單關(guān)月,萬(wàn) 慧,張雨欣,史云鵬,李海軍*

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 腫瘤免疫實(shí)驗(yàn)室,吉林 長(zhǎng)春130021;2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 肝膽胰外科,吉林 長(zhǎng)春130033)

銅(Cu)是人體必須的微量元素,在線(xiàn)粒體呼吸、抗氧化防御和生物復(fù)合物合成等多種細(xì)胞生命過(guò)程中發(fā)揮重要輔助功能[1]。然而,生理?xiàng)l件下細(xì)胞內(nèi)Cu濃度較低,Cu濃度小幅度升高可能引起細(xì)胞毒性,甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡[2]。細(xì)胞內(nèi)銅的攝取、分布和消除等過(guò)程受到機(jī)體嚴(yán)格調(diào)控?；蛲蛔儗?dǎo)致Cu過(guò)量累積與多種致命性疾病的發(fā)生密切相關(guān)。因此,充分理解細(xì)胞內(nèi)Cu積累和代謝機(jī)制對(duì)于疾病的治療至關(guān)重要[3]。銅死亡是一種由Cu2+過(guò)度蓄積引發(fā)的細(xì)胞調(diào)控性死亡方式,不同于細(xì)胞凋亡、鐵死亡和壞死[4]。銅死亡發(fā)生的過(guò)程如下:細(xì)胞內(nèi)的Cu2+靶向結(jié)合三羧酸循環(huán)中的脂?；煞?銅結(jié)合脂?；煞志奂?鐵硫蛋白簇繼發(fā)性下降-蛋白毒性應(yīng)激并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

肝臟是人體腹腔內(nèi)最大的消化器官,承載著機(jī)體消化、代謝、解毒和免疫等重要生理功能[5]。肝臟疾病包括病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、肝纖維化、肝硬化和肝癌。氧化應(yīng)激反應(yīng)失衡、免疫異常、代謝異常、基因突變等是其主要致病因素[6]。銅死亡相關(guān)研究逐漸成為熱點(diǎn),通過(guò)干預(yù)細(xì)胞銅死亡治療肝臟疾病具有廣闊前景。本文將圍繞銅代謝和銅死亡相關(guān)信號(hào)通路,以及銅死亡介導(dǎo)的肝臟疾病發(fā)病機(jī)制展開(kāi)綜述,以期為銅死亡相關(guān)肝臟疾病的治療提供新思路。

1 銅死亡

Cu是機(jī)體必須的微量元素,多種研究表明Cu對(duì)于維持機(jī)體多種生命活動(dòng)代謝酶的活性具有重要意義[7]。因此機(jī)體內(nèi)Cu濃度必須維持在相對(duì)狹窄范圍內(nèi),才能保證機(jī)體正常的生理功能。細(xì)胞發(fā)生銅死亡的前提條件是細(xì)胞蓄積銅過(guò)量而未能有效代謝,因此本部分將從機(jī)體和細(xì)胞對(duì)Cu的代謝功能展開(kāi)討論。

1.1 機(jī)體內(nèi)銅代謝

食物來(lái)源的Cu主要通過(guò)小腸和十二指腸吸收,小腸上皮細(xì)胞頂端的銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(CTR1)調(diào)控Cu吸收[8]。Cu被胃腸道吸收后,被分泌到血液中,并與可溶性白蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、組氨酸和巨球蛋白等結(jié)合成復(fù)合體,而后流經(jīng)肝臟后通過(guò)CTR1被肝臟吸收[7]。在肝細(xì)胞質(zhì)中,Cu可以被螯合到其它蛋白質(zhì)中發(fā)揮酶活性,或經(jīng)金屬硫蛋白螯合后儲(chǔ)存于肝細(xì)胞內(nèi)[9]。銅ATP酶是一種離子泵,可以將肝臟內(nèi)的Cu重新釋放到血液中,繼而結(jié)合伴侶蛋白或到達(dá)其它組織器官而發(fā)揮后續(xù)生理功能,包括線(xiàn)粒體能量、酪氨酸和神經(jīng)遞質(zhì)代謝,氧化還原穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞外基質(zhì)重塑[10]。

