李輝，馬輝，溫佳穎，唐宇星，黃志廣△

1 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院結(jié)直腸肛門外科 廣西南寧 530021

2 廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院放療科 廣西南寧 530007

3 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科 廣西南寧 530021

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是消化系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[1-2]。研究顯示CRC 的發(fā)病主要與年齡、環(huán)境以及家族遺傳這三個(gè)因素有關(guān)[3-4]。由于缺乏早期特征性癥狀以及腸鏡檢查依從性低，多數(shù)CRC 首診時(shí)即為中晚期。目前CRC 的標(biāo)準(zhǔn)治療方法包括手術(shù)治療、化療和放療。然而，近年來(lái)免疫治療在多種癌癥的治療中取得了較為理想的療效，特別是對(duì)于非小細(xì)胞肺癌和惡性黑色素瘤等[5-8]。在CRC 中，免疫檢查點(diǎn)阻斷僅對(duì)具有微衛(wèi)星不穩(wěn)定型的亞群有效，而占比約90%的微衛(wèi)星穩(wěn)定（microsatellite stability，MSS）型CRC 對(duì)免疫治療應(yīng)答率較低[9-10]。如果能找到一種新的標(biāo)志物或免疫治療的新通路，將為CRC 提供一種新的治療策略[11]，這對(duì)于CRC 的早診早治和靶向治療、免疫治療具有重要意義。

含V-set免疫球蛋白域蛋白4（V-set and immunoglobulin domain-containing protein 4，VSIG4）是免疫球蛋白超家族中的一員。在腫瘤患者中，VSIG4的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了U87-MG 膠質(zhì)母細(xì)胞的上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、侵襲和遷移，可與Rab18 相互作用影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的敏感性[12-13]。VSIG4還被證實(shí)是晚期胃癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素[14]。VSIG4作為C3b/iC3b 的補(bǔ)體受體，還可以參與調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫微環(huán)境[15]，通過(guò)作用于巨噬細(xì)胞的補(bǔ)體，調(diào)節(jié)多種免疫反應(yīng)從而參與癌癥的發(fā)生發(fā)展[16]。雖然目前已有文獻(xiàn)報(bào)道VSIG4在CRC 中表達(dá)下調(diào)，但其在CRC的發(fā)生發(fā)展及患者預(yù)后中發(fā)揮的作用尚不明確[17]。

本研究對(duì)來(lái)源于多個(gè)公共數(shù)據(jù)庫(kù)中VSIG4的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總分析，通過(guò)GO、KEEG 和GSEA（gene set enrichment analysis）富集分析進(jìn)一步探索VSIG4的生物學(xué)作用和參與的信號(hào)通路，利用CIBERSORT算法分析VSIG4與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系，并進(jìn)一步探討VSIG4的表達(dá)對(duì)CRC患者預(yù)后的影響。

1 資料與方法

1.1 獲取和處理CRC mRNA數(shù)據(jù)集

本研究由兩名研究者對(duì)UCSC XENA、GTEx、GEO 和TCGA 等數(shù)據(jù)庫(kù)中的CRC mRNA 數(shù)據(jù)集進(jìn)行檢索和篩選。GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索詞包括colorectal、colon、 rectum、 mRNA、 messenger RNA、 cancer、tumor、carcinoma。TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)的CRC mRNA 數(shù)據(jù)集和GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)的正常結(jié)直腸組織樣本mRNA數(shù)據(jù)集均從UCSC XENA 數(shù)據(jù)庫(kù)中直接獲得。本研究在UCSC XENA 數(shù)據(jù)庫(kù)中直接選擇TCGA Colon and Rectal Cancer（COADREAD）和GTEx 記錄進(jìn)行對(duì)應(yīng)表達(dá)矩陣的下載。所有納入的數(shù)據(jù)均符合以下標(biāo)準(zhǔn)：（1）物種為智人；（2）樣本類型為組織；（3）每組樣本數(shù)量不低于3例。隨后對(duì)納入的mRNA數(shù)據(jù)集進(jìn)行l(wèi)og2標(biāo)準(zhǔn)化。R 軟件（4.0.5 版）的SVA 包（3.36.0 版）用于合并相同平臺(tái)的mRNA 數(shù)據(jù)集并去除批次效應(yīng)。本研究所有數(shù)據(jù)的檢索工作均截止于2022年12月。

1.2 分析VSIG4在CRC中的表達(dá)

