沙 聰 張一心 袁愛軍 吳仁極

南通瑞慈醫(yī)院普外科,江蘇省南通市 226009

microRNAs(miRNAs)是一類長度約22個核苷酸的小RNA分子,且不能為蛋白編碼。miRNA在基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控作用已被眾多研究所證實[1-2]。通過mRNA堿基對特定基因3’-未翻譯區(qū)(3’-UTR)中的特定靶位點的識別,miRNAs在生理或病理條件下能有效地降低靶基因的mRNA水平,從而抑制該基因的翻譯。由于mRNA靶基因非常廣泛,通過影響這些靶基因的表達進而影響細胞增殖、凋亡、分化、血管生成等關(guān)鍵生物學(xué)過程[3]。因而,miRNA在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起著重要的調(diào)節(jié)作用,根據(jù)不同的癌癥類型或腫瘤細胞,同一個miRNA可能具有相反的生物學(xué)功能,或作為癌基因或作為腫瘤抑制因子發(fā)揮生物學(xué)功能。

miR-139-5p是從miR-139前體加工而來的成熟miRNA形式。雖然miR-139-5p在人宮頸癌中的腫瘤抑制作用已被證實[4],而其在胃癌中的研究較少,其生物學(xué)功能及分子機制并不十分清楚。在本研究中,筆者采用Real-time PCR、免疫組化等多種生物實驗方法及生物信息分析技術(shù),探討miR-139-5p在胃癌中的生物學(xué)功能及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 胃癌患者及組織標(biāo)本留取 選取我院2018年8月—2022年7月收治的38例老年(年齡>65歲)胃癌患者為研究對象,術(shù)中留取患者腫瘤組織、癌旁正常胃組織和區(qū)域淋巴結(jié)?；颊呓M織手術(shù)切除后,立即置于液氮中速凍,然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存。術(shù)后根據(jù)患者病理報告將淋巴結(jié)區(qū)分為轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)和未轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)。38例患者中男27例,女11例,中位年齡72歲(65～78歲)。

1.2 miR-139-5p靶基因預(yù)測 采用生物信息學(xué)分析方法,通過microRNA與mRNA相互作用預(yù)測軟件Targetscan 7.2(http://www.targetscan.org/vert_72/)檢索miR-139-5p的靶基因。

1.3 Real-time PCR檢測miR-139-5p和TCF4表達 根據(jù)試劑盒說明,使用TRIzol試劑(Life Technology,Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)從細胞中提取總RNA。采用逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV(RNase H-)(TaKaRa,Tokyo,Japan)將總RNA反向轉(zhuǎn)錄成microRNA-cDNAs,使用特定的引物(中國廣州,Ribonobio)及M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(美國Promega公司)合成了該基因的cDNA。隨后使用SYBREx-Taq(Takara Bio,Inc.,日本)qRT-PCR反應(yīng)。miR-139-5p、TCF4相對表達水平采用2-ΔΔCt法進行定量分析。以U6或GAPDH作為內(nèi)參基因進行表達水平標(biāo)準(zhǔn)化。

1.4 免疫組化檢測TCF4蛋白表達 采用免疫組化二步法對TCF4進行測定:首先對標(biāo)本進行切片脫蠟等處理,然后進行抗原修復(fù),消除過氧化物酶活性加入一抗,37℃孵育1h;然后用PBS沖洗。將試劑(Polymer helper)滴入其中,于37℃條件下孵育20min;滴入二抗,于37℃條件下孵育0.5h; PBS沖洗厚DAB顯色5min。顯色后在光學(xué)顯微鏡下進行觀察,判斷TCF4的表達情況。根據(jù)文獻報道,TCF4陽性者光鏡下胃癌細胞核及細胞漿呈現(xiàn)棕黃色。

2 結(jié)果

2.1 miR-139-5p在胃癌中的表達 正常胃組織和胃癌組織中miR-139-5p相對表達量分別為-3.06±1.43和-4.09±2.13,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.46,P=0.016)。未轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中miR-139-5p相對表達量分別為0.25±1.64和-1.59±1.67,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.51,P=0.001)。癌旁正常胃組織和未轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中miR-139-5p相對表達量顯著高于胃癌組織和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié),見圖1。

圖1 胃癌患者癌組織、癌旁組織、未轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)以及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中miR-139-5p相對表達量散點圖

