祁天濤 司二靜 郭銘 孟亞雄 姚立蓉 汪軍成 馬小樂 李葆春 楊軻 尚勛武 王化俊

關(guān)鍵詞：大麥條紋病菌；RNA干擾；遺傳轉(zhuǎn)化；致病性

大麥病害種類多樣，其中由真菌麥類核腔菌Pyrenophora grarnznea侵染導(dǎo)致的條紋病（barleyleaf stripe）是大麥的主要病害之一，嚴(yán)重影響大麥的產(chǎn)量和品質(zhì)。病原菌侵染后，大麥葉片上產(chǎn)生和葉脈平行的條紋狀病斑并不斷延展，最終引發(fā)葉片枯死，穗部發(fā)生畸變不結(jié)實(shí)或種子帶菌。發(fā)病嚴(yán)重年份可造成70%以上的產(chǎn)量損失。目前，大麥條紋病的主要防治措施為建立無病種子田、化學(xué)藥劑防治、栽培管理防治及選育推廣抗條紋病品種。無論是非生物防治措施還是生物防治措施，其前提是要充分了解大麥條紋病菌的致病機(jī)理。

病原菌侵染植物的過程中會(huì)分泌一些效應(yīng)蛋白，這些蛋白可通過多種方式抑制植物產(chǎn)生免疫反應(yīng)，從而促進(jìn)病原菌侵染，最終導(dǎo)致植物品種的抗病性喪失。同時(shí)，植物病原微生物在與寄主植物互作過程中會(huì)促使致病相關(guān)基因過量表達(dá)，其編碼的蛋白在被植物抗病基因編碼的蛋白識(shí)別后可引起植物的免疫反應(yīng)，在不被植物識(shí)別的情況下則表現(xiàn)為毒性功能。到目前為止，研究人員已對(duì)不同病原菌效應(yīng)蛋白的功能進(jìn)行了研究，如Joe等發(fā)現(xiàn)基因RXLR編碼的蛋白AVR3a與信號(hào)肽和半胱氨酸的分泌有關(guān)；張茜茜等發(fā)現(xiàn)稻瘟病菌Pyriculariaorzae效應(yīng)蛋白MoIEEP1分泌到胞外引起寄主細(xì)胞死亡，并證明了該蛋白通過與寄主植物線粒體或過氧化物酶體上的蛋白受體互作表現(xiàn)出致病性；Liu等和Singh等分別構(gòu)建了產(chǎn)黃青霉Penicilliumchrysogenum、長(zhǎng)孢輪枝菌Verticilliurn longispo-rum等真菌致病基因的RNA干擾（RNA interfer-ence，RNAi）載體，用于研究致病相關(guān)基因的功能；郭銘運(yùn)用RNAi技術(shù)研究大麥條紋病菌效應(yīng)子基因Pgr07060的功能，結(jié)果表明該基因與大麥條紋病菌的致病性密切相關(guān)，Pgr07060下調(diào)表達(dá)后，干擾菌株的生長(zhǎng)速率和致病力均顯著降低。

目前，大麥條紋病菌基因組測(cè)序已完成，加速了其致病相關(guān)基因的功能研究進(jìn)程。本課題組前期通過大麥條紋病菌與大麥互作的轉(zhuǎn)錄組分析篩選出在侵染早期高效表達(dá)的效應(yīng)蛋白編碼基因pgFr03902，本研究通過生物學(xué)信息分析、表達(dá)模式分析、亞細(xì)胞定位和RNAi菌株在生長(zhǎng)速率、菌絲形態(tài)和致病性差異上的研究，初步解析大麥條紋病菌基因Pgr03902的功能，為進(jìn)一步研究大麥條紋病菌致病機(jī)制及防治奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

植物材料包括大麥‘Alexis’和本氏煙Nicoti-ana bentharniana。供試大麥條紋病菌為野生型菌株QWC。用于遺傳轉(zhuǎn)化的菌株包括農(nóng)桿菌Agrobacteriurn turn.efaciens GV3101和大腸桿菌E.schrichia coli DH5a。pSilent-l干擾載體由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)曹志艷教授惠贈(zèng)；亞細(xì)胞定位載體PCAM-BIA1300-35S-EGFP及pMD-19 simple vector T載體由本實(shí)驗(yàn)室保存。用于大麥條紋病菌菌株QWC生長(zhǎng)的LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖（potato dextrose，PD）培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖再生（potato dextrose regeneration，rPD）培養(yǎng)基及原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化所使用的試劑配方均參考文獻(xiàn)的方法。