GraphPad Prism 軟件（8.0.2 版）和R 軟件的Ggplot2 包（3.3.5 版）用于繪制箱型圖和受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線以研究VSIG4的表達(dá)情況及其區(qū)分CRC 樣本和非癌對(duì)照組樣本的檢驗(yàn)效能。隨后本研究通過(guò)Stata 軟件（16.0 版） 計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)化均數(shù)差（standardized mean difference，SMD） 和生成集成受試者工作特征（summary receiver operating characteristic，SROC）曲線以整合分析所有納入的數(shù)據(jù)。敏感性分析和Egger’s 檢驗(yàn)分別用于檢驗(yàn)納入mRNA 數(shù)據(jù)集的異質(zhì)性和發(fā)表偏移。

1.3 獲取VSIG4的正相關(guān)基因

Pearson 相關(guān)性分析由R 軟件的“Cor.test”函數(shù)執(zhí)行，篩選標(biāo)準(zhǔn)：Person’sr＞0.5 和P＜0.05。隨后對(duì)篩選出的基因取交集，在所有mRNA 數(shù)據(jù)集中出現(xiàn)8次及以上的基因被認(rèn)為是VSIG4的正相關(guān)基因。

1.4 探索VSIG4的生物學(xué)功能及信號(hào)通路

利用R 軟件的Org.Hs.eg.db 包（3.1.0 版）進(jìn)行基因的GO 注釋，并從KEGG rest API （https://www.kegg.jp/kegg/rest/keggapi.html） 獲取最新的“KEGG pathway”基因注釋，以此作為背景將VSIG4及其正相關(guān)基因映射到背景集合中。R軟件的ClusterProfiler包（3.14.3 版）用于執(zhí)行富集分析，并可視化GO 分析中P值最小的前10個(gè)GO術(shù)語(yǔ)。本研究依據(jù)VSIG4mRNA表達(dá)值將TCGA mRNA數(shù)據(jù)集的CRC樣本分為高VSIG4mRNA表達(dá)組（VSIG4mRNA表達(dá)值≥表達(dá)值中位數(shù)） 和低VSIG4mRNA 表達(dá)組（VSIG4mRNA表達(dá)值＜表達(dá)值中位數(shù)），隨后通過(guò)GSEA軟件（3.0版）和h.all.v7.4.symbols.gmt 子集合進(jìn)行GSEA分析。P＜0.05 和錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.25的術(shù)語(yǔ)被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 探索VSIG4與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系

為進(jìn)一步探索VSIG4與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系，本研究使用R 軟件的IOBR 包（0.99.9 版） 中的CIBERSORT 算法對(duì)TCGA mRNA 數(shù)據(jù)集的每個(gè)CRC樣本相關(guān)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)進(jìn)行評(píng)分。分組依據(jù)同1.4，使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行秩和檢驗(yàn)比較兩組間免疫浸潤(rùn)評(píng)分的差異，通過(guò)Ggplot2包進(jìn)行差異的可視化。

1.6 分析VSIG4對(duì)患者預(yù)后的影響

為評(píng)估VSIG4在CRC 患者中作為預(yù)后指標(biāo)的潛力，本研究在GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中重新檢索和篩選了包括總生存期（overall survival，OS）信息的CRC mRNA數(shù)據(jù)集，并納入了TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中包含OS 信息的CRC 樣本，要求納入的mRNA 數(shù)據(jù)集總患者數(shù)量不低于50例。上述檢索工作截止于2022年12月。

隨后，同樣以每個(gè)mRNA 數(shù)據(jù)集的VSIG4mRNA表達(dá)值中位數(shù)為截?cái)嘀颠M(jìn)行分組，利用R軟件的Survival包（3.2.13版）、Survminer包（0.4.9版）繪制Kaplan-Meier 曲線，進(jìn)行Cox 分析，并計(jì)算每個(gè)mRNA數(shù)據(jù)集的風(fēng)險(xiǎn)比（hazard ratio，HR）和95%置信區(qū)間（confidence interval，CI）。為綜合評(píng)估VSIG4對(duì)CRC患者預(yù)后的整體影響，本研究采用Stata軟件匯總分析所有納入mRNA數(shù)據(jù)集的HR和95%CI。

2 結(jié)果

2.1 VSIG4在CRC中表達(dá)下調(diào)

本研究從多個(gè)公共數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索并納入了2 265例CRC 樣本和1 259 例正常結(jié)直腸組織樣本（圖1）。納入mRNA數(shù)據(jù)集的基礎(chǔ)信息如表1所示。