Cu進(jìn)入機(jī)體后首先在肝臟內(nèi)儲(chǔ)存,過(guò)量的銅經(jīng)膽汁途徑最終通過(guò)糞便排出體外[11]。尿液、汗液和月經(jīng)等其它途徑能代謝少量銅。總之,機(jī)體內(nèi)Cu主要通過(guò)十二指腸吸收,并通過(guò)膽汁排泄。當(dāng)機(jī)體攝入Cu增加時(shí),Cu吸收就會(huì)相應(yīng)減少,而排泄增多;相反,當(dāng)機(jī)體攝入Cu減少時(shí),通過(guò)膽汁排泄Cu減少,銅Cu吸收增加,以此維持機(jī)體銅穩(wěn)態(tài)[12]。

1.2 細(xì)胞內(nèi)銅代謝的調(diào)控機(jī)制

為維持細(xì)胞水平上Cu穩(wěn)態(tài),細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的Cu調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與其中,包括銅酶、銅伴侶蛋白和細(xì)胞膜銅運(yùn)輸載體和通道。這些機(jī)制協(xié)同工作,共同調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Cu的攝取、排出和細(xì)胞內(nèi)利用,以維持細(xì)胞內(nèi)Cu濃度在安全的生理水平。細(xì)胞通過(guò)表面表達(dá)銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(CTR1)攝取Cu進(jìn)入細(xì)胞[13]。體外研究表明CTR1的表達(dá)受Cu濃度調(diào)控,當(dāng)細(xì)胞外Cu濃度過(guò)量時(shí),CTR1表達(dá)下降;相反,細(xì)胞外Cu濃度下降時(shí),CTR1表達(dá)上調(diào)[14]。

在細(xì)胞質(zhì)內(nèi),Cu的運(yùn)輸由高親和力銅伴侶蛋白酶精細(xì)調(diào)控。銅伴侶蛋白ATOX1負(fù)責(zé)將Cu轉(zhuǎn)運(yùn)給高爾基體外側(cè)網(wǎng)絡(luò)的ATP7A和ATP7B蛋白,進(jìn)行賴(lài)氨酰氧化酶、酪氨酸酶和銅藍(lán)蛋白等銅酶的合成[15]。在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中,ATOX1作為銅依賴(lài)性轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)因子,有助于細(xì)胞增殖[16]。Cu可以通過(guò)調(diào)節(jié)SOD1的表達(dá)而維持線(xiàn)粒體過(guò)氧化穩(wěn)態(tài)。除此之外,細(xì)胞色素氧化酶(COX)利用銅進(jìn)行氧化磷酸化和穩(wěn)定線(xiàn)粒體功能[17]。銅ATP酶ATP7A/B是細(xì)胞內(nèi)銅運(yùn)輸?shù)闹匾d體。在生理?xiàng)l件下,ATP7A/B表達(dá)于反式高爾基復(fù)合體內(nèi),負(fù)責(zé)將胞漿中的Cu轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體管腔內(nèi)。而當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Cu濃度升高時(shí),ATP7A/B能夠轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜囊泡上,負(fù)責(zé)將Cu轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞[18]。

1.3 銅死亡機(jī)制研究

關(guān)于銅代謝與細(xì)胞程序性死亡的研究由來(lái)已久。1980年以來(lái),研究表明Cu與細(xì)胞程序性死亡有關(guān),但是具體機(jī)制未闡明[19]。銅離子載體是一種可逆性結(jié)合銅離子的脂溶性分子,在細(xì)胞銅死亡中發(fā)揮重要作用。銅離子載體可以運(yùn)輸銅離子穿過(guò)細(xì)胞的質(zhì)膜或線(xiàn)粒體膜結(jié)構(gòu)[20]。因此,細(xì)胞膜或線(xiàn)粒體膜表面銅離子載體表達(dá)異常會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)銅濃度異常而誘導(dǎo)細(xì)胞銅死亡。

線(xiàn)粒體發(fā)生氧化還原反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的ROS與線(xiàn)粒體代謝和Cu誘導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡密切相關(guān)[21]。伊利司莫(ES)是公認(rèn)的銅死亡誘導(dǎo)劑,有研究觀(guān)察到ES誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡中線(xiàn)粒體功能紊亂,ROS水平顯著升高。ES轉(zhuǎn)運(yùn)黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)Cu并導(dǎo)致線(xiàn)粒體相關(guān)蛋白水平降低,從而導(dǎo)致ROS升高而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。銅離子通過(guò)ES轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入K562細(xì)胞后,能夠氧化抗壞血酸并與H2O2反應(yīng)產(chǎn)生更具破壞性的ROS,誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡[22]。由此可見(jiàn),線(xiàn)粒體功能紊亂產(chǎn)生過(guò)量ROS,也是細(xì)胞發(fā)生銅死亡的重要機(jī)制。

