鄭緒瑞 章海鑫 曹海鵬

文章編號(hào)：1006-3188（2023）05-011-03

摘要：為評價(jià)類球紅細(xì)菌對農(nóng)藥的耐受性，本實(shí)驗(yàn)采用牛津杯法測定類球紅細(xì)菌對甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、氟硅唑、苯醚甲環(huán)唑、腐霉利、苯甲·嘧菌酯、井岡·己唑醇、苯甲·丙環(huán)唑、聯(lián)菊·啶蟲脒、烯?！で杷?、虱脲·蟲螨腈等10種農(nóng)藥的敏感性，進(jìn)而采用試管二倍稀釋法測定了類球紅細(xì)菌對敏感農(nóng)藥的耐受劑量。結(jié)果表明，類球紅細(xì)菌對甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、氟硅唑、苯醚甲環(huán)唑、腐霉利、苯甲·嘧菌酯、井岡·己唑醇、苯甲·丙環(huán)唑耐藥，對虱脲·蟲螨腈、聯(lián)菊·啶蟲脒、烯?！で杷蚋叨让舾?；虱脲·蟲螨腈、聯(lián)菊·啶蟲脒和烯?！で杷?qū)︻惽蚣t細(xì)菌的MIC和MBC分別為48.83 mg/L和97.65 mg/L、195.31 mg/L和195.31 mg/L、195.31 mg/L和195.31 mg/L。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為養(yǎng)殖水體中的農(nóng)藥殘留對類球紅細(xì)菌的影響評價(jià)奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：類球紅細(xì)菌；農(nóng)藥；敏感性；耐受劑量

中圖分類號(hào)：S948??? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

類球紅細(xì)菌（Rhodobactersphaeroides）是一種具有良好解毒性能光合細(xì)菌［1］。曹海鵬等［2］研究表明，類球紅細(xì)菌能夠?qū)嘲傧x對斑馬魚的LD50從26.06 mg/L提升至59.51 mg/L，表現(xiàn)出對降低敵百蟲良好的解毒效果。近年來，隨著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)規(guī)模的擴(kuò)大，投入使用的農(nóng)藥逐漸增多，農(nóng)藥污染養(yǎng)殖水體環(huán)境的問題日益突出［3，4］。然而，養(yǎng)殖水體中的農(nóng)藥殘留是否影響類球紅細(xì)菌尚不清晰。鑒此，本實(shí)驗(yàn)采用牛津杯法測定了類球紅細(xì)菌對甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、氟硅唑、苯醚甲環(huán)唑、腐霉利、苯甲·嘧菌酯、井岡·己唑醇、苯甲·丙環(huán)唑、聯(lián)菊·啶蟲脒、烯?！で杷颉⑹濉はx螨腈等10種農(nóng)藥的敏感性，進(jìn)而采用試管二倍稀釋法測定了類球紅細(xì)菌對敏感農(nóng)藥的耐受劑量，以期為養(yǎng)殖水體中的農(nóng)藥殘留對類球紅細(xì)菌的影響評價(jià)奠定基礎(chǔ)。

1 材料方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

類球紅細(xì)菌XR12，由本實(shí)驗(yàn)室從養(yǎng)殖污泥中分離、鑒定并保存［2］；虱脲·蟲螨腈（有效成分12％）、井岡·己唑醇（有效成分11％）、氟硅唑（有效成分10％）、苯甲·嘧菌酯（有效成分30％）、腐霉利（有效成分50％）、苯醚·甲環(huán)唑（有效成分10％）、苯甲·丙環(huán)唑（有效成分30％）、聯(lián)菊·啶蟲脒（有效成分6％）、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽（有效成分5％）、烯?！で杷颍ㄓ行С煞?0％），所有藥物均為國內(nèi)公司生產(chǎn)。營養(yǎng)瓊脂平板、紅細(xì)菌液體培養(yǎng)基［5］、含4 mL紅細(xì)菌液體培養(yǎng)基的帶帽試管30根、含2 mL紅細(xì)菌液體培養(yǎng)基的帶帽試管600根，均在121°C滅菌20 min，備用。

