唐 帥,李 陽(yáng),黃飛躍,吳富菊

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院 婦產(chǎn)科,吉林 長(zhǎng)春130041)

子癇前期(preeclampsia,PE) 是一種多系統(tǒng)共同進(jìn)展的疾病,其特征為妊娠20 w后出現(xiàn)的高血壓和尿蛋白,或高血壓伴終末器官功能障礙,伴或不伴有尿蛋白,是造成孕產(chǎn)婦及圍產(chǎn)兒死亡的重要原因之一[1]。目前認(rèn)為子宮-胎盤循環(huán)系統(tǒng)的正確建立取決于滋養(yǎng)細(xì)胞正常浸潤(rùn)胎盤床。在胎盤著床的關(guān)鍵時(shí)刻,由于胎盤內(nèi)局部的氧化應(yīng)激過(guò)度增加,滋養(yǎng)細(xì)胞不斷凋亡,侵襲作用減弱,致使胎盤淺著床,這是其發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié),此時(shí)孕婦體內(nèi)出現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、細(xì)胞凋亡增加等一系列的氧化應(yīng)激損傷[2-3]。Wnt信號(hào)通路是自然界普遍存在且非常保守的信號(hào)通路,可以調(diào)節(jié)胚胎著床、組織穩(wěn)態(tài)以及其他機(jī)體機(jī)能,包括增殖、遷移、侵襲和凋亡等方面,在生命體內(nèi)發(fā)揮著重大作用[3]。氧化應(yīng)激是Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)控的重要生物學(xué)環(huán)節(jié)[4],PE發(fā)病過(guò)程中氧化應(yīng)激反應(yīng)過(guò)度激活是重要的病理特征[5-6]。近期已有實(shí)驗(yàn)表明,PE患者胎盤組織中GSK-3β、β-catenin和Wnt1的蛋白表達(dá)水平降低,而DKK1在PE患者胎盤組織中的蛋白表達(dá)水平則增加,這與正常妊娠組相比有顯著差異[6]。因此,Wnt/β-catenin信號(hào)通路可能在PE的發(fā)病機(jī)制中起重要作用,并且可能是預(yù)防和治療PE的前瞻性治療目標(biāo)。

丹參素是丹參中的水溶性酚酸類主要藥效成分之一,是天然抗氧化物質(zhì),可以通過(guò)提高機(jī)體超氧化物歧化酶(ROS)活性,去除ROS,改善氧化應(yīng)激,從而減輕ROS對(duì)細(xì)胞毒性的作用,改善細(xì)胞缺血缺氧[7]。目前丹參素已被證明可有效改善PE小鼠模型中母體綜合征和胎兒綜合征的預(yù)后[8]。因此本研究探討丹參素通過(guò)經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路改善滋養(yǎng)細(xì)胞氧化損傷中的作用機(jī)制,報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

丹參素(PubChem CID:439435)購(gòu)買于北京Solarbio公司,產(chǎn)氣厭氧袋D-07購(gòu)買于日本東京AnaeroPack公司,人絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞系HTR-8/SVneo購(gòu)買于上海Ek-Bioscience公司,RPMI-1640培養(yǎng)基和青霉素-鏈霉素溶液購(gòu)買于美國(guó)Gibco公司,胎牛血清購(gòu)買于美國(guó)Clark Bio公司,活性氧檢測(cè)試劑盒、Hoechst 33342活細(xì)胞染色液(100×)、Western及IP細(xì)胞裂解液、蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物、BCA測(cè)定試劑盒和SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)購(gòu)買于上海Beyotime公司,CCK-8試劑盒購(gòu)買于廣州cellcook公司,GADPH抗體、DKK1抗體、Wnt1抗體、GSK-3β抗體、β-catenin抗體、vinculin抗體、山羊抗兔二抗和ECL化學(xué)發(fā)光劑購(gòu)買于武漢Proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1建立HTR-8/SVneo氧化應(yīng)激模型及實(shí)驗(yàn)組 使用含有抗壞血酸鈉的 Anaeropack 誘導(dǎo)缺氧條件,抗壞血酸鈉是通過(guò)氧化降解吸收O2和生成CO2的主要物質(zhì)[9]。將HTR-8/SVneo細(xì)胞在缺氧條件下培養(yǎng)8 h。然后將細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下(37℃ 5% CO2)培養(yǎng)16 h,完成2個(gè)周期。正常對(duì)照組(NC)在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)48 h。將兩組HTR-8/SVneo細(xì)胞進(jìn)一步分為NC組、正常培養(yǎng)+丹參素處理組(NC+DS)、H/R處理組(HR)和H/R+丹參素處理組(HR+DS)4個(gè)組。4組再培養(yǎng)48 h,各組總培養(yǎng)96 h。

