates the classification name, number of differential metabolites, and percentage of the pie chart. The same as below.圖6 失明犢牛與其母親之間差異代謝物分類Fig.6 Classification of differential metabolites between blinded calves and their mothers

將pathway 歸屬到level 1分類,每類中的pathway從上至下-log10(P-value)依次降低,即P-value依次升高,顯著性依次降低。圓圈大小表示count, 即注釋到該通路中的差異代謝物數(shù)量;圓圈顏色對應(yīng)校正后的P-value,由紅到藍(lán)越顯著。下同。The pathway is assigned to level 1 classification, and the pathway in each category is decreased from top to bottom-log10 (P-value), i.e., P-value increases and significance decreases in order. The circle size indicates count, i.e. the number of differential metabolites annotated to the pathway; The circle color corresponds to the corrected P-value, from red to blue the more significant. The same as below.圖7 失明犢牛與其母親之間差異代謝物顯著通路Fig.7 Significant pathways of differential metabolites between blinded calves and their mothers

表3 失明犢牛與其母親之間差異代謝物分析Table 3 Differential metabolite analysis between blind calves and their mothers

2.4.2 失明犢牛與正常犢牛之間差異代謝物功能分析 依據(jù)代謝物的結(jié)構(gòu)與功能,對比較組篩選得到的差異代謝物進(jìn)行分類統(tǒng)計(圖8)。VaS組與CS組相比,差異代謝物注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫物質(zhì)主要種類為生物堿(Alkaloids,14.89%)、脂類(Lipids,14.89%)、萜類化合物(Terpenoids,14.89%)、類固醇(Steroids,10.64%)、多肽類(Peptides,10.64%)。由圖9可知,VaS組與CS組相比,P<0.05差異代謝通路共有12個,矯正后P<0.05的差異代謝通路共有16個,主要包括膽汁分泌(Bile secretion)、ABC運輸工具(ABC transporters)、精氨酸生物合成(Arginine biosynthesis)、谷胱甘肽代謝(Glutathione metabolism)、氨基酸的生物合成(Biosynthesis of amino acids)等(表4),其中膽汁分泌代謝通路分布差異代謝物最多,與正常犢牛相比,失明犢牛有5個代謝物顯著上調(diào),4個代謝產(chǎn)物顯著下調(diào)。

圖8 失明犢牛與正常犢牛之間差異代謝物分類Fig.8 Classification of differential metabolites between blinded and normal calves

圖9 失明犢牛與正常犢牛之間差異代謝物顯著通路Fig.9 Significant pathways of differential metabolites between blind and normal calves

表4 失明犢牛與正常犢牛之間差異代謝物分析Table 4 Analysis of differential metabolites between blind and normal calves