表1 本研究納入的所有mRNA數(shù)據(jù)集特征信息

圖1 檢索符合納入標(biāo)準(zhǔn)的CRCmRNA數(shù)據(jù)集的過(guò)程

箱型圖提示在約50%的mRNA 數(shù)據(jù)集中，VSIG4在CRC 樣本中表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）（圖2）。在GSE126092、GSE20842 和GSE156355 數(shù)據(jù)集的ROC曲線中AUC＞0.8（P＜0.05）（圖3）?；? 524例樣本的mRNA 數(shù)據(jù)集匯總分析結(jié)果如圖4。分析結(jié)果提示VSIG4在CRC 中表達(dá)下調(diào)（SMD＝-0.60，95%CI為-0.86～-0.34；圖4A），所有納入本研究的數(shù)據(jù)集間無(wú)明顯異質(zhì)性及發(fā)表偏倚（圖4B、圖4C）。SROC曲線提示VSIG4具有良好的區(qū)分CRC 樣本和正常結(jié)直腸組織樣本的能力（AUC＝0.75，敏感度為0.65，特異度為0.79；圖5）。

圖2 CRC組和非癌對(duì)照組中VSIG4 mRNA的表達(dá)分析結(jié)果

圖3 CRC mRNA數(shù)據(jù)集的ROC曲線

圖4 所有樣本的mRNA數(shù)據(jù)集匯總分析結(jié)果

圖5 VSIG4表達(dá)情況的SROC曲線分析結(jié)果

2.2 VSIG4在CRC中的生物學(xué)功能及通路

對(duì)Pearson相關(guān)性分析結(jié)果進(jìn)行篩選并取交集后，總共有212個(gè)基因在所有mRNA數(shù)據(jù)集中出現(xiàn)8次及以上，這些基因被認(rèn)為是VSIG4的正相關(guān)基因。對(duì)這些基因進(jìn)行后續(xù)分析，GSEA富集分析結(jié)果如圖6所示，分析結(jié)果提示VSIG4的表達(dá)與MYC靶點(diǎn)V2（MYC targets V2）、氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）、MYC靶點(diǎn)V1（MYCtargets V1）、IL2/STAT5信號(hào)傳導(dǎo)（IL2 STAT5 signaling）、KRAS信號(hào)傳導(dǎo)上調(diào)（KRASsignaling up）和細(xì)胞凋亡（apoptosis）等腫瘤相關(guān)信號(hào)通路相關(guān)（圖6A、圖6B）。GO 功能富集分析顯示，VSIG4主要富集在細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix）、細(xì)胞表面（cell surface）、囊泡（vesicle） 和質(zhì)膜（plasma membrane part）等部位，參與調(diào)控免疫反應(yīng)（regulation of immune response）、防御反應(yīng)（defense response）和調(diào)控應(yīng)激反應(yīng)（regulation of response to stimulus）等生物過(guò)程，并影響信號(hào)受體結(jié)合（signaling receptor binding）、信號(hào)受體的活性（signaling receptor activity）和分子傳遞者的活性（molecular transducer activity）等（圖7）。KEGG富集分析結(jié)果如圖8所示，分析結(jié)果提示VSIG4參與許多重要的信號(hào)通路，包括補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)（complement and coagulation cascades）、金黃色葡萄球菌感染（staphylococcus aureus infection）、吞噬體（phagosome）、百日咳（pertussis）、成骨細(xì)胞分化（osteoclast differentiation）等（圖8A）。

圖6 VSIG4的GSEA富集分析結(jié)果

圖7 VSIG4及其正相關(guān)基因的GO富集分析結(jié)果

2.3 VSIG4的表達(dá)與TIME有關(guān)

CIBERSORT 分析的結(jié)果顯示，M0巨噬細(xì)胞（M0 macrophages）、M1巨噬細(xì)胞（M1 macrophages）、M2巨噬細(xì)胞（M2 macrophages）、靜息型肥大細(xì)胞（resting mast cells）和中性粒細(xì)胞（neutrophils）的浸潤(rùn)在VSIG4mRNA高表達(dá)組相對(duì)增多。VSIG4mRNA低表達(dá)組的初級(jí)B 細(xì)胞（naive B cells）、漿細(xì)胞（plasma cells）、CD4 靜息記憶T 細(xì)胞（CD4 resting memory T cells）、活化NK細(xì)胞（activated natural killer cells）、單核細(xì)胞（monocytes）、活化樹(shù)突狀細(xì)胞（activated dendritic cells）和活化肥大細(xì)胞（activated mast cells）的浸潤(rùn)程度高于VSIG4mRNA高表達(dá)組（圖8B）。