1.2.2細(xì)胞活力測(cè)定 采用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力。將HTR-8/SVneo細(xì)胞(1×103個(gè)細(xì)胞/孔)在H/R條件下培養(yǎng)48 h,然后用不同濃度的丹參素(0.01、0.1、1、10和100 μmol·L-1)處理24 h和48 h。各組處理后,每孔細(xì)胞中加入10%的CCK-8試劑完全培養(yǎng)基100 μl,37℃孵育2 h。在450 nm處測(cè)量光密度來(lái)確定細(xì)胞活力。

1.2.3HTR-8/SVneo細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生 DCFH-DA探針是檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的主要方法。將細(xì)胞核染成藍(lán)色的Hoechst 33342作為內(nèi)參。將DCFH-DA和Hoechst 33342稀釋并按說(shuō)明配制成工作溶液。取1 ml工作液和細(xì)胞在37℃下孵育20 min。細(xì)胞用不含胎牛血清和雙抗體的RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌3次,然后立即使用熒光顯微鏡觀察和拍照。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.2.4Western blot檢測(cè) 用含蛋白酶磷酸酶抑制劑的細(xì)胞裂解液提取蛋白質(zhì)。用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。等量的總蛋白(20 μg)在10%SDS-PAGE凝膠上電泳,轉(zhuǎn)移到0.45 μm PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉膜2 h,然后用兔抗DKK1(1∶2 000)、Wnt1(1∶500)、GSK-3β(1∶4 000)和β-catenin(1∶6 000)抗體孵育4℃過(guò)夜。兔抗GADPH(1∶10 000)和小鼠抗vinculin(1∶10 000)抗體作為對(duì)照。用山羊抗兔(1∶4 000)和山羊抗小鼠(1∶50 000)二抗檢測(cè)抗體結(jié)合情況。使用ECL試劑盒檢測(cè)目的條帶。結(jié)果重復(fù)3次以上,使用Image J軟件對(duì)圖像進(jìn)行灰度值分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行分析。所有數(shù)值均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度和時(shí)間丹參素對(duì)HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖的影響

為了檢測(cè)丹參素對(duì)能否改善H/R的HTR-8/SVneo細(xì)胞生長(zhǎng),細(xì)胞采用不同濃度的丹參素處理(0.01、0.1、1、10、100 μmol·L-1),處理時(shí)間為24 h或48 h。研究結(jié)果表明,丹參素在上述濃度中對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有抑制作用,各組在處理24 h后細(xì)胞活力無(wú)明顯改善(見表1)。處理48 h后,當(dāng)?shù)⑺貫?00 μmol·L-1和10 μmol· L-1時(shí),滋養(yǎng)細(xì)胞活力均明顯恢復(fù),尤以10 μmol·L-1顯著(P<0.000 1),后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用10 μmol·L-1作為丹參素的作用濃度,處理時(shí)間為48 h(見表2)。

表1 不同濃度丹參素作用24 h對(duì)HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖的影響

表2 不同濃度丹參素作用48 h對(duì)HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖的影響

2.2 丹參素對(duì)HTR-8/SVeno氧化應(yīng)激的影響

在本研究中,細(xì)胞內(nèi)的 ROS 在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷中起著關(guān)鍵作用;每個(gè)細(xì)胞中的 ROS 水平是通過(guò)測(cè)量 DCFH 熒光強(qiáng)度的變化來(lái)確定的,以 Hoechst 33342 為參照物將細(xì)胞核染成藍(lán)色。研究結(jié)果表明,H/R處理導(dǎo)致HTR-8/SVneo細(xì)胞內(nèi)ROS積累顯著增加,而丹參素處理則有效緩解了H/R誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生。此外,在正常培養(yǎng)條件下,丹參素處理不會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)的 ROS 水平。見圖1。

