汪泳昌，祝駿賢，李建松，陳 辰，紀(jì)利芹，洪孝友，劉曉莉，王亞坤，吳聰聰，余汶君，羅來(lái)福，陳海港，魏成清，朱新平，張俊杰，李 偉

1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052

2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510380

3.惠州市財(cái)興實(shí)業(yè)有限公司，廣東 惠州 516000

Dkkl1 (Dickkopf-like 1) 是Dickkopf (DKK) 基因家族中的一員，屬于分泌型糖蛋白，最初是在非洲爪蟾 (Xenopus laevis) 中被鑒定為胚胎頭部誘導(dǎo)劑和Wingless (Wnt) 拮抗劑[1]。已有研究證明Dkkl1 可以在脊椎動(dòng)物的多種細(xì)胞類(lèi)型中抑制Wnt 誘導(dǎo)的β-catenin 的穩(wěn)定性[2-3]。在小鼠 (Mus musculus) 中，Dkkl1 由單個(gè)基因編碼，其表達(dá)首先在2 細(xì)胞期和4 細(xì)胞期中檢測(cè)到[4]，在胚胎第15 天時(shí)，Dkkl1基因在發(fā)育中的骨骼和眼睛中表達(dá)，但在性腺原基中不表達(dá)。然而在成年小鼠中，Dkkl1基因的表達(dá)只限于睪丸，Dkkl1mRNA 在發(fā)育中的精母細(xì)胞中豐富表達(dá)，首先在發(fā)育中的頂體中表達(dá)，然后在成熟精子的頂體中積累[5]。不僅如此，Dkkl1 還是一種N-糖基化蛋白，在精母細(xì)胞成熟過(guò)程中參與精子合成[6]，它標(biāo)志著發(fā)育中的精母細(xì)胞和精子細(xì)胞，通過(guò)靶向敲除Dkkl1基因，小鼠胚胎正常發(fā)育，形成可育后代[7]。但是，Dkkl1基因的缺失會(huì)導(dǎo)致精子體外受精能力嚴(yán)重受損，而這種作用在體內(nèi)受精中似乎得到了某種因素的補(bǔ)償。此外，Dkkl1基因還與人 (Homosapiens)的弱精子癥[8]和不育癥[9]密切相關(guān)。上述研究表明，Dkkl1基因在哺乳動(dòng)物睪丸發(fā)育和精子發(fā)生過(guò)程中扮演著十分重要的角色，但是目前關(guān)于Dkkl1基因在龜鱉類(lèi)動(dòng)物中的研究還鮮有報(bào)道。

