游國慶 劉文果 馮鑫 余敏 石林 胡彥

耐藥結(jié)核病仍然是全球重大的公共衛(wèi)生問題,是結(jié)核病控制面臨的重大挑戰(zhàn)。2021年估算全球新發(fā)耐多藥/利福平耐藥結(jié)核病(multidrug-/rifampicin-resistant tuberculosis,MDR/RR-TB)患者45萬例,MDR/RR-TB治療成功率僅60%[1]。氟喹諾酮類藥物(fluoroquinolones,FQs)是治療MDR-TB的核心藥物[2],若FQs耐藥,就會成為準(zhǔn)廣泛耐藥結(jié)核病(pre-extensive drug resistant tuberculosis,pre-XDR-TB),甚至廣泛耐藥結(jié)核病(extensive drug-resistant tuberculosis,XDR-TB)[3],讓治療陷入窘境。不幸的是,多年以來,FQs作為一種廣譜抗生素,在我國被廣泛用于治療未確診的呼吸道及其他感染,濫用及過度使用現(xiàn)象嚴(yán)重,耐藥率高[4-5]。重慶是中國西部唯一的直轄市,地區(qū)間發(fā)展不平衡,是結(jié)核病和耐藥結(jié)核病的高發(fā)區(qū),據(jù)報道,MDR-TB發(fā)生率為23.7%[6]。目前,重慶地區(qū)MDR-TB患者中FQs耐藥情況如何尚不明確,為此,筆者分析2020—2022年重慶市耐多藥結(jié)核病患者FQs耐藥情況,以期為探討廣泛開展FQs耐藥性檢測的必要性,以及為MDR-TB治療方案的選擇提供依據(jù)。

材料和方法

1.菌株來源:菌株來自于2020年1月至2022年12月重慶市39個區(qū)(縣)結(jié)核病防治機(jī)構(gòu)分枝桿菌培養(yǎng)陽性臨床分離株,共計2067株(均通過分子檢測為利福平耐藥);菌株送至重慶市結(jié)核病防治所進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)(簡稱“藥敏試驗(yàn)”),經(jīng)菌種鑒定和比例法藥敏試驗(yàn)確定為耐多藥結(jié)核分枝桿菌(MDR-MTB)1701株(82.3%)。

2.樣本量估算:參照文獻(xiàn)[6],估計MDR-TB分離株的FQs耐藥率為40.0%,允許誤差為8.0%,可信度按95%計算,則Uα=1.96。根據(jù)以上參數(shù),通過公式[1.962×0.4×(1-0.4)/0.082]計算,估計本次調(diào)查所需樣本量為144株,考慮15.0%丟失率,最終準(zhǔn)備納入169 株 MDR-MTB。

采用簡單隨機(jī)抽樣的方法:首先確定抽樣間距,用實(shí)際保存菌株數(shù)(1701株)除以抽樣菌株數(shù)(169株),確定抽樣間距為10。在編號為前10株的樣本中隨機(jī)確定第1株菌株,以此序號為起始向下計數(shù),每數(shù)到1個抽樣間距即抽取1株菌,直到抽滿169株。從“中國疾病預(yù)防控制信息系統(tǒng)”的子系統(tǒng)“結(jié)核病管理信息系統(tǒng)”中搜集患者信息,4例患者信息不全,最終納入165株進(jìn)行分析。本研究得到重慶市結(jié)核病防治所倫理委員會批準(zhǔn)(編號:KY202203)。

3.主要儀器及試劑:微量肉湯稀釋法藥敏試劑盒(定制)、比例法藥敏試驗(yàn)及菌種鑒定培養(yǎng)基(對硝基苯甲酸培養(yǎng)基和噻吩-2-羧酸肼培養(yǎng)基)均購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司;細(xì)菌超聲分散計數(shù)儀購自體必康生物科技(廣東)有限公司。

4.菌種鑒定及比例法藥敏試驗(yàn):具體操作參考文獻(xiàn)[7]。比例法藥敏試驗(yàn)共包括6種抗結(jié)核藥物:利福平(rifampicin,RFP)、異煙肼(isoniazid,INH)、鏈霉素(streptomycin,Sm)、乙胺丁醇(ethambutol,EMB)、對氨基水楊酸(p-aminosalicylic acid,PAS)和阿米卡星(amikacin,Am)。同時對RFP和INH耐藥者為MDR-MTB。