1.2生物信息學(xué)分析

測(cè)序得到的序列利用NCBI ORF finder尋找基因Pgr03902開放閱讀框（ORF，https：∥WWW．nc-bi．nlm. nih. gov/orffinder/）并進(jìn)行序列翻譯。分別登錄ProtParam（https：//web. expasy. org/prot-param/）、SOPMA（ https：∥npsa-prabi. ibcp. fr/cgi-bin/npsa_automat. pl？

page-npsa_sopma. html）、ProtScale（ https：∥web. expasy. org/protparam/）、SignaIP-5.0（http：∥www. detaibio. com/tools/in-dex. php？r=signal-peptide% 2Findex）和Gen-Script（https：∥www. genscript. com/tools/psort），預(yù)測(cè)該基因編碼蛋白的理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、親疏水性、信號(hào)肽和亞細(xì)胞定位。

1.3基因Pgr03902在大麥條紋病菌與大麥互作時(shí)的表達(dá)量分析

將大麥條紋病菌菌株QWC接種于PDA培養(yǎng)基中，于（25±1）℃的真菌培養(yǎng)箱里培養(yǎng)7d，備用；同時(shí)，選取粒大飽滿的大麥品種‘Aleixs’種子90粒，用70%乙醇和5%次氯酸鈉分別處理30s、5min，然后用滅菌超純水沖洗多次后，將種子徹底晾干，備用。采用“三明治法”用培養(yǎng)7d的QWC菌餅處理‘Aleixs’種子，分別在處理后第0、7、14、18天收集種胚，設(shè)置3次重復(fù)。收集的樣品在廣州基迪奧生物科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，獲得Pgr03902基因表達(dá)情況。

1.4Pgr03902基因亞細(xì)胞定位載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化

1.4.1Pgr03902基因的PCR擴(kuò)增

根據(jù)亞細(xì)胞定位載體PCAIVIBIA1300-35S-EGFP質(zhì)粒上的多克隆位點(diǎn)及Pgr03902基因中CDS序列設(shè)計(jì)亞細(xì)胞定位引物EGFP-Pgr03902-F和EG-FP-Pgr03902-R（表1），以菌株QWC的cDNA為模板擴(kuò)增Pgr03902全長(zhǎng)序列。PCR反應(yīng)體系與程序參照2×TransTaq HiFi PCR SuperMixⅡ聚合酶說明書（天根生化科技有限公司）。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，符合預(yù)期產(chǎn)物大小的條帶用DNA膠回收試劑盒（天根生化科技有限公司）回收，與pMD19-T載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，篩選的陽性克隆由北京擎科生物科技有限公司完成測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確的菌液提取質(zhì)粒備用。

1.4.2Pgr03902基因亞細(xì)胞定位載體的構(gòu)建

大麥條紋病菌基因Pgr03902和PCAM-BIA1300-35S-EGFP載體質(zhì)粒分別用Kpn1和Xba1雙酶切并回收酶切產(chǎn)物，16℃恒溫水浴過夜連接酶切產(chǎn)物。反應(yīng)體系：Pgr03902 4uL，PCAM-BIA1300-35S-EGFP 1uL，Solution5uL。連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，通過亞細(xì)胞定位引物M13-R和Primer4（表1）對(duì)菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，提取陽性質(zhì)粒并保存菌液，獲得亞細(xì)胞定位載體PCAMBIA1300-35S-EGFP-Pgr03902.

1.4.3Pgr03902基因的遺傳轉(zhuǎn)化

采用熱激法將亞細(xì)胞定位載體PCAM-BIA1300-35S-EGFP-Pgr03902導(dǎo)入到農(nóng)桿菌GV3101中，取處于生長(zhǎng)期的本氏煙葉片，利用注射法轉(zhuǎn)染煙草，通過激光共聚焦顯微鏡觀察熒光信號(hào)檢測(cè)Pgr03902在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)位置。

1.5Pgr03902基因干擾載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化

1.5.1Pgr03902基因干擾片段的PCR擴(kuò)增

根據(jù)載體質(zhì)粒上的多克隆位點(diǎn)及Pgr03902基因中CDS全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)Pgyr03902的干擾片段引物Pgr03902-Xho1-F/Pgr03902-HindⅢ-R和Pgr03902-Kpn1-F/Pgr03902-Bg/Ⅱ-R（表1），以菌株QWC的cDNA為模板擴(kuò)增干擾片段Pgr03902-1和Pgr03902-2。PCR反應(yīng)體系與程序以及載體構(gòu)建方法同1.4.1。