2.4 VSIG4的高表達(dá)提示CRC患者預(yù)后不良

為研究VSIG4的表達(dá)與CRC 患者預(yù)后的關(guān)系，本研究從GEO 和TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中重新收集了970 例CRC患者樣本的OS數(shù)據(jù)，結(jié)果如圖9所示。Kaplan-Meier 曲線可見(jiàn)（圖9A～圖9F），VSIG4mRNA 高表達(dá)組的CRC 患者相對(duì)于VSIG4mRNA 低表達(dá)組的CRC 患者有預(yù)后不良的趨勢(shì)，但預(yù)后差異并沒(méi)有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此，我們繼續(xù)對(duì)上述970例CRC患者Cox 分析的所有HR和95%CI進(jìn)行了匯總分析，結(jié)果顯示VSIG4的表達(dá)上調(diào)是CRC 患者的預(yù)后危險(xiǎn)因素（HR＝1.40，95%CI為1.09～1.78；圖9G）。

圖9 970例CRC患者OS的預(yù)后分析結(jié)果

3 討論

本研究基于公共數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)VSIG4在CRC 中低表達(dá)，并且能較好地區(qū)分CRC 和正常結(jié)直腸組織。MYC靶點(diǎn)V2、氧化磷酸化、MYC靶點(diǎn)V1、IL2/STAT5信號(hào)傳導(dǎo)、KRAS信號(hào)傳導(dǎo)上調(diào)和細(xì)胞凋亡等腫瘤相關(guān)信號(hào)通路可能是誘發(fā)CRC 發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。在所有的CRC 患者中，進(jìn)一步探索VSIG4與患者預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)VSIG4低表達(dá)的患者預(yù)后更優(yōu)，這可能與腫瘤的免疫微環(huán)境密切相關(guān)。

VSIG4在多種癌癥中異常表達(dá)。Zhu 等[18]研究發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞癌中VSIG4的表達(dá)顯著下調(diào)，其表達(dá)水平與AFP 水平及腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，并與乙型肝炎病毒相關(guān)性肝癌患者的無(wú)病生存期有關(guān)。在卵巢癌中，VSIG4顯著過(guò)表達(dá)并影響卵巢癌的進(jìn)展和復(fù)發(fā)[19]。本研究首次通過(guò)公共數(shù)據(jù)庫(kù)大樣本量綜合評(píng)估了CRC 中VSIG4mRNA 表達(dá)情況，基于3 524 例樣本的匯總分析證實(shí)VSIG4在CRC 中表達(dá)下調(diào)（SMD＝-0.60；95%CI為-0.86～-0.34），SROC 曲線分析結(jié)果提示VSIG4可較好地區(qū)分CRC 樣本和正常結(jié)直腸組織樣本，有作為CRC 診斷標(biāo)志物的潛力。GSEA 分析發(fā)現(xiàn)VSIG4的表達(dá)與MYC靶點(diǎn)V2、氧化磷酸化、MYC靶點(diǎn)V1、IL2/STAT5信號(hào)傳導(dǎo)、KRAS信號(hào)傳導(dǎo)上調(diào)和細(xì)胞凋亡等腫瘤相關(guān)信號(hào)通路相關(guān)。MYC靶點(diǎn)V1、V2 信號(hào)通路可以調(diào)控MYC癌基因，MYC基因家族是人類癌癥中最常被激活的信號(hào)基因之一，其通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和免疫逃逸來(lái)維持癌癥發(fā)展。靶向MYC基因相關(guān)通路不僅可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增長(zhǎng)，還可以恢復(fù)機(jī)體的免疫監(jiān)測(cè)功能[20]。氧化磷酸化是為結(jié)直腸癌細(xì)胞提供能量的主要代謝途徑之一，在CRC 中經(jīng)常發(fā)生突變的癌基因和抑癌基因（如KRAS、BRAF和p53）已經(jīng)被證明可通過(guò)驅(qū)動(dòng)代謝底物的攝取和代謝來(lái)改變代謝通路[21]。細(xì)胞凋亡和增殖是腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的一對(duì)矛盾體，兩者間的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為密切相關(guān)。結(jié)直腸黏膜上皮細(xì)胞增殖和凋亡在正常生理狀況下處于相對(duì)平衡而不斷更新的狀態(tài)，以保證其結(jié)構(gòu)和功能的完整性。一旦這種平衡被打破，組織結(jié)構(gòu)就有受到破壞或腫瘤形成的可能。因此，細(xì)胞凋亡通路也是研究CRC 發(fā)生發(fā)展的重要因素。

