鄒 轉(zhuǎn),田紅彥,袁翔宇,賀陸洋,徐紹忠,趙昶靈,陳天鳳,殷舉嬌

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院,昆明 650201)

【研究意義】滇丹參(SalviayunnanensisC. H.Wright)又名云南鼠尾草,為多年生草本植物[1]。與中藥丹參同屬且藥理活性相似[2],因此往往作為丹參的代替品使用[3]。丹參(SalviamiltiorrhizaBunge)始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,因其療效顯著被列為上品[4],也是歷版《中國(guó)藥典》收載中藥丹參的唯一基源植物[5]。近年來(lái),雖然丹參種植面積擴(kuò)大,但是丹參種質(zhì)混雜、退化問(wèn)題增多。長(zhǎng)期在種植上形成只種不選和栽培管理方式不合理也使人工栽培丹參的產(chǎn)量和質(zhì)量嚴(yán)重下降?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】舒志明等[6-7]選擇3個(gè)不育類型的丹參作母本、陜西丹參作父本進(jìn)行雜交育種。劉竟飛等[8]采用單交育種法對(duì)2個(gè)不同的丹參品種進(jìn)行正反雜交,發(fā)現(xiàn)植物花粉粒發(fā)育過(guò)程中往往會(huì)積累營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累為植物花粉粒的生長(zhǎng)發(fā)育提供能量。朱廣廉等[9]研究表明花粉敗育與花粉和花藥中游離脯氨酸含量的變化密切相關(guān)。張麗等[10]研究表明淀粉含量、可溶性糖及游離脯氨酸在不育系蘿卜花藥中顯著低于保持系。因此,推測(cè)植物雄性不育的主要是由花藥發(fā)育過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏引起的。能量代謝對(duì)植物生命個(gè)體而言具有十分重要的作用,植物的正常生長(zhǎng)與發(fā)育以植物能進(jìn)行正常的能量代謝為前提?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】以丹參和滇丹參及其正交后代為材料,觀察花的形態(tài)以及測(cè)定不同大小花蕾的生理生化指標(biāo)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】探索丹參和滇丹參正交后代雜種不育的原因,為丹參新種質(zhì)的開發(fā)利用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選取2019年云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院中藥材研究所篩選的滇丹參(云南蒙自)為父本、引自河南的丹參為母本進(jìn)行雜交獲得正交后代F1。以親本及其正交后代為試驗(yàn)材料,2020年6月至2021年11月種于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)。所用親本丹參和滇丹參經(jīng)云南農(nóng)業(yè)大學(xué)郭鳳根教授鑒定。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花粉活力測(cè)定 2021年4月、7月、10月采集丹參、滇丹參及其正交后代的花粉粒,用解剖針將花粉挑出,放置于載玻片上的清水中,攪動(dòng)水滴,使花粉分散,分別利用TTC與I2-KI對(duì)花粉進(jìn)行染色,待染色完成后利用蔡司顯微鏡觀察花粉粒顏色,找到花粉粒相對(duì)分散的視野在同一面積視野內(nèi)對(duì)染色花粉粒數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。3種材料每個(gè)月各進(jìn)行1次花粉活力測(cè)定,共進(jìn)行3次花粉活力測(cè)定,取平均值?；ǚ刍盍?%)=視野內(nèi)被染色花粉數(shù)/視野內(nèi)所有花粉數(shù)×100。

1.2.2 花的形態(tài)觀察 于花期對(duì)2個(gè)親本及其正交后代植株進(jìn)行定點(diǎn)取樣,每株30朵小花,分別來(lái)自主花序上、中、下3個(gè)部位,每個(gè)部位各10朵。花瓣上下唇瓣的長(zhǎng)寬及花絲、花藥長(zhǎng)度利用游標(biāo)卡尺進(jìn)行測(cè)量,用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、SPSS進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,比較正交后代與2個(gè)親本的差異。

