楊上英，黃明翔，許德新，劉加夫，陳新富

(1.福建省福州肺科醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建 福州 350008；2.福建省福州肺科醫(yī)院胸外科，福建福州 350008；3.福建省福州肺科醫(yī)院病理科，福建 福州 350008；4.福建醫(yī)科大學(xué)臨床教學(xué)醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建 福州 350008)

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是臨床上肺癌最常見(jiàn)的病理類(lèi)型，約占85%左右。盡管手術(shù)是早期NSCLC 的首選治療方法，但是Ⅰ～ⅢA期患者5年生存率僅為14%～49%，ⅢB～Ⅳ期患者的生存率不到5%[1]。隨著免疫治療在晚期NSCLC治療中的應(yīng)用，腫瘤生存的微環(huán)境是目前研究的方向。微環(huán)境中的免疫細(xì)胞與NSCLC的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[2]，相關(guān)免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)程度對(duì)NSCLC患者的診治及預(yù)后評(píng)估價(jià)值顯著[3]。

DnaJ 熱休克蛋白家族(Hsp40)成員B4[DnaJ heat shock protein family (Hsp40) member B4，DNAJB4]是DNAJ/Hsp40 家族的成員，也稱(chēng)人肝臟DnaJ-like 蛋白(human liver DnaJ-like protein，HLJ1)，在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)折疊和活性方面起著重要作用。DNAJB4 是一種新發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制因子，與腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移有關(guān)。研究證實(shí)，DNAJB4在肝癌[4]、結(jié)腸癌[5]、乳腺癌[6]等多種腫瘤組織中低表達(dá)。然而DNAJB4 在NSCLC 發(fā)生發(fā)展中的作用以及潛在生物學(xué)機(jī)制尚不清楚，并且DNAJB4 與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)及患者預(yù)后的關(guān)系未見(jiàn)報(bào)道。人類(lèi)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的建立給NSCLC的發(fā)生、發(fā)展及潛在的分子機(jī)制研究指明了方向。本研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，qPCR)、免疫組織化學(xué)及多個(gè)生物學(xué)信息數(shù)據(jù)庫(kù)分析DNAJB4基因在NSCLC 中的表達(dá)及其與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和患者預(yù)后的關(guān)系，為NSCLC進(jìn)展機(jī)制、治療及預(yù)后的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 病例標(biāo)本本研究經(jīng)福建省福州肺科醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)后(2018-006-01)，收集2017年8月—2017年12月胸外科術(shù)前未接受放、化療及生物治療并經(jīng)手術(shù)切除的45例NSCLC患者，手術(shù)獲取腫瘤組織及癌旁正常肺組織標(biāo)本，分別進(jìn)行qPCR和免疫組織化學(xué)檢測(cè)。

1.1.2 主要試劑EASYspin 組織/細(xì)胞RNA 快速提取試劑盒、HiScript Q RT SuperMix for qPCR、ChamQ SYBR color qPCR Master Mix 均購(gòu)自Vazyme 公司。DAB 染色液試劑盒、山羊抗兔IgG 均購(gòu)自福州邁新生物科技開(kāi)發(fā)有限公司。兔抗DNAJB4 單克隆抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。本研究采用美國(guó)Applied Biosystems 9700 PCR System進(jìn)行qPCR反應(yīng)。

1.2 方 法

1.2.1 GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析基因表達(dá)譜交互分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA)(http://gepia.cancer-pku.cn)是用于癌癥和正?；虮磉_(dá)譜和交互式分析的數(shù)據(jù)庫(kù)，提供交互和自定義功能，包括差異表達(dá)分析、圖譜繪制、相關(guān)分析、相似基因檢測(cè)、降維分析等[7]。本研究運(yùn)用GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析NSCLC 患者癌組織和癌旁正常組織中DNAJB4基因的表達(dá)差異。