Cu可以直接與NPL4相互作用后抑制p97蛋白泛素化蛋白降解,引起p97蛋白聚集或與其直接結(jié)合并抑制其構(gòu)象轉(zhuǎn)變,最終導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡[23]。過(guò)去研究都將Cu相關(guān)的程序性死亡過(guò)程認(rèn)為是細(xì)胞凋亡、自噬和鐵死亡的中間過(guò)程,并通過(guò)細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)、免疫印跡實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光等實(shí)驗(yàn)加以證明。直到2022年3月,TSVETKOV等發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡、壞死、ROS誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡或鐵死亡的抑制劑都不能逆轉(zhuǎn)Cu誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡,而只有銅螯合劑能實(shí)現(xiàn)這一目的,同時(shí)胱天蛋白酶-3(Caspase3)的活性沒(méi)有變化[1]。目前針對(duì)銅死亡的研究及其與疾病發(fā)生的關(guān)系將逐漸成為研究熱點(diǎn)。

2 肝臟疾病與銅死亡

無(wú)論Cu缺乏還是過(guò)量富集都會(huì)對(duì)機(jī)體帶來(lái)危害[24]。研究表明,門(mén)克斯病(Menkes)、威爾遜病(Wilson)、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病和腫瘤與銅死亡通路密切相關(guān)[25]。肝臟是人體腹腔內(nèi)最大的消化器官,承載著機(jī)體消化、代謝、解毒和免疫等重要生理功能。肝臟也是銅吸收和代謝的重要器官,了解銅死亡與肝臟疾病的關(guān)系對(duì)于闡明銅死亡的機(jī)制和肝病的治療非常重要。

2.1 肝癌與銅死亡

肝癌的發(fā)生率和死亡率非常高。鐵死亡誘導(dǎo)劑索拉非尼和埃拉斯汀可以通過(guò)增加銅依賴(lài)性硫?；鞍拙奂鸶伟┘?xì)胞發(fā)生銅死亡[26]。索拉非尼和埃拉斯汀通過(guò)抑制線(xiàn)粒體基質(zhì)相關(guān)蛋白酶介導(dǎo)的鐵氧還蛋白-1(FDX1)上調(diào)蛋白脂質(zhì)化降解,并通過(guò)抑制胱氨酸減少細(xì)胞內(nèi)銅螯合劑谷胱甘肽(GSH)的合成[27]。鐵氧還原蛋白1(FDX1)是最重要的銅死亡調(diào)節(jié)因子。肝癌患者FDX1的表達(dá)顯著下調(diào),同時(shí)FDX1高表達(dá)與肝癌患者的生存率明顯正相關(guān)[28]。臨床回顧性分析顯示,銅死亡相關(guān)基因的表達(dá)與患者PD-1/PD-L1免疫檢查點(diǎn)分子的表達(dá)水平和患者愈后明顯正相關(guān)。說(shuō)明銅死亡基因的表達(dá)可以作為肝癌免疫治療評(píng)價(jià)的生物標(biāo)志物[29]。

2.2 肝豆?fàn)詈俗冃?Wilson)與銅死亡

肝豆?fàn)詈俗冃杂蒞ilson在1912年首先描述,故又稱(chēng)為Wilson病(WD)。WD是一種常染色體隱性遺傳的銅代謝障礙性疾病,以銅代謝障礙引起的肝硬化、基底節(jié)損害為主要臨床特征[30]。ATP7B基因突變導(dǎo)致的銅代謝異常是Wilson病重要發(fā)病機(jī)制。健康者肝內(nèi)Cu濃度通常低于55 μg/g組織干重;而Wilson病患者肝內(nèi)Cu濃度高于55 μg/g組織干重[31]。Cu中毒引起的DNA損傷、肝內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化和線(xiàn)粒體功能障礙是Wilson病的主要致病機(jī)制[32]。線(xiàn)粒體間質(zhì)變寬、內(nèi)膜和外膜分離并擴(kuò)大、出現(xiàn)大液泡等肝臟形態(tài)學(xué)變化通常發(fā)生在WD早期階段,是WD肝損傷的形態(tài)學(xué)標(biāo)志[31]。WD患者的肝臟癥狀為急性肝功能衰竭、血清轉(zhuǎn)氨酶水平持續(xù)升高、黃疸和慢性肝炎。然而,有些患者沒(méi)有表現(xiàn)出這些肝臟變化,而是出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。肝臟Cu過(guò)量積聚可能導(dǎo)致肝硬化的發(fā)生[33]。

