許金花，李靜靜，吳國(guó)峰，任亞俊，王 雪，張騫云，*

(1.滄州市中心醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)二科，河北 滄州 061014；2.滄州市中心醫(yī)院麻醉二科，河北 滄州 061014)

肺癌死亡率在所有腫瘤中居第1 位，據(jù)GLOBOCAN 估計(jì)，2020 年全球新發(fā)的肺癌病例約220萬(wàn)，占全部惡性腫瘤的11.4%[1-2]。非小細(xì)胞肺癌(nonsmall cell lung cancer，NSCLC)約占肺癌總數(shù)的85%[3]。以順鉑聯(lián)合多西他賽為主的化療方案能夠有效抑制腫瘤，但會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重毒副作用[4]。目前NSCLC的5年生存率低于20%[5]。近年來(lái)，肺癌患者的個(gè)體化治療研究越來(lái)越深入，識(shí)別預(yù)測(cè)NSCLC患者預(yù)后的因素將很大程度上有助于評(píng)估預(yù)后分層及制定個(gè)體化治療方案，從而提高生存率。因此，需要找到能預(yù)測(cè)NSCLC 預(yù)后的指標(biāo)。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)屬于多肽超家族，能夠影響細(xì)胞增殖，與炎癥反應(yīng)相關(guān)[6]。調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)是新發(fā)現(xiàn)的T 細(xì)胞亞群，能夠維持機(jī)體免疫功能穩(wěn)定[7]。TNF-α和Treg 與NSCLC 的病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)，但是二者對(duì)患者預(yù)后判斷的價(jià)值尚未深入研究。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，miR-146a參與炎癥反應(yīng)，對(duì)肺炎、膿毒癥等疾病有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值[8-9]，但其與NSCLC 的預(yù)后報(bào)道較少。本研究擬探討血清中miR-146a 水平對(duì)NSCLC 患者預(yù)后判斷的價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 患者資料

選擇2020年6月—2021年11月在滄州市中心醫(yī)院住院治療的晚期NSCLC 患者162例，所有患者均簽署知情同意書。本研究已通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[2020-204-02(Z)]。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合NSCLC 的診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)病理確診；②臨床分期為IIIa、IIIb或IV期；③估計(jì)生存時(shí)間大于6個(gè)月；④卡氏評(píng)分(KPS)大于60 分。病例排除標(biāo)準(zhǔn)：①具有嚴(yán)重的心、肺、肝、腎等功能障礙；②腫瘤腦轉(zhuǎn)移；③有艾滋病、活動(dòng)性肺結(jié)核等傳染??；④存在嚴(yán)重感染性疾?。虎荽嬖诰耦惣膊。虎薮嬖谄渌麗盒阅[瘤。

1.2 試劑和儀器

1.2.1 試劑miRNA提取分離試劑盒購(gòu)自凱杰生物工程(深圳)有限公司，miRNA的cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司，miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海澤葉生物科技有限公司，miR-146a引物購(gòu)自上海生物工程公司，TNF-α酶聯(lián)免疫試劑盒購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司

1.2.2 儀器實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀購(gòu)自Applied Biosystems 公司，F(xiàn)ACB Canto II 流式細(xì)胞儀購(gòu)自BD公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 miR-146a 相對(duì)表達(dá)水平檢測(cè)所有受試者化療前和2 周期化療結(jié)束后均抽取空腹靜脈血3 mL，3 000 g 離心10 min，取上層血清。采用miRNA 提取分離試劑盒提取血清中miRNA，采用miRNA 的cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將miRNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書配制反轉(zhuǎn)錄體系，將配置好的體系放入實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃加熱1 min，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95 ℃變性30 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s；最后72 ℃加熱5 min 充分反應(yīng)。miR-146a 的引物序列如下：miR-146a 正向5'-ATCGCCTCTAGAAGTCG TCAGG-3'，反向5'-TCAGGCTACTGAAGGCTAG-3'；內(nèi)參采用U6基因，正向5'-GACTGATGCTCTGGCC GA-3'，反向5'-GTCGGGTCGAAGCATGG-3'。采用2-ΔΔCT法計(jì)算miR-146a的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.2 TNF-α濃度檢測(cè)血清收集同1.3.1。采用酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。準(zhǔn)備酶標(biāo)板，每孔分別滴加25 μL患者血清和標(biāo)準(zhǔn)品，37 ℃孵育15 min，再滴加100 μL 酶底物，反應(yīng)20 min，加入顯色液，避光15 min，最后滴加終止液。將酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀中，采用450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)溶液吸光度，計(jì)算TNF-α濃度。