1.2.2 RNA 提取和qPCR 檢測(cè)根據(jù)EASYspin 組織/細(xì)胞RNA快速提取試劑盒操作說(shuō)明提取RNA。以提取的RNA 為模板，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA， 在實(shí)時(shí)定量PCR 儀上進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。DNAJB4 mRNA 的引物序列：正向5'-GACGAATGGG TGGTGGTAGAG-3'，反向5'-GGAGGATCTTGTTTGA GGCG-3'。內(nèi)參GAPDH 引物序列：正向5'-TGCACC ACCAACTGCTTAGC-3'，反向5'-GGCATGGACTGTG GTCATGAG-3'。PCR 反應(yīng)體系包括AceQ qPCR SYBR Green 混合物10 μL，PCR 上游引物(10 μmol/L) 0.5 μL，PCR 下游引物(10 μmol/L) 0.5 μL，Rox 參比染料Ⅱ(50×) 0.4 μL，cDNA 模板1.0 μL，ddH2O(滅菌蒸餾水)加至20 μL。反應(yīng)條件：94 ℃、30 s；94 ℃、5 s，60 ℃、34 s，40 個(gè)循環(huán)。采用SYBR 染料法測(cè)定DNAJB4的CT值，以GAPDH作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT計(jì)算癌組織及癌旁正常肺組織中DNAJB4 mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，并取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.3 免疫組化SP 兩步法檢測(cè)DNAJB4 蛋白的表達(dá)參照DAB染色液試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，切取4 μm的石蠟切片，60 ℃烤片2 h，二甲苯脫蠟和乙醇梯度水化后，用微波爐進(jìn)行抗原修復(fù)。PBS沖洗，3%過(guò)氧化氫溶液室溫孵育封閉10 min。PBS 沖洗，加入1∶50 稀釋的抗DNAJB4蛋白抗體100 μL，于4 ℃冰箱內(nèi)過(guò)夜孵育。PBS 沖洗，滴加二抗100 μL 室溫孵育30 min。PBS 沖洗，DAB 顯色5 min。自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染10～30 s，PBS 沖洗返藍(lán)。乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片。顯微鏡下閱片，拍照。

1.2.4 染色結(jié)果判定采用雙人盲法閱片，即由2位資深病理醫(yī)師，均在不知具體臨床資料的前提下，獨(dú)自判斷所得。在400 倍顯微鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200 個(gè)腫瘤細(xì)胞，記錄陽(yáng)性細(xì)胞百分比，DNAJB4 陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞漿出現(xiàn)彌漫性棕黃色或棕褐色顆粒。DNAJB4 蛋白表達(dá)判定標(biāo)準(zhǔn)：①按染色強(qiáng)度評(píng)分。未著色0 分，淺黃色1 分，棕黃色2分，棕褐色3 分。②按染色細(xì)胞百分率評(píng)分。陽(yáng)性細(xì)胞＜5%記0 分，[5%，25%)記1 分，[25%，50%)記2分，[50%，75%)記3分，陽(yáng)性細(xì)胞≥75%記為4分；將兩項(xiàng)評(píng)分結(jié)果相乘，＜2 分為DNAJB4 蛋白表達(dá)陰性，≥2分為DNAJB4蛋白表達(dá)陽(yáng)性。

1.2.5 TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)分析TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)通過(guò)TIMER算法估計(jì)6種免疫浸潤(rùn)(B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞)的豐度，為用戶(hù)提供可靠的免疫浸潤(rùn)水平[8]，具有全面分析和可視化功能。采用TIMER 的GENE 模塊分析DNAJB4基因表達(dá)與免疫細(xì)胞類(lèi)型以及腫瘤純度的相關(guān)性，SURVIVAL 模塊探討免疫細(xì)胞浸潤(rùn)對(duì)NSCLC 患者預(yù)后的影響，SCNA 模塊進(jìn)行DNAJB4 不同體細(xì)胞拷貝數(shù)變異的免疫細(xì)胞豐度比較。

1.2.6 評(píng)估DNAJB 在NSCLC 中的預(yù)后價(jià)值通過(guò)Kaplan-Meier plotter 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.kmplot.com/analysis/)分析DNAJB4與NSCLC患者預(yù)后生存的關(guān)系。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，配對(duì)t檢驗(yàn)比較DNAJB4基因在NSCLC 組織與正常組織中的表達(dá)差異，Graphpad Prism 5.0 繪圖；χ2檢驗(yàn)比較DNAJB4蛋白在NSCLC 組織與正常組織中的表達(dá)差異。采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)分析DNAJB4 表達(dá)、拷貝數(shù)變異與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平的相關(guān)性，采用Kaplan-Meier 生存曲線(xiàn)分析DNAJB4 和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)對(duì)NSCLC 患者預(yù)后的影響。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 DNAJB4基因在NSCLC組織中的表達(dá)水平