1.2 類球紅細(xì)菌菌懸液的制備

將類球紅細(xì)菌在無菌環(huán)境下接種于滅菌后的紅細(xì)菌液體培養(yǎng)基，置于恒溫光照搖床中培養(yǎng)48h，溫度30℃，轉(zhuǎn)速180 r/min；之后10000 r/min離心去除上清液，加入無菌水得到菌懸液，通過MPN5管法［6］測定菌懸液活菌含量并用無菌水稀釋至濃度為1.0×107 CFU/mL。

1.3 類球紅細(xì)菌對農(nóng)藥的敏感性分析

采用牛津杯法［7］測定類球紅細(xì)菌對農(nóng)藥的敏感性。無菌操作將107 CFU/mL類球紅細(xì)菌菌懸液0.2 mL均勻涂布營養(yǎng)瓊脂平板，然后在涂有類球紅細(xì)菌的營養(yǎng)瓊脂平板上放置無菌牛津杯，接著在每個(gè)牛津杯中分別加入0.2 mL濃度為10000 mg/L的甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、氟硅唑、苯醚甲環(huán)唑、腐霉利、苯甲·嘧菌酯、井岡·己唑醇、苯甲·丙環(huán)唑、聯(lián)菊·啶蟲脒、烯?！で杷?、虱脲·蟲螨腈藥液，然后于30℃恒溫正置培養(yǎng)48 h，測量抑菌圈直徑（d）。d＞15 mm為高度敏感，10 mm＜d≤15 mm為中度敏感，d≤10 mm為耐藥。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)平行。

1.4 類球紅細(xì)菌對農(nóng)藥的耐受劑量分析

采用試管二倍稀釋法測定類球紅細(xì)菌對1.3節(jié)篩選的敏感農(nóng)藥的耐受劑量。試驗(yàn)前無菌操作分別將聯(lián)菊·啶蟲脒、烯酰·氰霜唑、虱脲·蟲螨腈0.1 mL加入含4 mL無菌紅細(xì)菌液體培養(yǎng)基的試管中至質(zhì)量濃度為25000 mg/L，混合均勻后再無菌操作從質(zhì)量濃度為25000 mg/L的試管中吸取2 mL至含2 mL紅細(xì)菌液體培養(yǎng)基的試管中使質(zhì)量濃度為12500 mg/L，混合均勻后再無菌操作從質(zhì)量濃度為12500 mg/L的試管中吸取2 mL至含2 mL紅細(xì)菌液體培養(yǎng)基的試管中使質(zhì)量濃度為6250 mg/L，依次操作將敏感農(nóng)藥稀釋成3125、1562.5、781.25、390.63、195.31、97.65、48.83、24.41、2.21、6.10、3.05、1.53、0.76、0.38、0.19、0.10 mg/L，同時(shí)以含2 mL無菌紅細(xì)菌液體培養(yǎng)基的試管作為空白對照。無菌操作接種類球紅細(xì)菌菌懸液至含不同質(zhì)量濃度敏感農(nóng)藥的試管中使菌終濃度5.0×105 CFU/mL，然后于恒溫振蕩培養(yǎng)箱30℃培養(yǎng)48h后，以肉眼觀察結(jié)果，把無渾濁現(xiàn)象、稀釋度最大的質(zhì)量濃度作為敏感農(nóng)藥對類球紅細(xì)菌的最小抑菌濃度（Minimal inhibitory concentration，MIC）。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步從無菌生長的試管中取0.2 mL培養(yǎng)液在營養(yǎng)瓊脂平板上涂布，然后將平板置于30℃恒溫培養(yǎng)48h，觀察有無菌落形成。把無菌落形成的、稀釋度最大的質(zhì)量濃度作為敏感農(nóng)藥對類球紅細(xì)菌的最小殺菌濃度（Minimum bactericidal concentration，MBC）。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)平行。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SPSS 19.0 軟件進(jìn)行處理分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 類球紅細(xì)菌對農(nóng)藥的敏感性