2.2 miR-139-5p靶基因預(yù)測 采用生物信息學(xué)分析方法,通過microRNA與mRNA相互作用預(yù)測軟件Targetscan 7.2(http://www.targetscan.org/vert_72/)檢索miR-139-5p的靶基因,結(jié)果顯示TCF4基因3’-UTR區(qū)域ACUGUAC序列與miR-139-5p 5’-UTR區(qū)域UGACAUC結(jié)合緊密。提示TCF4可能為miR-139-5p的靶基因,見圖2a。Real-time PCR結(jié)果顯示,TCF4基因在胃癌組織和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中的表達水平顯著高于對應(yīng)癌旁組織(t=2.14,P=0.036)和未轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織(t=2.68,P=0.027),見圖2b、2c。且癌組織中TCF4的表達水平與miR-139-5p表達水平呈負相關(guān)(rpearson=-0.42,P=0.03)。

2.3 TCF4蛋白表達水平 TCF4蛋白主要表達于細胞核和細胞漿,陽性表達呈現(xiàn)棕黃色顆粒均勻分布。38例患者癌組織中TCF4蛋白陽性26例(68.4%),陰性12例(31.6%)。

2.4 miR-139-5p、TCF4基因表達與患者臨床病理特征關(guān)系 miR-139-5p表達水平與胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.05)和腫瘤病理分級(P<0.05)有關(guān),低表達組患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比例和低分化比例較高。TCF4表達水平與胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.05)和腫瘤浸潤深度(P<0.05)有關(guān),TCF4陽性表達患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤浸潤漿膜層比例較高,見表1。

表1 miR-139-5p、TCF4基因表達與患者臨床病理特征關(guān)系

2.5 TCF4基因表達與患者預(yù)后關(guān)系 在TCGA數(shù)據(jù)庫中,根據(jù)TCF4基因mRNA相對表達水平分為高表達(≥TCF4表達中位數(shù))和低表達患者。Log-rank檢驗顯示,TCF4高表達組患者總生存(OS)顯著低于TCF4低表達患者(HR=1.4,P=0.032),而高低表達患者無疾病進展生存(DFS)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(HR=1.4,P=0.094),見圖3。

圖3 TCF4基因表達與患者預(yù)后關(guān)系

3 討論

新近的腫瘤流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示,2018年全球胃癌新發(fā)病例超過100萬例,成為第五大常見癌癥[5]。據(jù)估計,2018年全世界死于胃癌的人數(shù)約為78.3萬,是第三大致死惡性腫瘤[6]。飲食因素,如亞硝酸鹽和鹽漬食品、幽門螺桿菌感染是已知的胃癌的主要危險因素。隨著食品保存技術(shù)的改進和幽門螺桿菌的治療,胃癌的發(fā)病率已呈現(xiàn)下降趨勢[7]。然而,近年來近端胃癌的發(fā)生率上升,且預(yù)后較差。我國、日本等東亞國家胃癌發(fā)病率較高,占全世界胃癌患者的50%左右[8-9]。整體上,我國胃癌患者的預(yù)后較差,晚期胃癌比例較高,早期診斷水平低于歐美及日本等發(fā)達國家[10]。盡管胃癌的發(fā)病率和死亡率較高,但其發(fā)生的確切分子機制并未完全闡明[11-12]。癌基因和抑癌基因的時空異常表達,是胃癌發(fā)生的分子基礎(chǔ)。近年來,隨著高通量測序技術(shù)、芯片技術(shù)的不斷發(fā)展,大量新的基因被發(fā)現(xiàn)并證實其相關(guān)生物學(xué)功能。miRNAs已被廣泛證實在人體多種惡性腫瘤中存在差異表達,并扮演抑癌或促癌基因的角色[13-14]。

miR-139-3p和miR-139-5p是同一miR-139前體的成熟miRNA產(chǎn)物。miR-139-3p已被廣發(fā)研究,證實其在多種人體腫瘤中呈現(xiàn)上調(diào)表達[15-16]。抑制miR-139-3p表達后,腫瘤細胞表現(xiàn)出增殖水平降低,而凋亡比例增高,提示miR-139-3p為一經(jīng)典的癌基因,具有促癌作用[17]。而miR-139-5p相關(guān)研究報道較少,Ji等[4]在宮頸癌中的研究發(fā)現(xiàn),miR-139-5p具有抑制腫瘤細胞增殖作用,認為其分子機制可能與其靶向調(diào)控TCF4表達,從而抑制Wnt/β-catenin 信號通路有關(guān)。