基于CIBERSORT 算法的免疫浸潤(rùn)分析提示幼稚B 細(xì)胞、漿細(xì)胞、CD4 靜息記憶T 細(xì)胞、活化NK 細(xì)胞、單核細(xì)胞、活化樹(shù)突狀細(xì)胞和活化肥大細(xì)胞的浸潤(rùn)水平在VSIG4低表達(dá)組中相對(duì)增多。CD4 靜息記憶T細(xì)胞具有記憶性，可以在再次遇到抗原時(shí)迅速激活并協(xié)助抗腫瘤免疫反應(yīng)。NK細(xì)胞在抗腫瘤免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它們可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞，參與天然免疫反應(yīng)。樹(shù)突狀細(xì)胞在免疫反應(yīng)中具有重要地位，活化狀態(tài)的樹(shù)突狀細(xì)胞可以呈遞抗原并激活T細(xì)胞，從而啟動(dòng)抗腫瘤免疫反應(yīng)。然而，肥大細(xì)胞、單核細(xì)胞卻能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，研究證實(shí)在CRC 中，活化的黏膜肥大細(xì)胞產(chǎn)生的mMCP-1 通過(guò)調(diào)節(jié)CD11b+Gr1+細(xì)胞活性在結(jié)腸組織中的積累來(lái)抑制T細(xì)胞的活化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[22-23]。在乳腺癌中，腫瘤細(xì)胞分泌CSF1誘導(dǎo)單核細(xì)胞表達(dá)和釋放CXCL7，進(jìn)而介導(dǎo)FAK和MMP13信號(hào)通路促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲[24]。M0 巨噬細(xì)胞、M1 巨噬細(xì)胞、M2 巨噬細(xì)胞的免疫浸潤(rùn)水平則在VSIG4低表達(dá)組中相對(duì)減少。M1巨噬細(xì)胞通過(guò)直接介導(dǎo)細(xì)胞毒性和抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性發(fā)揮抗腫瘤作用[25-26]。研究證實(shí)，在結(jié)腸癌中，M1 巨噬細(xì)胞顯著增加了脂肪組織干細(xì)胞中腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞凋亡和減少M(fèi)2巨噬細(xì)胞群來(lái)抑制結(jié)腸癌的發(fā)展[27]。此外，也有研究證實(shí)，表達(dá)VSIG4的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞可作為抗腫瘤免疫的負(fù)細(xì)胞調(diào)節(jié)因子抑制腫瘤特異性CD8+T 細(xì)胞毒性[28]。因此，通過(guò)免疫藥物調(diào)控VSIG4相關(guān)的腫瘤免疫微環(huán)境有望成為CRC 免疫治療的新思路，但相關(guān)的機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

我們針對(duì)VSIG4表達(dá)與CRC 患者預(yù)后的關(guān)系的預(yù)后分析結(jié)果表明，VSIG4表達(dá)上調(diào)是CRC 患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。Xu 等[29]的研究顯示在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)VSIG4可以抑制免疫T淋巴細(xì)胞的活化，從而導(dǎo)致膠質(zhì)瘤的進(jìn)展和預(yù)后較差，相反的，VSIG4低表達(dá)組預(yù)后較好。同樣的，在肺癌中，發(fā)現(xiàn)VSIG4通過(guò)連接T 細(xì)胞上未知的受體，可抑制CD4+和CD8+T 細(xì)胞增殖以及細(xì)胞因子（IL-2和IFN-γ）的產(chǎn)生[30]。所以我們推測(cè)在VSIG4低表達(dá)組中，可能由于免疫浸潤(rùn)細(xì)胞的抗腫瘤作用大于促腫瘤發(fā)展的作用，從而使患者獲得較好的預(yù)后。

綜上所述，VSIG4在CRC 中表達(dá)下調(diào)并通過(guò)相應(yīng)的腫瘤信號(hào)通路參與CRC 的發(fā)生，其與腫瘤免疫微環(huán)境和預(yù)后的相關(guān)性為我們開(kāi)展進(jìn)一步研究提供了新的思路。然而，本研究仍具有一定的局限性，所有的結(jié)果都是基于公共數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)，在今后的研究中，我們將通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探索VSIG4在CRC中的作用機(jī)制。

利益沖突聲明全體作者均聲明不存在與本文相關(guān)的利益沖突。