1.2.3 生理生化指標(biāo)測(cè)定 選擇不同時(shí)期的花蕾(現(xiàn)蕾期到盛花期)用數(shù)碼游標(biāo)卡尺準(zhǔn)確測(cè)量花蕾大小后依據(jù)花蕾長(zhǎng)度將其分為5個(gè)發(fā)育階段(造胞細(xì)胞時(shí)期:花蕾長(zhǎng)度<1.5 mm;花粉母細(xì)胞時(shí)期:花蕾長(zhǎng)度1.5～3.5 mm;四分體時(shí)期:花蕾長(zhǎng)度3.5～5.5 mm;單核期:花蕾長(zhǎng)度5.5～7.5 mm;成熟期:花蕾長(zhǎng)度7.5～9.5 mm),將樣品放入冰盒內(nèi)帶回試驗(yàn)室后剝?nèi)セㄝ?稱取每個(gè)發(fā)育階段的樣品1.5 g,3次重復(fù)。利用液氮速凍后研磨,立即測(cè)定SOD、POD、CAT活性;再稱取6 g樣品液氮速凍,研磨置于-80 ℃冰箱凍存用于可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸和丙二醛(MDA)含量的測(cè)定。測(cè)定結(jié)果取3次重復(fù)的平均值。G-250考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定可溶性蛋白含量;可溶性糖測(cè)定采用蒽酮比色法;游離脯氨酸測(cè)定采用酸性茚三酮法;MDA含量測(cè)定采用TBA法;SOD活性測(cè)定采用NBT法;POD活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法;CAT活性測(cè)定采用高錳酸鉀滴定法,以上試驗(yàn)均參照李合生[11]的方法進(jìn)行。采用 Excel 2010記錄并整理數(shù)據(jù)、采用SPSS做顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉活力測(cè)定

如圖1所示,對(duì)丹參、滇丹參及其正交后代花粉粒分別進(jìn)行TTC、I2-KI染色,滇丹參和丹參的花粉粒被TTC染液染成紅色,被I2-KI染成藍(lán)黑色,說(shuō)明滇丹參與丹參的花粉粒具有活力;而正交后代的花粉粒經(jīng)TTC染色,花粉粒未呈現(xiàn)紅色;I2-KI染色后正交后代花粉粒也未呈現(xiàn)出藍(lán)黑色,說(shuō)明正交后代花粉粒無(wú)活力。2021年4月、7月、10月對(duì)丹參、滇丹參及正交后代花粉進(jìn)行TTC染色,在3次花粉活力的測(cè)定結(jié)果中,滇丹參的花粉活力最低為86%,最高達(dá)99.47%,3次平均花粉活力為94.63%;丹參花粉活力最低為86.1%,最高達(dá)98.93%,3次平均花粉活力為91.61%;而正交后代最高的花粉活力僅2%,3次平均花粉活力為1.76%,即平均花粉敗育率為98.24%。在3次花粉活力檢測(cè)的I2-KI染色中,滇丹參的花粉活力最低為71.43%,最高為100%。3次平均花粉活力為86.7%;丹參的花粉活力最低為91.23%,最高達(dá)100%,3次平均花粉活力為95.16%,而正交后代中花粉活力最高僅3.67%,3次平均花粉活力為2.56%,即平均花粉敗育率為97.44%。故判斷正交后代為雄性不育株系。

A、B、C依次為丹參、滇丹參、正交后代TTC染色結(jié)果;D、E、F依次為丹參、滇丹參、正交后代I2-KI染色結(jié)果。A, B and C are the TTC staining results of S.miltiorrhiza,S.yunnanensis and their F1 generations; D, E and F are the I2-KI staining results of S.miltiorrhiza, S.yunnanensis and their F1 generations.圖1 丹參、滇丹參及其正交后代花粉活力測(cè)定Fig.1 Determination of pollen vitality of S.miltiorrhiza, S.yunnanensis and their F1 generations

2.2 花的形態(tài)觀察

2個(gè)親本的花絲長(zhǎng)度存在顯著差異,正交后代的花絲長(zhǎng)度介于親本之間,但與2個(gè)親本均無(wú)顯著差異;3種材料的花藥長(zhǎng)度間均存在顯著差異。正交后代花瓣的上下唇長(zhǎng)、寬均介于2個(gè)親本之間;丹參花瓣的上唇長(zhǎng)、寬均小于正交后代和滇丹參,但正交后代和滇丹參間無(wú)顯著差異;丹參花瓣的下唇長(zhǎng)、寬均大于正交后代及滇丹參,但正交后代和滇丹參間無(wú)顯著差異,正交后代花瓣的下唇長(zhǎng)、寬均介于2個(gè)親本之間(表1)。

表1 丹參與滇丹參及其正交后代花的形態(tài)特征Table 1 Morphological characteristics of the flowers of S.miltiorrhiza, S.yunnanensis and their F1 generations

2.3 生理生化指標(biāo)比較與分析

圖2-A顯示,在整個(gè)花蕾發(fā)育過(guò)程中,正交后代與滇丹參、丹參的MDA含量均呈上升趨勢(shì),尤其是正交后代MDA含量在四分體到成熟期呈明顯上升趨勢(shì)。在整個(gè)發(fā)育過(guò)程中,正交后代MDA含量均高于2個(gè)親本,到成熟期時(shí),正交后代的MDA含量是親本的1.6倍以上。