1.5.2Pgr03902基因干擾載體的構(gòu)建

取干擾片段Pgr03902-1和含載體pSilent-1的質(zhì)粒，分別進(jìn)行Kpn1和BglⅡ雙酶切（10×MBuffer），瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)雙酶切產(chǎn)物，符合預(yù)期產(chǎn)物大小的條帶切膠純化后與載體過夜連接，用Pgr03902-1的引物，對(duì)篩選出的pSilent-1-Pgr03902-1進(jìn)行菌液PCR和雙酶切驗(yàn)證；再取干擾片段Pgr03902-2和構(gòu)建的pSilent-1- Pgr03902-1載體進(jìn)行雙酶切，方法同上，最終獲得pSilent-1-Pgr03902干擾載體。

1.5.3Pgr03902基因干擾片段的遺傳轉(zhuǎn)化

使用酶解液（10mg/ml。溶壁酶+20mg/ml。纖維素酶R-10）裂解大麥條紋病菌菌株QWC菌絲細(xì)胞壁，制備新鮮的原生質(zhì)體，再取pSilent-1-Pgr03902干擾載體質(zhì)粒（1～5mg）與原生質(zhì)體混合，室溫孵育20min后逐滴加入PTC溶液（60%PEG4000，10mmol/L CaCl，10mmol/L Tris-HC1，pH7.5）脅迫，之后將該混合物倒入含潮霉素B（hy-gromycin B．Hyg B）的PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，對(duì)菌落進(jìn)行3代抗性篩選，至篩選出Pgr03902干擾菌株P(guān)gr03902。

1.6干擾菌株的Hyg B鑒定及RT-qPCR檢測(cè)

采用特異性引物Hyg B-F、Hyg B-R（表1）對(duì)干擾菌株△Pgr03902的Hyg B抗性基因進(jìn)行PCR檢測(cè)，對(duì)鑒定正確的干擾菌株提取RNA合成cD-NA，對(duì)干擾菌株進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析（引物見表1）。獲得干擾菌株P(guān)gr03902基因的循環(huán)閾值（Ct），以大麥條紋病菌的Actin為內(nèi)參基因，將野生菌株QWC的Pgr03902基因表達(dá)量設(shè)為1，計(jì)算得出各干擾菌株的基因相對(duì)表達(dá)量，干擾率=100%一表達(dá)量%，試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。

1.7基因功能初步分析

1.7.1營養(yǎng)生長(zhǎng)分析

使用打孔器在野生型菌株QWC和干擾菌株菌落邊緣各打取5 mm菌餅，分別接種于PDA培養(yǎng)基上，并置于22℃黑暗環(huán)境下培養(yǎng)，試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。在第7天時(shí)測(cè)量菌落直徑并觀察菌落形態(tài)，拍照。

1.7.2致病性測(cè)定

采用“三明治法”進(jìn)行人工接種試驗(yàn)。將滅菌處理后的‘Aleixs’種子擺放在長(zhǎng)滿菌絲的PDA培養(yǎng)基上，用另一長(zhǎng)滿菌絲的PDA培養(yǎng)基的皿覆蓋在種子上，密封后置于6℃黑暗條件下侵染種子21d。分別用野生型菌株QWC和干擾菌株△Pgr03902進(jìn)行接種，以空白PDA培養(yǎng)基為對(duì)照，設(shè)置3次重復(fù)。然后將種子種植于長(zhǎng)×寬×高=10cm×10cm×10cm的小花盆中，于人工氣候室中光暗各12h交替（黑暗溫度12℃和光照溫度20℃）生長(zhǎng)。參照劉海穎等的研究方法，于大麥三葉期對(duì)條紋病原菌處理后的大麥統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)。

病情指數(shù)（DI）=∑（各級(jí)病株數(shù)×發(fā)病級(jí)值）／（最高病級(jí)值×調(diào)查總株數(shù)）×100。

利用Excel 2016對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總和處理，通過單因素方差分析（One-way ANOVA）比較大麥植株接種野生型菌株QWC和干擾菌株APgr03902的差異，結(jié)果用Excel 2016作圖。