實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表1）表明，虱脲·蟲螨腈、聯(lián)菊·啶蟲脒、烯酰·氰霜唑?qū)︻惽蚣t細(xì)菌具有明顯抑菌活性（圖1），其對類球紅細(xì)菌的抑菌圈直徑分別為22.33、25.67、19.67 mm，說明類球紅細(xì)菌對虱脲·蟲螨腈、聯(lián)菊·啶蟲脒、烯?！で杷蚓哂懈叨让舾行?。甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、氟硅唑、苯醚甲環(huán)唑、腐霉利、苯甲·嘧菌酯、井岡·己唑醇、苯甲·丙環(huán)唑?qū)︻惽蚣t細(xì)菌的抑菌圈直徑小于10 mm，說明類球紅細(xì)菌對其不敏感。

2.2 類球紅細(xì)菌對農(nóng)藥的耐受劑量

實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表2）表明，聯(lián)菊·啶蟲脒、烯?！で杷颉⑹濉はx螨腈對類球紅細(xì)菌的MIC分別為195.31、195.31、48.83 mg/L，對類球紅細(xì)菌的MBC分別為195.31、195.31、97.65 mg/L。

3 討論

相關(guān)研究［8］表明，光合細(xì)菌對農(nóng)藥的敏感性具有一定的差異性。蘇亮等［9］證明沼澤紅假單胞菌對養(yǎng)殖水體中殘留的阿維毒、百草枯等農(nóng)藥敏感，對辛硫磷和滅多威等農(nóng)藥耐藥。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，類球紅細(xì)菌對甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、氟硅唑、苯醚甲環(huán)唑、腐霉利、苯甲·嘧菌酯、井岡·己唑醇、苯甲·丙環(huán)唑不敏感；對虱脲·蟲螨腈、聯(lián)菊·啶蟲脒和烯?！で杷蚋叨让舾?。光合細(xì)菌對農(nóng)藥敏感性的差異可能與其具有分解利用農(nóng)藥的能力有關(guān)［10］。

近年來，有機(jī)氯、有機(jī)磷、菊酯類等農(nóng)藥殘留在水產(chǎn)養(yǎng)殖水體中均被檢出［11-13］，水產(chǎn)養(yǎng)殖水體已經(jīng)面臨了農(nóng)藥殘留污染問題。目前，有的殘留農(nóng)藥對益生菌的抑制作用已經(jīng)被證實(shí)。例如，藍(lán)俊虹等［14］研究發(fā)現(xiàn)喹烯酮在≥25 mg/L時(shí)對丁酸梭菌具有抑制作用，在≥50 mg/L時(shí)對枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌具有抑制作用。然而，農(nóng)藥殘留對類球紅細(xì)菌的影響未有報(bào)道，本研究證實(shí)類球紅細(xì)菌對甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、氟硅唑、苯醚甲環(huán)唑、腐霉利、苯甲·嘧菌酯、井岡·己唑醇、苯甲·丙環(huán)唑耐藥，對虱脲·蟲螨腈、聯(lián)菊·啶蟲脒、烯酰·氰霜唑農(nóng)藥高度敏感；虱脲·蟲螨腈、聯(lián)菊·啶蟲脒和烯酰·氰霜唑?qū)︻惽蚣t細(xì)菌的的MIC和MBC分別為48.83 mg/L和97.65 mg/L、195.31 mg/L和195.31 mg/L、195.31 mg/L和195.31 mg/L，可作為養(yǎng)殖水體中這些農(nóng)藥殘留對類球紅細(xì)菌影響的風(fēng)險(xiǎn)評估依據(jù)。

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