不同小寫字母表示不同材料在同一發(fā)育階段差異顯著(P < 0.05),1、2、3、4、5表示花蕾發(fā)育的5個(gè)階段,分別表示花蕾造胞細(xì)胞時(shí)期、花粉母細(xì)胞時(shí)期、四分體時(shí)期、單核期、成熟期。Different lowercase letters indicate significant differences in different materials at the same developmental stage(P < 0.05), 1, 2, 3, 4 and 5 represent the five stages of flower bud development, which respectively represent the bud cell forming stage, pollen mother cell stage, tetrad stage, monocyte stage and mature stage.圖2 不同發(fā)育時(shí)期試驗(yàn)材料生理生化指標(biāo)變化Fig.2 Changes in physiological and biochemical indicators of three materials at different development stages

圖2-B顯示,在前4個(gè)時(shí)期,丹參與滇丹參及其正交后代在花蕾發(fā)育過(guò)程中可溶性蛋白的變化趨勢(shì)大致相同,均呈上升趨勢(shì)。但從單核期到成熟期,正交后代中可溶性蛋白含量急劇下降,滇丹參與丹參的可溶性蛋白含量卻依然呈上升趨勢(shì)。正交后代可溶性蛋白含量在前4個(gè)時(shí)期均高于2個(gè)親本;成熟期時(shí),正交后代的可溶性蛋白含量顯著低于親本,此時(shí)2個(gè)親本可溶性蛋白含量是正交后代的1.7倍以上。

圖2-C顯示,隨著花蕾發(fā)育,3種材料中可溶性糖含量均呈升高趨勢(shì)。但在整個(gè)發(fā)育過(guò)程中,正交后代中可溶性糖含量?jī)H略微升高;從花粉母細(xì)胞時(shí)期到成熟期,滇丹參、丹參可溶性糖含量是正交后代的2倍以上。

圖2-D顯示,正交后代中游離脯氨酸呈先上升后下降的趨勢(shì),在四分體時(shí)期顯著下降;親本在整個(gè)發(fā)育過(guò)程中均呈上升趨勢(shì)。從四分體時(shí)期開始,滇丹參和丹參的游離脯氨酸含量分別是正交后代的2倍以上。

圖2-E顯示,親本花蕾的SOD活性從造胞細(xì)胞到單核期呈升高趨勢(shì),在成熟期略微下降;正交后代中的SOD活性呈先升高后下降再升高的趨勢(shì),四分體時(shí)期下降到最低;在整個(gè)花蕾發(fā)育過(guò)程中,2個(gè)親本的SOD活性均高于其正交后代,尤其是從四分體時(shí)期到成熟期,2個(gè)親本的SOD活性均是其正交后代的2倍以上。

圖2-F顯示,正交后代中POD活性從造胞細(xì)胞到單核期呈上升趨勢(shì)但在成熟期下降;滇丹參和丹參的POD活性從造胞時(shí)期到四分體時(shí)期呈上升趨勢(shì),在四分體時(shí)期到成熟期POD活性呈下降趨勢(shì)。在花蕾的整個(gè)發(fā)育過(guò)程中,正交后代的POD活性都較親本高,單核期和成熟期的POD活性均是親本的4倍以上。

圖2-G顯示,滇丹參與丹參及其正交后代在整個(gè)花蕾發(fā)育過(guò)程中CAT活性均呈先升高后降低的趨勢(shì),3種材料在四分體時(shí)期CAT活性開始降低。正交后代的CAT活性從四分體時(shí)期到單核期急劇下降,此時(shí)2個(gè)親本CAT活性是其3.9倍,從單核期到成熟期,正交后代的CAT活性無(wú)明顯變化,此時(shí)滇丹參和丹參CAT活性是其3倍以上。

3 討 論

3.1 花粉活力及育性

花粉是高等植物的雄性配子體,其活力是影響植物有性雜交成功與否的重要因素[12]。對(duì)植物花粉活力測(cè)定可為人工雜交育種提供重要的數(shù)據(jù)支撐。劉文婷等[13]研究結(jié)果表明,丹參花期花粉活力平均可達(dá)80.0%以上。宋振巧等[14]研究表明,丹參花前 48 h近73.15%花粉具有活力,開花前24 h達(dá)到最高活力時(shí)期,大多數(shù)植株在這個(gè)時(shí)期花藥開裂散粉。潘瓊等[15]研究結(jié)果表明,紫丹參在開花前花粉活力為55.92%,花剛開放時(shí)花粉活力為46.08%,此時(shí)為紫丹參整個(gè)花期花粉活力最低值時(shí)期;花開放后花粉活力逐漸增強(qiáng),至大部分花藥散粉時(shí)花粉活力達(dá)整個(gè)花期最強(qiáng),為90.86%;之后花粉活力逐漸減弱,但直至花冠脫落時(shí)仍有一定活力,花粉活力值為46.19%。賀和初等[16]對(duì)水稻花粉敗育率為95.1%～100%的植株劃分為不育株,孫寰等[17]對(duì)大豆不育株的花粉標(biāo)準(zhǔn)與賀和初一致。