2結(jié)果分析

2.1Pgr03902基因編碼產(chǎn)物的生物信息學(xué)分析

Pgr03902基因全長(zhǎng)348 bp，編碼116個(gè)氨基酸，對(duì)該基因編碼蛋白的理化性質(zhì)的預(yù)測(cè)結(jié)果表明：該蛋白是酸性蛋白，等電點(diǎn)約為6.53，分子量29.25kD，組成氨基酸中甘氨酸（Gly）占比最多，為14.3%。Pgr03902編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲占比最多，為39.66%，其次是延伸鏈和a螺旋，占比分別為27.59%和23.28%，轉(zhuǎn)角最少，為9.48%。該基因編碼蛋白脂溶系數(shù)為26.15，分子式是C553 H862 N148 0165，S5，不穩(wěn)定性指數(shù)為41.95，并且親疏水性評(píng)分峰值主要在0以上，因此預(yù)測(cè)該蛋白為不穩(wěn)定的疏水性蛋白。軟件預(yù)測(cè)該蛋白無可識(shí)別的信號(hào)肽區(qū)域。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)該蛋白存在于細(xì)胞膜。

2.2大麥條紋病菌效應(yīng)蛋白編碼基因Pgr03902表達(dá)特性分析

通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析大麥條紋病菌侵染種子過程中Pgr03902的表達(dá)特性，結(jié)果表明，Pgr03902在接種后第0、7、14、18天時(shí)的基因表達(dá)量分別為113. 46、610. 59、715. 10、1193. 95 FPKM，較對(duì)照分別增加了5. 38、6.30、10. 52倍，隨著侵染時(shí)間的延長(zhǎng)，Pgr03902的表達(dá)量顯著上調(diào)（圖1），說明其可能在大麥條紋病菌侵染大麥及在大麥體內(nèi)生長(zhǎng)繁殖過程中發(fā)揮重要作用。

2.3Pgr03902基因亞細(xì)胞定位載體的構(gòu)建與農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

由Pgr03902基因亞細(xì)胞定位引物M13-R和Primer 4對(duì)大腸桿菌轉(zhuǎn)化子進(jìn)行Pgr03902基因的菌落PCR，發(fā)現(xiàn)部分轉(zhuǎn)化子的擴(kuò)增產(chǎn)物為1000bp（圖2），表明成功構(gòu)建Pgr03902基因的亞細(xì)胞定位載體EGFP-Pgr03902。最后，利用目的基因擴(kuò)增引物EGFP-Pgr03902-F和EGFP-Pgr03902-R，對(duì)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子再進(jìn)行Pgr03902基因PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，擴(kuò)增片段大小為546bp（圖3），進(jìn)一步對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明Pgr03902基因已成功轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中。

2.4Pgr03902基因在本氏煙中的亞細(xì)胞定位

用含PCAMBIA1300-35S-EGFP-Pgr03902和空載體PCAMBIA1300-35S-EGFP的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染煙草，熒光顯微鏡下均能觀察到綠色熒光，亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，Pgr03902在細(xì)胞核和細(xì)胞膜中均有表達(dá)（圖4）。

2.5Pgr03902基因干擾菌株的篩選與驗(yàn)證

采用PCR從干擾菌株中獲得Pgr03902基因的干擾片段長(zhǎng)度為271bp，對(duì)干擾載體進(jìn)行雙酶切，得到的條帶大小與Pgr03902干擾片段和pSilent-1載體一致，表明成功構(gòu)建Pgr03902基因的干擾載體pSilent-1-Pgr03902。

本試驗(yàn)共篩選出1個(gè)干擾菌株，通過Hyg B的特異性引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，獲得1026bp的HygB基因（圖5a）。RT-qPCR結(jié)果表明，與大麥條紋病菌野生型菌株QWC相比，干擾菌株△Pgr03902的Pgr03902基因相對(duì)表達(dá)量顯著降低了60.79%（P<0.05）（圖5b）。

2.6突變菌株的營養(yǎng)生長(zhǎng)分析

分別于PDA平板上接種野生型菌株QWC和干擾菌株△Pgr03902（圖6），發(fā)現(xiàn)它們的菌落均為白色，平坦，邊緣有微小的鋸齒，但干擾菌株菌絲較野生型菌株稀疏。于接種第7天測(cè)量各菌株的菌落直徑，干擾菌株的菌落直徑為（2. 32±0.14）cm，小于野生型菌株[（4.72±0.11）cm]，表明干擾菌株生長(zhǎng)減緩。