爬行綱在物種進(jìn)化過(guò)程中具有特殊的進(jìn)化位置，是第一批真正擺脫水環(huán)境依賴(lài)而登陸的脊椎動(dòng)物，也是羊膜動(dòng)物中最早的一種，既能進(jìn)化為哺乳類(lèi)，又能演化為鳥(niǎo)類(lèi)，在動(dòng)物學(xué)研究中占有舉足輕重的地位[10]。中華鱉 (Pelodiscussinensis) 隸屬于爬行綱、龜鱉目、鱉科、中華鱉屬，是我國(guó)淡水特種養(yǎng)殖中的重要品種，因其獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[11]和藥用價(jià)值[12]而深受市場(chǎng)青睞，直接經(jīng)濟(jì)價(jià)值超過(guò)百億。隨著年齡的增長(zhǎng)，中華鱉睪丸發(fā)育呈現(xiàn)出不同的形態(tài)特征，大致可分為4 個(gè)時(shí)期：精原細(xì)胞期、精母細(xì)胞期、精子細(xì)胞期和精子期。1 冬齡雄性中華鱉精巢中的細(xì)胞分散，曲細(xì)精管內(nèi)主要由精原細(xì)胞組成；2 冬齡曲細(xì)精管中的生精上皮除了有精原細(xì)胞外，初級(jí)精母細(xì)胞也逐漸分化形成；3 冬齡精巢已具備各種類(lèi)型的精細(xì)胞，曲細(xì)精管腔內(nèi)出現(xiàn)大量精子[13-14]。中華鱉的睪丸發(fā)育和精子發(fā)生受多基因的調(diào)控，例如：L i 等[15]發(fā)現(xiàn)中華鱉中Hmgb2基因的表達(dá)呈現(xiàn)睪丸特異性，主要存在于圓形精子細(xì)胞和精子中，證實(shí)其在中華鱉的精巢發(fā)育和精子生成過(guò)程中具有重要功能；Lei 等[16]發(fā)現(xiàn)Spats1是一個(gè)雄性表達(dá)特異的基因，其主要存在于中華鱉的初級(jí)精母細(xì)胞、次級(jí)精母細(xì)胞和精子中，與中華鱉的精子發(fā)生和釋放密切相關(guān)；Zhou 等[17]使用RNA 干擾技術(shù)成功敲除Amh基因，證明其在促進(jìn)中華鱉的睪丸發(fā)育和精子發(fā)生方面具有必要和充分的作用。然而，除了關(guān)鍵基因之外，外源性激素也可以在一定程度上調(diào)控睪丸發(fā)育和精子發(fā)生[18-19]，且在不同發(fā)育時(shí)期發(fā)揮著不同的作用[20]。例如：意大利壁蜥 (Podarcis sicula) 在高濃度17β-雌二醇 (E2) 和低濃度甲基睪酮 (MT)中會(huì)阻滯精子發(fā)生[21]，而在低濃度E2和高濃度MT 中可誘導(dǎo)精子發(fā)生的恢復(fù)[22]。鋸蓋魚(yú) (Centropomusundecimalis)在15 和30 mg·kg–1的MT 下可刺激睪丸的發(fā)育和生長(zhǎng)并加速精子發(fā)生[23]；產(chǎn)后15～30 d 的大鼠暴露于E2下會(huì)延遲精子發(fā)生[24]。然而，近年有關(guān)Dkkl1基因的研究十分匱乏，且現(xiàn)有的研究還遠(yuǎn)不足以闡明中華鱉精子發(fā)生的背后機(jī)制。因此本研究克隆了中華鱉Dkkl1基因的cDNA 序列，對(duì)其序列特征進(jìn)行詳細(xì)分析，探索其在不同體組織和不同時(shí)期性腺中的表達(dá)模式，以及其對(duì)外源性激素 [E2和17α-甲基睪酮 (17α-MT)] 處理的響應(yīng)，為深入探討Dkkl1基因在中華鱉睪丸發(fā)育和精子發(fā)生中的功能研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料的收集

本研究所用中華鱉采購(gòu)自廣東省惠州市財(cái)興實(shí)業(yè)有限公司，選取1、2、3 冬齡健康中華鱉，麻醉后放血。取3 冬齡中華鱉的心臟、肝臟、脾臟、腎臟、腦、肌肉、卵巢和1、2、3 冬齡的精巢組織于無(wú)酶凍存管中，并將其迅速放入液氮中速凍，于-80 ℃超低溫冰箱保存，每種組織均取3 個(gè)生物重復(fù)。

1.2 總RNA 提取及cDNA 第一鏈合成

使用Trizol 法提取中華鱉各組織的總RNA，提取RNA 的濃度和質(zhì)量由NanoQTM核酸檢測(cè)儀和1% (w) 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。使用HiScript?III RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper) 反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Vazyme，中國(guó)) 去除基因組DNA 污染，合成cDNA 第一鏈。

1.3 中華鱉Dkkl1 cDNA 的克隆

參考NCBI GenBank 公布的中華鱉Dkkl1基因序列信息 (XM_014572465) 設(shè)計(jì)引物Dkkl1-F/Dkkl1-R (表1)，以3 冬齡中華鱉精巢cDNA 為模板，將Dkkl1基因的開(kāi)放閱讀框 (Open reading frame,ORF) 區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，并使用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。目的片段使用Gel Extraction Kit (Omega，中國(guó)) 膠回收試劑盒進(jìn)行回收，連接至pMD19-T (TaKaRa，中國(guó)) 載體上，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細(xì)胞 (TaKaRa，中國(guó)) 中。最后，從轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞中篩選出陽(yáng)性克隆，并送至廣州天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4 Dkkl1 基因的生物信息學(xué)分析

使用ExPASy (https://web.expasy.org/translate/) 在線(xiàn)網(wǎng)站預(yù)測(cè)開(kāi)放閱讀框[25]，采用DNAMAN 軟件進(jìn)行氨基酸序列的翻譯和同源性比較[26]、ClustalW (BioEdit) 軟件進(jìn)行氨基酸序列的多重比對(duì)[27-28]，通過(guò)ProtParam 分析Dkkl1 蛋白的理化性質(zhì)[29]和SOPMA 分析Dkkl1 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)[30]，利用SWISS-MODLE 同源建模構(gòu)建Dkkl1 蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)[31]。