本研究中對(duì)丹參與滇丹參正交后代花粉活力鑒定時(shí)所用的2種染色方法得出花粉敗育率均達(dá)到95.1%以上,因而認(rèn)定其為雄性不育類型。

3.2 花的形態(tài)特征

花絲是雄蕊的一部分,在花絲長(zhǎng)度方面,正交后代花絲長(zhǎng)度介于2個(gè)親本之間,沒(méi)有顯著差異;花藥是花絲頂端部分也是雄蕊的重要組成部分,舒志明等[18]研究發(fā)現(xiàn)的丹參雄性不育均是花藥退化嚴(yán)重、花朵小、花絲變短的類型,而本研究中發(fā)現(xiàn)的雄性不育株與親本在花藥、花絲、花的大小上均無(wú)異常變化。

3.3 雜種不育與生理生化的關(guān)系

丙二醛作為交聯(lián)劑,使膜蛋白、酶及DNA等大分子發(fā)生交聯(lián)反應(yīng),MDA含量過(guò)多時(shí)將導(dǎo)致代謝紊亂[19]。本研究結(jié)果表明,從造胞細(xì)胞時(shí)期到花粉成熟期,正交后代花朵中MDA含量均高于親本且隨著花蕾發(fā)育,MDA含量上升趨勢(shì)明顯,尤其是在花蕾成熟期,MDA含量接近親本的1倍。正交后代中MDA含量的增加可能與花粉粒的敗育有關(guān)。

蛋白質(zhì)是植物花蕾正常發(fā)育過(guò)程中的重要成分[20]。Mascarenhas[21]認(rèn)為,植物雄性不育系花中可溶性蛋白缺乏是影響其雄性不育的重要原因之一。本研究發(fā)現(xiàn),丹參和滇丹參及其正交后代在花蕾的整個(gè)發(fā)育過(guò)程中,前4個(gè)時(shí)期,可溶性蛋白含量均增加,但成熟期正交后代中的可溶性蛋白急劇降低,而親本花朵中可溶性蛋白含量依然增加。從而推測(cè),控制蛋白合成的基因在花藥發(fā)育過(guò)程中可以正常表達(dá),但到花粉成熟期由于某些基因的特異性表達(dá)抑制了控制蛋白質(zhì)合成基因的正常表達(dá),從而導(dǎo)致成熟期可溶性蛋白含量下降,因此可溶性蛋白含量下降也可能是雄性不育的原因之一。

花藥的養(yǎng)分輸入主要是糖類,其在花藥中的含量也是影響小孢子發(fā)育的一個(gè)關(guān)鍵因素。糖類物質(zhì)不足可以導(dǎo)致辣椒[22]、棉花[23]和蘿卜[24]等植物的花粉敗育。本研究結(jié)果表明,在花蕾發(fā)育的整個(gè)時(shí)期,丹參與滇丹參可溶性糖含量均呈增加趨勢(shì),正交后代的可溶性糖含量在整個(gè)發(fā)育時(shí)期的變化緩慢且均顯著低于滇丹參和丹參,從而推測(cè)可溶性糖的缺乏可能是導(dǎo)致其不育的原因之一。

脯氨酸在花粉發(fā)育的整個(gè)時(shí)期都具有重要的生理功能。豐富的脯氨酸是花粉正常發(fā)育的必要條件[25]。同時(shí),脯氨酸為花粉萌發(fā)提供能量和氮源,是合成蛋白質(zhì)、酶等大分子物質(zhì)的原料[26]。脯氨酸含量低,花藥的抗逆性降低。本研究結(jié)果表明,在花粉母細(xì)胞以前,丹參與滇丹參及其正交后代的脯氨酸含量基本一致,隨著花藥發(fā)育,丹參與滇丹參脯氨酸含量持續(xù)上升,但正交后代在四分體時(shí)期脯氨酸含量顯著下降,一直保持到花粉成熟期,由此推測(cè)游離脯氨酸缺乏也可能是造成花粉敗育的原因之一。