采用GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析DNAJB4基因的表達(dá)水平，結(jié)果見(jiàn)圖1。在肺腺癌(腫瘤組織483 例，正常組織347 例)中，DNAJB4基因的表達(dá)水平低于正常組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；在肺鱗癌(腫瘤組織486例，正常組織338例)中，DNAJB4基因的表達(dá)水平亦低于正常肺組織(P＜0.05)。

圖1 GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析DNAJB4基因在NSCLC組織中的表達(dá)水平

qPCR 檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。DNAJB4 mRNA 在NSCLC組織中的相對(duì)表達(dá)水平(0.51±0.35)顯著低于癌旁正常組織(1.14±0.68，P＜0.01)。免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3，可見(jiàn)DNAJB4 蛋白在NSCLC 組織中的陽(yáng)性率(26.67%，12/45)顯著低于癌旁正常組織(82.22%，37/45)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=27.998，P＜0.01)。

圖2 qPCR檢測(cè)DNAJB4 mRNA在NSCLC組織及癌旁正常組織中的表達(dá)

圖3 不同肺組織中DNAJB4蛋白的表達(dá)

2.2 NSCLC 中DNAJB4 的表達(dá)與6 種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)分析

TIMER分析結(jié)果見(jiàn)圖4。DNAJB4的表達(dá)與癌組織中B 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞的數(shù)量均明顯相關(guān)(均為P＜0.01)?？梢?jiàn)，DNAJB4 在NSCLC 的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)中起重要作用。

圖4 DNAJB4的表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平的相關(guān)性

免疫細(xì)胞對(duì)NSCLC患者預(yù)后影響的分析發(fā)現(xiàn)，在肺腺癌中，B細(xì)胞高浸潤(rùn)水平的肺腺癌患者存活時(shí)間較長(zhǎng)(Log-rankP＜0.01)，預(yù)后較好。樹(shù)突狀細(xì)胞不同浸潤(rùn)水平的兩組患者比較P值接近于0.05(Log-rankP=0.048)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖5。其中低浸潤(rùn)水平B 細(xì)胞是肺腺癌不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P＜0.05)，如表1。在肺鱗癌中，免疫細(xì)胞浸潤(rùn)對(duì)肺鱗癌患者預(yù)后無(wú)明顯影響，見(jiàn)圖5和表1。

表1 肺腺癌和肺鱗癌患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析結(jié)果

圖5 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)對(duì)NSCLC患者臨床預(yù)后的影響

本實(shí)驗(yàn)又發(fā)現(xiàn)，在肺腺癌中不同細(xì)胞的DNAJB4基因拷貝數(shù)變異對(duì)免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)水平均有影響，肺鱗癌中DNAJB4基因拷貝數(shù)變異對(duì)除CD8+T 細(xì)胞外的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平均有影響(圖6)，表明DNAJB4 在NSCLC 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)過(guò)程中發(fā)生一系列的生物學(xué)變化。

圖6 不同體細(xì)胞的DNAJB4基因拷貝數(shù)變異對(duì)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平的影響

2.3 DNAJB4基因在NSCLC中的預(yù)后價(jià)值

生存分析結(jié)果見(jiàn)圖7，顯示DNAJB4基因的表達(dá)水平與NSCLC 患者的總生存率[HR=0.76，95%CI(0.64，0.90)，P=0.001 7]顯著相關(guān)，而與NSCLC 患者的無(wú)病生存率[HR=1.02，95%CI(0.86，1.21)，P=0.78]、后期生存率[HR=0.95，95%CI(0.84，1.07)，P=0.39]無(wú)明顯相關(guān)關(guān)系。

圖7 DNAJB4基因不同表達(dá)水平NSCLC患者的生存曲線(xiàn)分析

3 討 論

DNAJB4基因的異常表達(dá)在細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)、侵襲、腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[9-10]。DNAJB4 作為熱休克蛋白家族成員，其表達(dá)和活性在細(xì)胞應(yīng)激期間增加，可抑制多種癌癥類(lèi)型的轉(zhuǎn)移和進(jìn)展[11]。由于E-鈣黏蛋白是抑制腫瘤侵襲的重要元素，DNAJB4 專(zhuān)門(mén)從突變的E-鈣黏蛋白中識(shí)別野生型，因此DNAJB4 的作用是抑制腫瘤侵襲，但其抑癌機(jī)制尚不完全清楚。據(jù)報(bào)道，DNAJB4參與了STAT/p21WAF1信號(hào)過(guò)程，通過(guò)上調(diào)STAT/p21WAF1 的表達(dá)以及下調(diào)CyclinD1 的表達(dá)減緩細(xì)胞分裂和腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，還有研究顯示CircRNA 0009043 可通過(guò)靶向miR-148a-3p/DNAJB4 軸抑制NSCLC 的發(fā)展[12]。這些研究發(fā)現(xiàn)，DNAJB4 通過(guò)某系列的信號(hào)通路發(fā)揮其特定的抑癌機(jī)制，調(diào)控NSCLC的進(jìn)展。