1.5 組織表達(dá)分析

運(yùn)用Primer 軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR (RT-qPCR) 所需引物Dkkl1-qF/Dkkl1-qR，同時(shí)選擇中華鱉的Ef1α基因作為內(nèi)參基因[32](表1)。以中華鱉不同組織的cDNA 作為模板，利用Applied Biosystems StepOnePlus Real-Time PCR Systems (Applied Biosystems，新加坡)對(duì)其進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析。反應(yīng)體系為20 μL，其中2×iTaq Universal SYBR Green (BIO-RAD，美國(guó)) 10 μL，引物Dkkl1-qF/Dkkl1-qR 各0.5 μL，cDNA 模板2 μL，雙蒸水 (ddH2O) 7 μL。半定量分析使用與RT-qPCR 相同的特異性引物 (Dkkl1-qF/Dkkl1-qR)，采用各組織的cDNA 作為模板進(jìn)行普通PCR (RT-PCR) 擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠分離并進(jìn)行拍照 (GenoSens2200，中國(guó))。

1.6 成體雄性中華鱉外源性激素處理

選取體表無(wú)傷、活躍的3 冬齡雄性中華鱉33 只，其中30 只平均分為2 組 (E2處理組和17α-MT 處理組)，從腿部肌肉注射E2和17α-MT，質(zhì)量濃度為50 μg·μL-1，劑量為10 mg·kg-1[16]；另外3 只注射等劑量的溶劑作為空白對(duì)照組，分別于激素處理后第6、第12、第24、第48 小時(shí)和第7 天隨機(jī)采集3 只雄性性腺，置于液氮中進(jìn)行總RNA 提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析。

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用2-ΔCt法于第6、第12、第24、第48 小時(shí)計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量[15]，每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少獨(dú)立重復(fù)3 次，所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05 表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 中華鱉Dkkl1 基因克隆結(jié)果及其編碼蛋白氨基酸序列分析

克隆獲得的中華鱉Dkkl1cDNA 序列長(zhǎng)為823 bp，其中3' 非編碼區(qū) (UTR) 長(zhǎng)67 bp，5' UTR 長(zhǎng)90 bp，ORF 長(zhǎng)666 bp，共編碼222 個(gè)氨基酸(圖1)。中華鱉Dkkl1 蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為24.924 77 kD，理論等電點(diǎn)為10.8，不穩(wěn)定系數(shù)為58.71，脂溶系數(shù)為84.91，總平均親水系數(shù)為-0.418，表明Dkkl1 蛋白是一種穩(wěn)定性較差、親水性較強(qiáng)的堿性蛋白質(zhì)。其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、β-折疊、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈組成，其中α-螺旋占33.78%，β-折疊占5.86%，無(wú)規(guī)則卷曲占46.85%，延伸鏈占13.51%，三級(jí)結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主。氨基酸序列同源性比對(duì)結(jié)果顯示：其與中華草龜(Chinemysreevesii)的相似性較高 (81%)，與棱皮龜 (Dermochelyscoriacea)的相似性較低(70%)，與綠海龜(Cheloniamydas)、三趾箱龜(Terrapene carolinatriunguis)、巴西紅耳龜(Trachemysscriptaelegans)、西部錦龜(Chinemyspictabellii) 的同源性分別為80%、79%、78%、78% (圖2)。

圖1 中華鱉 Dkkl1 基因核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide of P.sinensis Dkkl1 gene and its encoded protein sequence

圖2 中華鱉與其他物種的 Dkkl1 氨基酸序列同源相似性比對(duì)注：所有的氨基酸序列來(lái)自于NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)：巴西紅耳龜，XM_034791724.1；綠海龜，XM_037888484.1；三趾箱龜，XM_026659251.1；中華草龜，XM_039510142.1；西部錦龜，XM_024113109.1；棱皮龜，XM_038381465.2。黑色陰影為氨基酸序列比對(duì)相同的位點(diǎn)，灰色陰影為相近位點(diǎn)。Fig.2 Homologous comparison of Dkkl1 amino acid sequence of P.sinensis with other speciesNote: All amino acid sequences come from NCBI database: T.scripta elegans,XM_034791724.1; C.mydas,XM_037888484.1;T.carolinatriunguis,XM_026659251.1; C.reevesiis,XM_039510142.1; C.picta bellii,XM_024113109.1; D.coriacea,XM_038381465.2.The black and gray shadows represent the same and similar sites,respectively.