在本研究中,筆者采用Real-time PCR法檢測了38例胃癌患者癌組織、癌旁正常胃組織、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)和未轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中miR-139-5p的表達情況。miR-139-5p在正常組織表達水平顯著高于癌組織,同時在未轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)表達水平顯著高于轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)。提示miR-139-5p可能在胃癌的發(fā)生及腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要抑制作用。筆者同時采用miRNA靶基因在線預(yù)測軟件對該基因的靶基因進行了預(yù)測,提示轉(zhuǎn)錄因子4(TCF4)基因3’-UTR區(qū)域ACUGUAC序列與miR-139-5p 5’-UTR區(qū)域UGACAUC結(jié)合緊密。TCF4可能為miR-139-5p的靶基因。為進一步證實TCF4為miR-139-5p靶基因的關(guān)系,筆者同時檢查了胃癌患者TCF4的表達水平,結(jié)果提示TCF4在癌組織和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達水平高于癌旁組織,且癌組織中TCF4與miR-139-5p表達水平呈現(xiàn)負相關(guān)。證實了生物信息分析結(jié)果,TCF4為miR-139-5p的靶基因。同時進一步分析TCF4和miR-139-5p高低表達與胃癌患者臨床病理特征關(guān)系發(fā)現(xiàn),miR-139-5p低表達組患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比例和低分化比例較高。而TCF4高表達患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤浸潤漿膜層比例較高,二者臨床特征也呈負相關(guān)。為了進一步分析TCF4表達水平與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系,筆者對TCGA數(shù)據(jù)庫中的胃癌患者進行了總生存和無疾病進展生存分析,結(jié)果認為TCF4高表達組患者總生存(OS)顯著低于TCF4低表達患者,而高低表達組患者無疾病進展生存(DFS)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

TCF4基因編碼蛋白為轉(zhuǎn)錄因子4,該蛋白為一種堿性螺旋—環(huán)—螺旋轉(zhuǎn)錄因子。編碼的蛋白質(zhì)識別Ephrussi盒(“-box”)結(jié)合位點(“CANNTG”),這是免疫球蛋白增強子中首次發(fā)現(xiàn)的基序。該基因廣泛表達,已證實在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用。該基因的缺陷是導(dǎo)致皮特—霍普金斯綜合征的原因之一。此外,通常編號為10～37個重復(fù)單元的內(nèi)含子CTG重復(fù)可以擴展到>50個重復(fù)單元,并導(dǎo)致Fuchs內(nèi)皮性角膜營養(yǎng)不良。近年來陸續(xù)有文獻報道,該基因的異常表達與腫瘤發(fā)生有關(guān)。Bi 等[18]研究顯示miR-137通過靶向TCF4抑制結(jié)腸癌癌癥細胞系的增殖、遷移和侵襲,證實TCF4表達水平降低后能夠抑制腸癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移生物活性。He等[19]通過miR-133a-5p下調(diào)TCF4表達,從而抑制腸癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移,也證實TCF4在腸癌中發(fā)揮重要作用。TCF4下調(diào)表達后,導(dǎo)致腫瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移能力減低的分子機制并不十分明確。相關(guān)研究認為,可能與一下機制有關(guān):(1)TCF-4表達下調(diào)后,beta-catenin信號通路被抑制,而beta-catenin信號通路是細胞增殖的重要通路,因此腫瘤細胞增殖能力減低[20]。(2)TCF4表達減低后,Wnt/β-catenin/TCF4信號通路被抑制,導(dǎo)致細胞遷移增殖能力減低[21]。

綜上所述,miR-139-5p在老年胃癌患者中低表達,并可能通過靶向調(diào)控TCF4抑制腫瘤的進展。TCF4高表達與胃癌患者總生存期減低有關(guān),并有望成為胃癌預(yù)后不良的分子標(biāo)志物。體內(nèi)轉(zhuǎn)染或上調(diào)miR-139-5p表達,為開發(fā)胃癌靶向藥物提供了新的思路。但miR-139-5p靶向調(diào)控TCF4后導(dǎo)致老年胃癌患者腫瘤細胞增殖遷移能力減低的確切分子機制仍不十分明顯,應(yīng)進一步采用基因測序、免疫共沉淀等新技術(shù),探討明確其調(diào)控信號通路的分子機制。