5.微量肉湯稀釋法藥敏試驗(yàn):藥物種類包括氧氟沙星(ofloxacin,Ofx)、左氧氟沙星(levofloxacin,Lfx)和莫西沙星(moxifloxacin,Mfx)。使用7H9液體培養(yǎng)基,藥物濃度梯度設(shè)置為:0.03、0.06、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 μg/ml。刮取中性羅氏培養(yǎng)基上生長良好的新鮮菌落進(jìn)行磨菌、比濁,制備成1 mg/ml(1.0 麥?zhǔn)蠞岫?的菌懸液,100倍稀釋后接種到不同藥物濃度梯度的7H9培養(yǎng)基上,37 ℃孵育7 d后判讀結(jié)果,肉眼觀察無菌落生長者為其最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC),如果該濃度大于相應(yīng)的耐藥臨界濃度則判讀為耐藥。Ofx、Lfx和Mfx耐藥臨界濃度分別為2.0 μg/ml、1.0 μg/ml和1.0 μg/ml[6,8],對以上任一種FQs耐藥即為FQs耐藥。如對照孔生長較少,則繼續(xù)培養(yǎng)并每天觀察,至14 d。每批試驗(yàn)以MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv(ATCC27294)為敏感參考菌株進(jìn)行質(zhì)控。所有菌株均重復(fù)測試3次,以至少2次結(jié)果一致者或取中間濃度為最終MIC值。該方法已通過中國疾病預(yù)防控制中心國家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室藥敏試驗(yàn)熟練度測試。

結(jié) 果

1.患者情況:165株MDR-MTB分離株中,131株(79.4%)分離自男性患者,34株(20.6%)分離自女性患者。97株(58.8%)分離自初治患者,68株(41.2%)分離自復(fù)治患者?；颊吣挲g范圍為17～82歲,平均年齡為(52.2±16.4)歲。

2.FQs耐藥情況:菌株對FQs總耐藥率為37.6%(62/165),凡耐Lfx、Mfx者均耐Ofx。Ofx、Lfx、Mfx的耐藥率分別為37.6%(62/165)、37.0%(61/165)及29.7%(49/165),差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=2.798,P=0.247),見表1。

表1 165株耐多藥結(jié)核分枝桿菌菌株氟喹諾酮類藥物最低抑菌濃度分布及耐藥情況

3.FQs耐藥影響因素分析:單因素分析顯示,職業(yè)、FQs用藥史及Sm耐藥為MDR-TB患者FQs耐藥的影響因素。另外,復(fù)治患者FQs耐藥比例為45.2%,初治患者為54.8%,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.639,P=0.424),見表2。

表2 2020—2022年重慶市耐多藥結(jié)核病患者氟喹諾酮類藥物耐藥影響因素的單因素分析

將職業(yè)、FQs用藥史及Sm耐藥情況進(jìn)一步納入多因素logistic回歸模型進(jìn)行分析,賦值見表3。結(jié)果顯示,有FQs用藥史、發(fā)生Sm耐藥,以及從事民工職業(yè),是MDR-TB患者發(fā)生FQs耐藥的危險因素,見表4。

表3 多因素logistic回歸分析變量賦值情況

表4 耐多藥結(jié)核病患者發(fā)生氟喹諾酮類藥物耐藥影響因素的多因素logistic回歸分析

討 論

評估某種藥品在治療方案中能否有效,需要綜合多方面因素考量,包括患者個體藥敏試驗(yàn)結(jié)果、患者是否對存在交叉耐藥的藥物有耐藥性、患者所在地區(qū)藥物耐藥水平,以及在患者既往治療失敗的方案中是否包含這一藥品等[2]。世界衛(wèi)生組織在大量試驗(yàn)和觀察證據(jù)的基礎(chǔ)上先后于2018年、2020年將FQs中的Lfx和Mfx作為A組核心藥物納入MDR/RR-TB患者長程和短程治療方案[9-10];同時,Lfx和Mfx也是我國MDR/RR-TB患者長程和短程方案的首要核心藥物[2]。因此,Lfx和Mfx耐藥與否及重慶地區(qū)耐藥水平對重慶地區(qū)MDR-TB患者治療方案的選擇極為重要。