SOD能清除植物代謝中產(chǎn)生的活性氧自由基,防止活性氧在體內(nèi)積累過(guò)多導(dǎo)致膜脂受損從而維持膜脂的穩(wěn)定性[27],膜脂的穩(wěn)定性是維持細(xì)胞正常生命活動(dòng)的基本條件[28]。在SOD作用下,活性氧歧化為H2O2和O2,植物通過(guò)此種反應(yīng)清除體內(nèi)的自由基,維持自由基生成和清除系統(tǒng)的平衡。本研究結(jié)果顯示,在丹參、滇丹參以及正交后代花蕾的整個(gè)發(fā)育過(guò)程中,丹參、滇丹參花蕾中SOD活性均明顯高于其正交后代,由此猜測(cè)由于SOD活性低,植物代謝中自由基含量增加,在植物體內(nèi)積累,從而導(dǎo)致脂膜結(jié)構(gòu)受損加劇,影響了正交后代的花粉粒正常發(fā)育。

POD在氧化降解內(nèi)源激素IAA以及體內(nèi)減少有毒H2O2含量等方面較重要[29]。該酶兼具吲哚乙酸氧化酶—過(guò)氧化物酶雙重功能特性,在維持體內(nèi)IAA代謝及庫(kù)源平衡中起重要作用。袁文靜等[30]對(duì)亞麻溫敏性雄性不育系的POD活性同幾種內(nèi)源激素含量的比較分析得出,IAA含量降低在雄性不育植物中具有普遍性,而POD活性偏高導(dǎo)致代謝旺盛,源庫(kù)供應(yīng)出現(xiàn)問(wèn)題,IAA含量減少導(dǎo)致敗育的產(chǎn)生。在玉米、小麥雄性不育研究中都發(fā)現(xiàn)不育系花藥POD活性高于保持系[31-32],本研究結(jié)果表明,在丹參、滇丹參及其正交后代花蕾發(fā)育過(guò)程中POD變化趨勢(shì)均一致。但整個(gè)發(fā)育時(shí)期正交后代中POD活性均高于丹參和滇丹參,特別是在單核期和成熟期,POD活性分別是丹參與滇丹參的3倍左右。這說(shuō)明本研究中由于POD活性過(guò)高,正交后代代謝旺盛、庫(kù)源供應(yīng)出現(xiàn)問(wèn)題導(dǎo)致IAA虧損也會(huì)引起不育。

CAT被認(rèn)為是一種保護(hù)性酶,可幫助SOD清除生物體內(nèi)的活性氧[33]。陳賢豐等[34]發(fā)現(xiàn)小麥雄性不育花藥中的過(guò)氧化氫酶活性明顯低于可育花藥中的CAT活性,因而無(wú)法有效消除超氧離子基團(tuán),導(dǎo)致H2O2等超氧自由基大量積累進(jìn)而導(dǎo)致花藥壁絨氈層細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化增加而發(fā)生敗育。本研究結(jié)果表明,在花粉母細(xì)胞時(shí)期以前,丹參與滇丹參及其正交后代CAT活性差異不大;而到四分體時(shí)期正交后代的CAT活性開始降低,到單核期時(shí),僅占親本的1/3,這個(gè)結(jié)果與陳賢豐等[34]結(jié)果一致,因而可以推測(cè),丹參與滇丹參雜種出現(xiàn)不育的原因也可能與H2O2的大量積累有關(guān)。

4 結(jié) 論

正交后代與親本材料相比,經(jīng)TTC、I2-KI分別染色后發(fā)現(xiàn)花粉活力差異巨大,可以判斷正交后代為雄性不育植株?；ǖ男螒B(tài)變化比較發(fā)現(xiàn),正交后代在花藥長(zhǎng)、花絲長(zhǎng)和上、下唇長(zhǎng)、寬等方面與親本并無(wú)顯著差別,說(shuō)明正交后代的花朵形態(tài)改變并沒(méi)有導(dǎo)致其不育。

在正交后代的花蕾發(fā)育過(guò)程中某些能量物質(zhì),如可溶性蛋白、可溶性糖等含量出現(xiàn)大幅度下降導(dǎo)致花粉缺乏能量;其次脯氨酸含量也出現(xiàn)降低進(jìn)而使花粉抗逆性降低;MDA大量增加對(duì)細(xì)胞造成傷害以及各種酶活性的變化導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)有害物質(zhì)增加。正交后代的各種生理生化指標(biāo)變化都顯示其不育不是單一因素的影響而是多種生理指標(biāo)綜合作用的結(jié)果。