2.2 中華鱉Dkkl1 基因的組織表達(dá)

RT-qPCR 結(jié)果顯示，中華鱉Dkkl1mRNA 在3 冬齡成體精巢中極顯著性高表達(dá) (P<0.001)，而在心臟、肝臟、脾臟、腎臟、腦、肌肉和卵巢中幾乎不表達(dá) (圖3-a)。RTPCR 結(jié)果顯示，該基因僅在3 冬齡中華鱉成體精巢組織中檢測(cè)到目的條帶，而在其他體組織中均未檢測(cè)到 (圖3-b)。

圖3 中華鱉 Dkkl1 基因在 3 冬齡成體組織中的表達(dá)情況注：***.P<0.001；M.DL2000 Marker。Fig.3 Expression of Dkkl1 gene in tissues of 3-winter-age adult P.sinensisNote: ***.P<0.001; M.DL2000 Marker.

2.3 中華鱉不同發(fā)育時(shí)期精巢中Dkkl1 基因的表達(dá)變化

通過(guò)RT-qPCR 檢測(cè)中華鱉Dkkl1基因在不同發(fā)育時(shí)期精巢中的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，隨著中華鱉年齡的增長(zhǎng)，其精巢中Dkkl1基因的表達(dá)量逐漸上升，并在3 冬齡時(shí)達(dá)到頂峰。此外，Dkkl1基因在2 冬齡和3 冬齡精巢中的表達(dá)量極顯著高于1 冬齡 (P<0.001)，而2 冬齡和3 冬齡精巢之間的表達(dá)差異不顯著 (P>0.05) (圖4)。

圖4 中華鱉 Dkkl1 基因在不同發(fā)育時(shí)期精巢中的表達(dá)情況注：**.P<0.01表示差異極顯著。Fig.4 Expression of P.sinensis Dkkl1 gene in different developmental periods of testisNote: **.P<0.01 represents very significant difference.

2.4 E2 和17α-MT 處理對(duì)中華鱉精巢Dkkl1 基因表達(dá)的影響

對(duì)雄性中華鱉進(jìn)行E2和17α-MT 激素處理后，其精巢中Dkkl1基因的表達(dá)量顯著降低 (P<0.05)。E2處理后，精巢中Dkkl1基因的表達(dá)量持續(xù)下降，至第48 小時(shí)幾乎為0，但是在7 d 后得到部分恢復(fù)；17α-MT 處理后，精巢中Dkkl1基因的表達(dá)量同樣受到顯著性抑制 (P<0.05)，在第48 小時(shí)達(dá)到最低值，但在第7 天顯著上升 (P<0.05) (圖5)。

圖5 中華鱉精巢中 Dkkl1 基因?qū)?17β-雌二醇和17α-甲基睪酮處理后的表達(dá)響應(yīng)注：不同小寫(xiě)字母表示組間存在顯著性差異(P<0.05)。Fig.5 Expression response of Dkkl1 gene in testis of P.sinensis to E2 and 17α-MT treatmentNote: Different lowercase letters represent significant differences between groups (P<0.05).

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)克隆得到中華鱉Dkkl1基因的cDNA 序列，序列長(zhǎng)823 bp，共編碼222 個(gè)氨基酸，氨基酸序列比對(duì)和NJ 進(jìn)化樹(shù)結(jié)果表明其與爬行類(lèi)親緣關(guān)系最近。RTqPCR 和RT-PCR 結(jié)果顯示Dkkl1mRNA 在精巢組織中高表達(dá)且極顯著高于卵巢等其他組織 (P<0.001)，表明Dkkl1基因表達(dá)在中華鱉中具有性別二態(tài)性和組織特異性。這與在小鼠和人類(lèi)中發(fā)現(xiàn)的兩性差異表達(dá)模式類(lèi)似。Dkkl1基因的組織分布研究表明，Dkkl1mRNA 僅在睪丸中表達(dá)豐富，而在附睪和其他組織中幾乎不表達(dá)。此外，人類(lèi)基因芯片結(jié)果顯示Dkkl1基因在成年男性睪丸中的雜交信號(hào)強(qiáng)度是胎兒睪丸的405.56 倍，對(duì)人體多個(gè)組織的RTPCR 分析表明，Dkkl1mRNA 僅在睪丸中表達(dá)，Western blot 分析也表明Dkkl1基因主要在人睪丸中表達(dá)[5]。綜上所述，推測(cè)Dkkl1基因在中華鱉睪丸形成或功能維持上可能具有重要的調(diào)控作用。