2.7干擾菌株的致病性分析

分別用野生型菌株QWC和干擾菌株△Pgr03902浸染大麥‘Alexis7的種子，于大麥三葉期觀察發(fā)病癥狀（圖7a）并統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)（圖7b），結(jié)果顯示，QWC和干擾菌株APgr03902浸染引起的病情指數(shù)分別為（51.53±4.23）和（37.86±3.36），APgr03902侵染后病情指數(shù)顯著低于QWC，說明APgr03902的致病性明顯減弱，Pgr03902基因可能參與調(diào)控大麥條紋病菌的致病性。

3結(jié)論與討論

病原菌基因功能的研究結(jié)果有助于闡明其致病機(jī)理的遺傳背景，也可以為防控植物病害提供新的策略和抗性育種信息。大量研究表明，病原菌致病相關(guān)基因在侵染寄主時(shí)表達(dá)量較高。本研究通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析了Pgr03902基因在大麥條紋病菌與大麥互作時(shí)的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)Pgr03902基因的表達(dá)量在侵染過程中隨侵染時(shí)間延長(zhǎng)而升高，表明Pgr03902基因可能在大麥條紋病菌對(duì)大麥的致病過程中起到關(guān)鍵作用。研究表明，絲狀真菌入侵寄主日寸，疏水蛋白參與了這一復(fù)雜的過程。疏水蛋白可以在親水一疏水界面自我組裝成膜，形成較穩(wěn)定的多聚體膜，使絲狀真菌菌絲避開水環(huán)境，誘導(dǎo)某些特化結(jié)構(gòu)及毒素產(chǎn)生等。本研究通過生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)該基因編碼的蛋白為不穩(wěn)定的疏水性蛋白，說明該基因可能參與調(diào)控病原菌致病性。細(xì)胞核作為植物和動(dòng)物細(xì)胞中的最重要的細(xì)胞器之一，在寄主的免疫反應(yīng)過程中起著非常重要的作用，生物信息學(xué)預(yù)測(cè)該基因只位于細(xì)胞膜部位，但采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)對(duì)基因Pgr03902進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析顯示，其在細(xì)胞核和細(xì)胞膜上均有表達(dá)，兩者結(jié)果不一致，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

病原菌與寄主間能否建立親和互作關(guān)系，往往是由于病原菌中能夠干擾寄主正常生理代謝功能的致病基因發(fā)揮重要的作用，該基因會(huì)調(diào)控病原菌對(duì)寄主的吸附、感染、定殖等過程；有些致病基因的表達(dá)產(chǎn)物具有雙重作用，一方面可以致毒，另一方面也可以充當(dāng)激發(fā)子。目前，RNAi技術(shù)已經(jīng)在多數(shù)真核生物病原菌基因功能驗(yàn)證方面有大量應(yīng)用，利用RNAi技術(shù)能夠有效地抑制基因表達(dá)，對(duì)基因的功能研究具有重要意義。夏楊等對(duì)膠孢炭疽菌Colletotrichum. gZoeosporioides

CgCDC2基因沉默突變株的PG、PL基因的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，突變體菌株的PG、PL基因表達(dá)量均顯著下調(diào)，并且與蛋白定量分析結(jié)果一致，說明CgCDC2參與調(diào)控PG、PL基因的表達(dá)；蘇初連等通過PEG介導(dǎo)法成功獲得膠孢炭疽菌泛素結(jié)合酶基因CgUBC2的RNAi沉默突變體，研究結(jié)果顯示該基因參與調(diào)控膠孢炭疽菌的致病過程；侯靜靜通過營養(yǎng)生長(zhǎng)、毒素試驗(yàn)及致病性試驗(yàn)研究大麥條紋病菌致病性候選基因Pgrnior的功能，發(fā)現(xiàn)干擾菌株生長(zhǎng)速度和致病力均明顯低于野生型菌株，說明該基因參與調(diào)控大麥條紋病菌的致病性。在本研究中，基因Pgr03902的干擾突變顯著影響了大麥條紋病菌的營養(yǎng)生長(zhǎng)，并且干擾菌株侵染大麥后引起的發(fā)病率較QWC菌株降低，表明Pgr03902基因參與調(diào)控大麥條紋病菌致病性。