3 討 論

研究報道,視紫紅質(zhì)基因突變是導(dǎo)致視網(wǎng)膜色素變性最常見的原因,占常染色體顯性遺傳視網(wǎng)膜色素變性的25%～30%[14-15],已發(fā)現(xiàn)的視紫紅質(zhì)基因突變多達(dá)150余種。視紫紅質(zhì)(RHO)基因編碼視紫紅質(zhì)蛋白,RHO蛋白含348個氨基酸,其C端第310～349位氨基酸可與11-順-視黃醛形成功能性發(fā)色,當(dāng)光子照射到RHO蛋白時,11-順-視黃醛異構(gòu)化,在視桿細(xì)胞中啟動光轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng),在將光能轉(zhuǎn)換為電能的過程中起到關(guān)鍵性作用[16-17]。RHO基因是導(dǎo)致視網(wǎng)膜色素變性的突變基因之一。視紫紅質(zhì)基因突變可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、蛋白聚集、膜受體異常激活,從而導(dǎo)致視網(wǎng)膜色素變性。具體病理過程是視桿細(xì)胞先進(jìn)行性變性,視錐細(xì)胞進(jìn)而受累,最終導(dǎo)致視桿和視錐細(xì)胞及色素上皮喪失功能[18-19]?；疾《喟l(fā)生于兒童、青少年,表現(xiàn)主要為進(jìn)行性視野缺損視力下降、視網(wǎng)膜骨細(xì)胞樣色素沉著和夜盲。徐四川等[20]報道稱視紫紅質(zhì)蛋白是一個跨膜蛋白,視黃醛(RET)在該蛋白中的活性結(jié)合位點涉及到視覺過程機(jī)理,且與牛的一些眼科疾病有關(guān)。綜上可知,機(jī)體在早期生長階段存在著因視紫紅質(zhì)基因突變導(dǎo)致視網(wǎng)膜色素變性,進(jìn)而引發(fā)視力受損的可能。在本研究中,失明犢牛代謝產(chǎn)物中的視紫紅質(zhì)相對含量極顯著低于其母親,且維生素A的相對含量在兩者之間未呈顯著差異。表明犢牛失明可能與機(jī)體視紫紅質(zhì)異常有關(guān),導(dǎo)致光轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)無法正常啟動,進(jìn)而影響正常視物。因為維生素A與視黃醛之間的轉(zhuǎn)化存在可逆反應(yīng),但二者相對含量在失明犢牛與其母親體內(nèi)不存在顯著性差異,進(jìn)一步推測視紫紅質(zhì)的缺乏可能與基因突變存在一定關(guān)系,但具體的原因和機(jī)理有待進(jìn)一步驗證。

動物中的視黃醇酯和植物中的維生素A經(jīng)胃蛋白酶的作用從食物中釋出,在胃內(nèi)幾乎不被吸收,在小腸中經(jīng)膽汁和胰脂酶的作用消化分解,由腸粘膜吸收。賀秀媛等[21]對維生素A缺乏癥的犢牛器官進(jìn)行鏡檢,發(fā)現(xiàn)維生素A缺乏會對肉犢牛的上述器官的組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不同程度的影響。同樣,膽汁淤積性肝病為兒童常見肝臟疾病,膽汁調(diào)節(jié)腸道對脂肪和脂溶性維生素的吸收,因而在發(fā)生膽汁淤積時,常存在脂肪和FSVs(維生素A、D、E和K)的吸收缺陷[22]。對新生患有膽汁淤積性肝病的嬰兒人為補(bǔ)充生理所需要的維生素A、D時并不能滿足其對脂溶性維生素的需求,且不同的喂養(yǎng)方式對脂溶性維生素的吸收并無影響[23-24]。當(dāng)肝臟和腸道有慢性疾病、飼料中缺乏維生素A或其前體胡蘿卜素時也能發(fā)生維生素A缺乏癥[5]。本研究發(fā)現(xiàn),各比較組維生素A水平不存在顯著性差異的條件下,失明犢牛和其母親、正常犢牛相比,膽汁分泌代謝通路均呈顯著性差異,其也是包含差異代謝物最多的代謝通路。另外,失明犢牛和其母親相比,膽汁分泌初級膽汁酸生物合成代謝通路也存在顯著性差異。由此認(rèn)為,犢牛失明可能是機(jī)體自身存在著肝臟方面的疾病,影響膽汁的正常分泌,導(dǎo)致正常攝入的脂溶性維生素A不能被吸收利用,進(jìn)而影響犢牛視力。

4 結(jié) 論

在機(jī)體維生素A相對含量沒有顯著性差異的條件下,失明犢牛和其母親、正常犢牛相比,膽汁分泌代謝通路均呈顯著性差異,其也是包含差異代謝物最多的代謝通路。另外,失明犢牛和其母親相比,膽汁分泌初級膽汁酸生物合成代謝通路也呈顯著性差異。表明犢牛失明可能與膽汁無法正常分泌,導(dǎo)致正常攝入的脂溶性維生素A不能被吸收利用有關(guān)。另外,失明犢牛代謝產(chǎn)物中的視紫紅質(zhì)相對含量極顯著低于其母親,且維生素A的相對含量在兩者之間未呈顯著性差異,表明犢牛視紫紅質(zhì)蛋白缺乏,可能是導(dǎo)致其失明的另一原因。