圖1 各組 HTR-8/SVneo 細(xì)胞中的ROS 水平

2.3 Western Blot對(duì)Wnt信號(hào)通路中各分子變化

結(jié)果顯示,HR組中的DKK1表達(dá)水平較NC組明顯升高(P=0.048 0),加入丹參素處理后,NC+DS組以及HR+DS組中的DKK1表達(dá)水平較NC組無(wú)明顯差別(P=0.993 2、P=0.299 8),NC+DS組以及HR+DS組中的DKK1轉(zhuǎn)錄水平較HR組無(wú)明顯差別(P=0.101 0、P=0.608 8)。HR組中的GSK-3β轉(zhuǎn)錄水平較NC組、NC+DS組明顯下降(P=0.009 0、P=0.040 7),加入丹參素處理后,NC+DS組以及HR+DS組中的GSK-3β表達(dá)水平較NC組無(wú)明顯差別(P=0.690 7、P=0.426 5),HR+DS組中的GSK-3β表達(dá)水平較HR組無(wú)明顯差別(P=0.081 4)。HR組中的β-catenin表達(dá)水平較NC組、NC+DS組以及HR+DS組中均明顯下降(P=0.000 3、P=0.003 4、P=0.006 2),加入丹參素處理,NC+DS組和HR+DS組中的β-catenin表達(dá)水平較NC組無(wú)明顯差別(P=0.190 7、P=0.097 5),NC+DS組中的β-catenin表達(dá)水平較NC組無(wú)明顯差別(P=0.960 6)。HR組中的Wnt1表達(dá)水平較NC組和HR+DS組中均明顯下降(P=0.043 6、P=0.021 9),NC+DS組和HR+DS組中的Wnt1表達(dá)水平較NC組無(wú)明顯差別(P=0.954 5、P=0.957 5),HR組和HR+DS組中的Wnt1表達(dá)水平較NC+DS組無(wú)明顯差別(P=0.089 4、P=0.750 4)。見圖2。

圖2 HTR-8/SVneo 細(xì)胞中β-catenin、DKK1、GSK-3β和Wnt1的水平

3 討論

3.1 PE中氧化應(yīng)激以及Wnt信號(hào)通路的改變

氧化與抗氧化的動(dòng)態(tài)平衡調(diào)節(jié)是人體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和正常生理功能的重要機(jī)制。目前認(rèn)為過(guò)度的氧化應(yīng)激是PE的重要發(fā)病機(jī)制,在妊娠的任何階段包括足月妊娠都存在發(fā)生一定程度的胎盤氧化應(yīng)激[10]。產(chǎn)生的ROS不斷損傷滋養(yǎng)細(xì)胞,使得它們的浸潤(rùn)能力受損,浸潤(rùn)深度過(guò)淺,從而造成子宮螺旋動(dòng)脈重塑不足,胎盤無(wú)法有效著床,導(dǎo)致胎盤缺血缺氧-再灌注損傷,氧化應(yīng)激水平進(jìn)一步增加[11-12]。但目前氧化應(yīng)激通過(guò)何種途徑使滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力降低的具體機(jī)制尚不明確。

滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)能力受損以及胎盤螺旋動(dòng)脈重鑄不足是PE的發(fā)病基礎(chǔ)。WANG等[6]發(fā)現(xiàn)與正常胎盤組織相比,重度子癇前患者胎盤中DKK1的表達(dá)水平明顯升高,而Wnt1、β-catenin和GSK-3β的表達(dá)水平顯著降低,c-myc和cyclinD1的mRNA水平降低,這表明Wnt/β-catenin信號(hào)通路可能通過(guò)影響滋養(yǎng)細(xì)胞的分化、增殖和侵襲等過(guò)程在PE的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。經(jīng)過(guò)H/R處理的HTR-8/SVneo細(xì)胞顯示出明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng),其細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著增加,與PE患者的胎盤組織的情況相似[13]。研究證明,Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活能夠改善細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)[14]。在H/R處理組中,細(xì)胞中β-catenin蛋白的表達(dá)量顯著低于正常對(duì)照組,同時(shí)ROS水平和細(xì)胞凋亡也有所增加。使用LiCl能夠抑制細(xì)胞內(nèi)ROS積累,改善滋養(yǎng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激,降低滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡,在一定程度上恢復(fù)β-catenin的表達(dá),增強(qiáng)滋養(yǎng)細(xì)胞的浸潤(rùn)能力[15-16]。本研究利用H/R處理的HTR-8/SVneo細(xì)胞模型,通過(guò)蛋白質(zhì)印跡證實(shí)此模型組較正常培養(yǎng)細(xì)胞Wnt1、β-catenin和GSK-3β的表達(dá)水平顯著降低,而DKK1的表達(dá)水平則顯著升高,同時(shí)伴有細(xì)胞內(nèi)ROS的累積。這一結(jié)果提示,氧化應(yīng)激可能通過(guò)抑制滋養(yǎng)細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路,損傷滋養(yǎng)細(xì)胞,使得滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)能力受損,參與PE發(fā)病。

3.2 丹參素對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用

丹參素是丹參中的水溶性酚酸類主要藥效成分之一,性狀穩(wěn)定,能夠被人體快速吸收。它能夠抵抗氧化損傷,保護(hù)心血管系統(tǒng),改善微循環(huán),抑制炎癥和抗腫瘤等廣泛的藥理作用。丹參素通過(guò)清除細(xì)胞內(nèi)氧自由基,控制ROS水平,從而減輕細(xì)胞氧化損傷,以達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的作用[17]。滋養(yǎng)細(xì)胞氧化損傷后,細(xì)胞內(nèi)ROS明顯增加,添加復(fù)方丹參能夠明顯改善,且改善程度與復(fù)方丹參濃度呈正相關(guān)[18]。丹參素已被證明在改善先兆子癇小鼠模型中母體綜合征的預(yù)后方面是有效和安全的[19]。焦波等[20]觀察到丹參注射液聯(lián)合硫酸鎂治療PE的患者,其氧化應(yīng)激水平明顯降低,妊娠結(jié)局明顯改善。另一方面,丹參素還能夠通過(guò)增加妊娠早期胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá),促進(jìn)胎盤血管網(wǎng)的形成、滋養(yǎng)細(xì)胞的浸潤(rùn)和母體胎盤循環(huán)的構(gòu)成,減輕血管重鑄障礙,從而增加胎盤血供,改善胎盤缺血缺氧狀態(tài),抑制PE的發(fā)展[19]。

本研究在H/R處理的HTR-8/SVneo細(xì)胞模型基礎(chǔ)上,經(jīng)過(guò)丹參素處理后,滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)ROS明顯減少,細(xì)胞活力明顯增加,證實(shí)了丹參素的抗氧化作用,改善H/R引起的滋養(yǎng)細(xì)胞活力下降。Western blot顯示,H/R處理后HR組DKK1明顯升高,而Wnt1、GSK-3β和β-catenin水平明顯降低。經(jīng)丹參素處理后 HR+DS組Wnt1和β-catenin明顯恢復(fù)。這一情況說(shuō)明,在滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激可以抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路表達(dá),經(jīng)過(guò)丹參素處理后,缺氧/復(fù)氧的滋養(yǎng)細(xì)胞中Wnt1、β-catenin蛋白表達(dá)增加,提示氧化應(yīng)激主要通過(guò)抑制Wnt1蛋白及β-catenin蛋白的表達(dá),阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)通路,損傷滋養(yǎng)細(xì)胞,誘發(fā)PE。丹參素能夠明顯改善此過(guò)程,保護(hù)滋養(yǎng)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損傷,為治療PE提供了新的思路和方向。

綜上所述,氧化應(yīng)激抑制了Wnt1和β-catenin水平,抑制了Wnt/β-catenin信號(hào)通路,從而損害滋養(yǎng)細(xì)胞功能,促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡,降低滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲性。丹參素能減輕滋養(yǎng)細(xì)胞氧化應(yīng)激,恢復(fù)Wnt1和β-catenin水平,重新激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路,為治療PE提供了新的思路和方向。