1.3.3 Treg細(xì)胞比例檢測(cè)采集患者化療前和2周期化療結(jié)束后靜脈血3 mL于EDTA抗凝管中，搖勻，加入流式試管中，與單克隆抗體充分混勻，孵育10 min，滴加紅細(xì)胞裂解液500 μL，混勻，再滴加5 mL的PBS 緩沖液，3 000 g 離心5 min，小心倒掉上清，滴加300 μL 的PBS 重懸細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Treg細(xì)胞，使用FACS DIVA軟件分析Treg細(xì)胞比例。

1.3.4 隨訪治療結(jié)束后每3 個(gè)月隨訪1 次，采用門診、電話、網(wǎng)絡(luò)通信等方式進(jìn)行隨訪，共隨訪1 年，記錄患者生存情況，包括是否死亡及具體死亡時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料若符合正態(tài)分布，用±s表示。組間比較，采用t檢驗(yàn)。若不符合正態(tài)分布，用中位數(shù)和四分位間距表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用例數(shù)(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)。采用Pearson 方法分析相關(guān)性，并計(jì)算相關(guān)系數(shù)r。采用多因素logistic 回歸進(jìn)行預(yù)后分析，應(yīng)用逐步回歸法篩選獨(dú)立危險(xiǎn)因素，并計(jì)算比值比(odds ratio，OR)及95%置信區(qū)間(confidence interval，CI)。采用受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線計(jì)算曲線下面積(area under curve，AUC)，根據(jù)約登指數(shù)找出最佳臨界值。檢驗(yàn)水準(zhǔn)取雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 miR-146a、TNF-α水平和Treg細(xì)胞比例的檢測(cè)結(jié)果

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)NSCLC患者血清中的miR-146a 相對(duì)表達(dá)水平為(1.48±0.18)，采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)NSCLC患者血清中TNF-α濃度為(29.46±4.19)μg/L，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NSCLC患者的Treg細(xì)胞比例為(4.03±0.85)%。

2.2 miR-146a 相對(duì)表達(dá)水平與TNF-α濃度、Treg細(xì)胞比例的相關(guān)性

經(jīng)Pearson 相 關(guān) 分 析， 得 出NSCLC 患 者 的miR-146a 相對(duì)表達(dá)水平與TNF-α濃度呈正相關(guān)(r=0.651；P＜0.01，圖1A)，與Treg 細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān)(r=-0.676；P＜0.01，圖1B)。

圖1 miR-146a相對(duì)表達(dá)水平與TNF-α濃度、Treg細(xì)胞比例的相關(guān)性

2.3 miR-146a、TNF-α水平及Treg細(xì)胞比例對(duì)患者死亡的多因素logistic回歸分析結(jié)果

隨訪1 年后統(tǒng)計(jì)，miR-146a 低表達(dá)組在隨訪1 年內(nèi)死亡17人，miR-146a高表達(dá)組在隨訪1年內(nèi)死亡35人。TNF-α低濃度組在隨訪1 年內(nèi)死亡22 人，TNF-α高濃度組在隨訪1年內(nèi)死亡30人。Treg 細(xì)胞低比例組在隨訪1 年內(nèi)死亡33 人，Treg 細(xì)胞高比例組在隨訪1年內(nèi)死亡19人。我們采用多因素logistic回歸分析，納入miR-146a相對(duì)表達(dá)水平、TNF-α濃度和Treg細(xì)胞比例3 個(gè)變量進(jìn)入logistic 模型，結(jié)果如圖2 所示，miR-146a相對(duì)表達(dá)水平和TNF-α濃度為NSCLC患者死亡的危險(xiǎn)因素(OR=1.95、1.39；P＜0.01)。Treg 細(xì)胞比例為NSCLC患者死亡的保護(hù)因素(OR=0.53；P＜0.01)。

圖2 NSCLC患者死亡的多因素logistic回歸分析

2.4 miR-146a、TNF-α 水 平 及Treg 細(xì) 胞 比 例 的ROC曲線分析

如圖3 所示，我們通過(guò)ROC 曲線分析得出，miR-146a 相對(duì)表達(dá)水平的最佳閾值為1.239，此時(shí)敏感度為95.7%，特異度為92.6%，約登指數(shù)為0.883，AUC 為0.959， 95%CI為(0.934， 0.985)，P＜0.01。TNF-α濃度的最佳閾值為27.734 μg/L，此時(shí)敏感度為55.4%，特異度為87.0%，約登指數(shù)為0.424，AUC 為0.761，95%CI為(0.694，0.828)，P＜0.01。Treg 細(xì)胞比例的最佳閾值為5.159%，此時(shí)敏感度為65.7%，特異度為80.4%，約登指數(shù)為0.461，AUC為0.778，95%CI為(0.713，0.844)，P＜0.01。