最新發(fā)現(xiàn)，DNAJB4通過(guò)激活Hippo信號(hào)通路促進(jìn)三陰性乳腺癌細(xì)胞凋亡，在乳腺癌細(xì)胞和組織中均低表達(dá)，且與預(yù)后不良相關(guān)[13]。DNAJB4通過(guò)減少基質(zhì)金屬蛋白酶2 和9(MMP-2 和MMP-9)的表達(dá)和活性來(lái)抑制黑色素瘤細(xì)胞的侵襲，且低水平DNAJB4 的患者預(yù)后較差[14]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)DNAJB4 在NSCLC組織中低表達(dá)，提示DNAJB4 影響NSCLC 的增殖和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)現(xiàn)象，在NSCLC 發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮其作用。

目前，腫瘤微環(huán)境及免疫靶向治療是NSCLC的研究熱點(diǎn)。微環(huán)境中的免疫狀態(tài)對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后判斷有著十分重要的意義[15]。研究表明，腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞是腫瘤免疫治療的決定性因素，而且免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平對(duì)患者預(yù)后判斷具有重要的參考價(jià)值。本研究進(jìn)一步分析了DNAJB4 表達(dá)與NSCLC 組織免疫微環(huán)境的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DNAJB4基因與多種免疫細(xì)胞(B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞)浸潤(rùn)水平相關(guān)，表明DNAJB4 參與NSCLC 細(xì)胞的免疫浸潤(rùn)過(guò)程，在免疫浸潤(rùn)中起重要作用。再者我們又發(fā)現(xiàn)DNAJB4基因拷貝數(shù)變異影響了免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)水平，表明了DNAJB4基因的多態(tài)性與免疫細(xì)胞發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，DNAJB4 參與NSCLC 中腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間的作用機(jī)制，調(diào)控NSCLC的進(jìn)展。

有證據(jù)表明，B 細(xì)胞是各種實(shí)體瘤中浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞的關(guān)鍵成分，幾乎占浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞總數(shù)的一半[16-17]。然而B(niǎo) 淋巴細(xì)胞在腫瘤免疫中既發(fā)揮促癌作用，又發(fā)揮抗癌作用。我們的研究發(fā)現(xiàn)，在LUAD中，B 細(xì)胞的浸潤(rùn)水平與DNAJB4基因表達(dá)及患者生存顯著相關(guān)，而且多因素Cox 回歸分析顯示低浸潤(rùn)水平B細(xì)胞與LUAD 患者更短的OS期相關(guān)。這說(shuō)明B細(xì)胞浸潤(rùn)影響LUAD 患者的生存，而DNAJB4基因參與了LUAD免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的調(diào)控，B細(xì)胞可作為L(zhǎng)UAD不良預(yù)后的獨(dú)立因素。

本研究進(jìn)一步探討了DNAJB4基因的表達(dá)與NSCLC 患者的預(yù)后，結(jié)果顯示DNAJB4基因的低表達(dá)只與NSCLC 患者的總生存期(OS)顯著相關(guān)。從圖7 可以看出高表達(dá)水平DNAJB4 的NSCLC 患者生存時(shí)間長(zhǎng)于低表達(dá)水平DNAJB4的患者，提示如果上調(diào)DNAJB4基因表達(dá)將延長(zhǎng)NSCLC患者的生存時(shí)間，這將為我們后續(xù)的DNAJB4 在NSCLC 中相關(guān)調(diào)控機(jī)制提供了新的思路和方向。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)DNAJB4 在NSCLC 組織中表達(dá)下調(diào)，參與NSCLC 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的過(guò)程，且與NSCLC 患者的不良預(yù)后相關(guān)。特別是，DNAJB4基因的表達(dá)與B 淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)水平相關(guān)，B 細(xì)胞浸潤(rùn)水平是LUAD 患者的預(yù)后判斷因素。DNAJB4 在NSCLC 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)中發(fā)揮重要作用，可作為一種潛在的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)及預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物，也可為后續(xù)NSCLC免疫治療和靶向治療提供參考。