本研究顯示,2020—2022年重慶地區(qū)MDR-TB患者FQs耐藥率達(dá)37.6%(Ofx、Lfx和Mfx耐藥率分別為37.6%、37.0%和29.7%),與2015—2019年西安市MDR-TB患者對Lfx(40.1%)及Mfx(31.3%)的耐藥率近似[11],高于深圳市2013—2017年的28.57%[12],低于北京市2015—2020年的43.62%[13]和安徽省2019—2021年的45.2%[14]。各地報道結(jié)果略有不同,可能與各地標(biāo)本來源(結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院、綜合醫(yī)院和疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)等)、患者用藥史、患者規(guī)范用藥情況及耐藥臨界值的不同有關(guān)。重慶地區(qū)2020—2022年與2015—2016年間相比,MDR-TB患者FQs耐藥率有所降低,從42.3%[6]降至37.6%,與北京市和西安市呈下降的趨勢類似[11,13],可能與各地醫(yī)療保險政策的廣泛推廣、二線抗結(jié)核藥物藥敏試驗(yàn)等醫(yī)療資源投入增加及FQs使用日趨規(guī)范等有關(guān)[11,13]。也有報道我國在過去10年中,結(jié)核病患者FQs耐藥情況增加[15],可能是因?yàn)榻陙鞦Qs在臨床上作為廣譜抗生素被廣泛應(yīng)用于抗感染治療及經(jīng)驗(yàn)性用藥,且部分FQs在各大藥房可自行購買,不規(guī)范使用,增加了其耐藥性有關(guān),也可能與畜牧及食品等行業(yè)抗生素的廣泛應(yīng)用有關(guān),應(yīng)引起重視[5,15-16]。

本研究顯示,相比于家務(wù)及待業(yè)者,民工群體中的MDR-TB患者更易發(fā)生FQs耐藥,但因本研究中民工患者數(shù)量較少,該結(jié)論有待進(jìn)一步證實(shí)。本研究發(fā)現(xiàn),有FQs用藥史的MDR-TB患者發(fā)生FQs耐藥的風(fēng)險更高,這可能與目前FQs濫用,繼而引起的獲得性耐藥有關(guān)[13]。在FQs耐藥和敏感患者中,Sm耐藥比例分別為79.0%和59.2%,且分析顯示,Sm耐藥患者發(fā)生FQs耐藥的風(fēng)險更高,此結(jié)果有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步證實(shí)。

報道顯示,復(fù)治患者FQs耐藥比例高于初治患者。究其原因,一是復(fù)治患者治療依從性較差,會導(dǎo)致MTB發(fā)生基因多態(tài)性改變而產(chǎn)生耐藥;二是治療失敗的復(fù)治患者,所需用藥時間較長,發(fā)生FQs耐藥的風(fēng)險也會增加;三是復(fù)治患者在反復(fù)治療過程中,隨著就醫(yī)次數(shù)增加,可能增加交叉感染的機(jī)會[13]。本研究中,復(fù)治患者FQs耐藥比例與初治患者相比未見明顯差異,與以上報道不完全一致。這從另一個角度說明了重慶地區(qū)初治患者中FQs原發(fā)耐藥率不低,這種FQs原發(fā)耐藥可能是由于FQs耐藥株在人群中的傳播引起的[17],所以FQs濫用現(xiàn)象不容忽視。

綜上所述,重慶地區(qū)MDR-TB患者中FQs耐藥情況應(yīng)引起重視,在臨床治療中,應(yīng)嚴(yán)格規(guī)范使用FQs。此外,對于利福平耐藥的肺結(jié)核患者,應(yīng)常規(guī)開展FQs的藥敏試驗(yàn)以盡早明確其是否為Pre-XDR-TB,為后續(xù)正確選擇治療方案提供依據(jù)。同時,應(yīng)加強(qiáng)對FQs藥物等抗生素使用的宣傳教育,提高公眾對濫用抗生素所致危害的認(rèn)識。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)游國慶:分析/解釋數(shù)據(jù)、起草文章;劉文果:實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)、獲取研究經(jīng)費(fèi);馮鑫:統(tǒng)計分析、獲取研究經(jīng)費(fèi);余敏:實(shí)施研究、起草文章;石林:采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù);胡彥:醞釀和設(shè)計實(shí)驗(yàn)、分析/解釋數(shù)據(jù)、對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱、指導(dǎo)