2.3 非酒精性脂肪性肝病與銅死亡

非酒精性脂肪肝(NAFLD)是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的肝臟疾病,發(fā)病機(jī)制仍未闡明。銅死亡作為一種新型細(xì)胞程序性死亡模式,與NAFLD之間的關(guān)系有待研究。鐵氧化還原蛋白-1(FDX1)、硫酰基合酶(LIAS)、脂肪酰轉(zhuǎn)移酶-1(LIPT1)、二氫硫辛酰胺脫氫酶(DLD)、S-乙酰轉(zhuǎn)移酶二氫硫酰胺(DLAT)、丙酮酸脫氫酶E-1α(PDHA1)和丙酮酸脫氫酶E-1β(PDHB)是銅死亡相關(guān)基因。臨床回顧性分析和NAFLD小鼠模型顯示,DLD和PDHB兩種基因在NAFLD肝臟病變中顯著升高。DLD和PDHB可以作為NAFLD診斷和治療的生物標(biāo)志物[34]。血清銅濃度與體重指數(shù)(BMI)、瘦素和胰島素抵抗水平等NAFLD的危險(xiǎn)因素明顯正相關(guān)[35]。肝細(xì)胞特異性敲除ATP7基因后,小鼠肝臟銅濃度顯著升高,同時(shí)導(dǎo)致小鼠肥胖和肝脂肪變性[36]。

2.4 病毒性肝炎與銅死亡

病毒性肝炎是由多種肝炎病毒引起的以肝臟病變?yōu)橹鞯囊环N傳染病。中國(guó)以乙型肝炎病毒(HBV)感染居多,而西方國(guó)家以丙型肝炎(HCV)感染為主。病毒性肝炎如果不加以干預(yù)會(huì)發(fā)展成為肝硬化甚至肝癌[37]。已有研究表明,鐵死亡在病毒性肝炎發(fā)展為肝纖維化過(guò)程中發(fā)揮重要功能。乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)通過(guò)抑制鐵死亡過(guò)程而減少HSC細(xì)胞死亡[38]。新型冠狀病毒(COVID-19)與銅死亡的研究顯示:新冠肺炎患者外周血淋巴細(xì)胞中銅濃度遠(yuǎn)高于健康對(duì)照組,新冠肺炎患者體內(nèi)PDHA1和PDHB兩種重要的銅死亡基因顯著上調(diào)[39]。由此可見(jiàn),雖然目前還沒(méi)有關(guān)于病毒性肝炎與銅死亡的相關(guān)研究,但是未來(lái)基于細(xì)胞銅死亡通路研究HBV或HCV的致病機(jī)制及其干預(yù)手段具有一定空間。

3 總結(jié)與展望

Cu是人體必須的微量元素,然而Cu過(guò)量又能導(dǎo)致機(jī)體嚴(yán)重的損傷。銅死亡是最新被發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞死亡方式,主要受細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體脂酰化酶調(diào)節(jié)。與細(xì)胞鐵死亡相似,線(xiàn)粒體ROS和GPX4可以調(diào)節(jié)細(xì)胞銅死亡過(guò)程[40]。然而,銅死亡過(guò)程未發(fā)生線(xiàn)粒體收縮、膜密度增加等形態(tài)學(xué)變化。鑒于銅死亡過(guò)程能夠影響細(xì)胞鐵代謝,未來(lái)研究需要關(guān)注銅死亡過(guò)程中細(xì)胞或線(xiàn)粒體的特異性形態(tài)學(xué)改變,以便于理解兩種細(xì)胞死亡方式的區(qū)別和聯(lián)系。

門(mén)克斯病、威爾遜病、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病和腫瘤與銅死亡通路密切相關(guān)[25]。肝臟銅吸收和代謝的重要器官,了解銅死亡與肝臟疾病的關(guān)系對(duì)于闡明銅死亡的機(jī)制和肝病的干預(yù)非常重要。目前銅死亡在肝癌和威爾遜病領(lǐng)域的研究較多,包括機(jī)制研究和臨床回顧性分析。DLD和PDHB兩種銅死亡相關(guān)基因在NAFLD肝臟病變中顯著升高。病毒性肝炎,尤其是乙型肝炎在中國(guó)發(fā)病率非常高,肝纖維化是肝炎病毒感染后期最典型的終末期肝病,至今沒(méi)有有效治療手段。未來(lái)病毒性肝炎和肝纖維化中銅死亡的機(jī)制研究將成為熱點(diǎn),并可能對(duì)此研發(fā)出新的診斷和治療方法。