同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著中華鱉年齡的增長(zhǎng)，其精巢中Dkkl1基因的表達(dá)量逐漸上升，并在3 冬齡時(shí)達(dá)到頂峰，Dkkl1基因在中華鱉成體睪丸中的表達(dá)與其睪丸發(fā)育和精子發(fā)生的過(guò)程大致吻合。1 冬齡中華鱉的睪丸主要由精原細(xì)胞組成；2 冬齡時(shí)逐漸分化為初級(jí)精母細(xì)胞和次級(jí)精母細(xì)胞，并且在生精管中觀察到少量精子；3 冬齡時(shí)已經(jīng)完全性成熟，睪丸中產(chǎn)生大量成熟精子[33]。Dkkl1基因這種特殊的表達(dá)模式與睪丸發(fā)育成熟程度呈正相關(guān)，并且很可能參與了精子發(fā)生過(guò)程。因此，在生產(chǎn)實(shí)踐中通過(guò)Dkkl1基因的相對(duì)表達(dá)量可預(yù)估中華鱉睪丸的發(fā)育成熟程度，這可為選育高繁殖力和優(yōu)秀的雄性親本提供新的生物指標(biāo)。

精子發(fā)生是雌激素與雄激素共同調(diào)節(jié)的結(jié)果[34]。E2是一種天然的雌激素[35]，17α-MT 是一種具有雄激素效應(yīng)的內(nèi)分泌干擾物[36]，這兩種物質(zhì)已被廣泛用于與睪丸發(fā)育和精子發(fā)生有關(guān)的功能研究[37-38]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)向雄性中華鱉注射外源性激素E2和17α-MT 后，發(fā)現(xiàn)兩者均可顯著抑制Dkkl1基因的表達(dá)。相比于17α-MT，E2對(duì)Dkkl1基因的抑制作用更強(qiáng)，在注射12 h 后，其表達(dá)量幾乎為零。有研究表明，外源性雌激素可通過(guò)影響雌激素受體途徑誘導(dǎo)精子發(fā)生障礙，并對(duì)精子的質(zhì)量和受精潛力產(chǎn)生負(fù)面影響[39]，低劑量的E2可延遲精子產(chǎn)生，而高劑量的E2則會(huì)完全抑制精子產(chǎn)生[40]。Dkkl1基因在精子發(fā)生過(guò)程中被定位在成熟的精子或精子的頂體中[4]，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)Dkkl1基因在小鼠胎盤(pán)發(fā)育和精子發(fā)生過(guò)程中表達(dá)，并且具有促進(jìn)精子穿透透明帶的能力，將其敲除后，小鼠體外受精能力顯著降低[6]。因此，外源性激素E2處理可能是抑制Dkkl1基因表達(dá)的關(guān)鍵因素。雌、雄激素通過(guò)不同的受體途經(jīng)影響精子發(fā)生，而雄激素大多是通過(guò)雄激素特異性受體AR 介導(dǎo)的[41]。本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)注射外源性激素17α-MT 導(dǎo)致Dkkl1基因的表達(dá)受到顯著抑制。Dakhova 等[42]發(fā)現(xiàn)Dkkl1基因是睪酮產(chǎn)生的負(fù)調(diào)控因子，敲除Dkkl1基因?qū)е骂?lèi)固醇生成酶基因Cyp11a和Cyp17表達(dá)量增加，使睪酮的合成局部上調(diào)。而注射外源性激素17α-MT 會(huì)導(dǎo)致生物體內(nèi)睪酮水平瞬間升高[43]，從而可能抑制中華鱉Dkkl1基因的轉(zhuǎn)錄，以響應(yīng)體內(nèi)睪酮水平的升高。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)克隆得到中華鱉Dkkl1基因的cDNA 片段，對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)信息分析，發(fā)現(xiàn)中華鱉在進(jìn)化關(guān)系上與爬行類(lèi)動(dòng)物相近。運(yùn)用RT-PCR 和RT-qPCR 對(duì)Dkkl1基因在雌、雄中華鱉各組織和精巢不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)差異進(jìn)行了分析，確定Dkkl1基因在3 冬齡成體精巢中顯著高表達(dá)，并且隨著年齡的增長(zhǎng)其表達(dá)量逐漸升高。通過(guò)注射外源性激素E2和17α-MT，發(fā)現(xiàn)其可顯著抑制Dkkl1基因在精巢中的表達(dá)。由以上結(jié)果可以推論，Dkkl1基因在中華鱉睪丸發(fā)育和成熟過(guò)程中起著重要作用，可能與精子發(fā)生密切相關(guān)，且可受外源性激素調(diào)控，這為今后龜鱉類(lèi)動(dòng)物睪丸發(fā)育及精子發(fā)生機(jī)制的研究拓展了新思路。