圖3 miR-146a 相對(duì)表達(dá)水平、TNF-α 濃度和Treg 細(xì)胞比例對(duì)NSCLC患者預(yù)后的ROC曲線分析

3 討 論

肺癌病死率位于所有惡性腫瘤之首，NSCLC是肺癌最常見(jiàn)的一種類型[10]。導(dǎo)致NSCLC 發(fā)病的因素較多，如大氣污染、遺傳因素、肺部慢性炎癥、電離輻射、環(huán)境接觸、職業(yè)暴露、吸煙等，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞惡變，最終引發(fā)肺癌[11]。以順鉑聯(lián)合多西他賽為主的化學(xué)療法仍是當(dāng)下的主要治療手段[10]。但是化療藥物存在劑量限制性，有毒副作用，腫瘤細(xì)胞易產(chǎn)生耐藥性，這些因素均限制了化療的療效[12]。目前，NSCLC的5年生存率仍只有19.7%[5]。因此需要找到能提示預(yù)后的指標(biāo)，從而及早優(yōu)化治療方案，提高生存率。

TNF-α屬于一種蛋白超家族成員，其通過(guò)聚集成受體復(fù)合物發(fā)揮作用，通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，通常情況下TNF-α的活性受抑制，當(dāng)體內(nèi)有活性氧、整合素等物質(zhì)產(chǎn)生時(shí)就會(huì)激活并釋放[13]。此時(shí)TNF-α被細(xì)胞膜表面受體識(shí)別并結(jié)合，將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)，影響細(xì)胞增殖、分化和遷移，誘導(dǎo)產(chǎn)生多種炎癥因子，如白介素1(IL-1)、白介素6(IL-6)和多種趨化因子等，同時(shí)活化中性粒細(xì)胞，促進(jìn)血管生成，還可上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，促進(jìn)炎癥發(fā)生[14]。本研究結(jié)果表明，TNF-α濃度為NSCLC患者死亡的危險(xiǎn)因素，當(dāng)TNF-α濃度升高時(shí)，會(huì)促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生，從而加快腫瘤的進(jìn)展，提高NSCLC患者的死亡率。

Treg 細(xì)胞是T 細(xì)胞亞群的一種，具有負(fù)向調(diào)控免疫功能的作用，可以介導(dǎo)輔助性T 細(xì)胞的漂移，同時(shí)能夠分泌白介素4(IL-4)、白介素10(IL-10)和TNF-α等因子，維持機(jī)體免疫功能的穩(wěn)定，Treg 異常是導(dǎo)致促炎-抗炎失調(diào)的重要原因，當(dāng)Th17 正常時(shí)，TNF-α?xí)T導(dǎo)輔助性T0細(xì)胞分化為Treg細(xì)胞，通過(guò)自身免疫耐受機(jī)制，維持機(jī)體的免疫穩(wěn)定，但是當(dāng)Treg異常減少時(shí)，會(huì)引起免疫功能紊亂，使得促炎-抗炎平衡被打破，加速IL-17 的釋放，信號(hào)經(jīng)由免疫級(jí)聯(lián)效應(yīng)放大，促進(jìn)炎癥的產(chǎn)生和發(fā)展[15]。本研究結(jié)果表明，Treg 細(xì)胞比例為NSCLC 患者死亡的保護(hù)因素，當(dāng)Treg細(xì)胞比例升高時(shí)，會(huì)增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，從而抑制腫瘤進(jìn)展，降低NSCLC患者的死亡率。

近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，許多miRNA 均廣泛參與炎癥反應(yīng)，其表達(dá)水平與感染的嚴(yán)重程度和預(yù)后有關(guān)，其中miR-146a在肺炎、膿毒癥等炎癥性疾病都有很好的預(yù)后價(jià)值[8-9]，但是對(duì)于NSCLC的預(yù)后作用報(bào)道較少。本研究結(jié)果表明，多因素logistic 回歸分析顯示，miR-146a 相對(duì)表達(dá)水平是NSCLC 患者死亡的危險(xiǎn)因素，miR-146a水平升高會(huì)促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展，提高死亡率，且miR-146a 相對(duì)表達(dá)水平與TNF-α呈正相關(guān)，與Treg 呈負(fù)相關(guān)；ROC 曲線分析顯示，當(dāng)miR-146a 相對(duì)表達(dá)水平≥1.239 時(shí)，預(yù)示NSCLC 患者有較高的死亡風(fēng)險(xiǎn)。以上結(jié)果提示，miR-146a水平越高，患者的預(yù)后越差，水平越低則患者預(yù)后越好，其預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率明顯高于TNF-α和Treg，表明miR-146a對(duì)于NSCLC 具有很好的預(yù)后價(jià)值。蒙振發(fā)等[16]發(fā)現(xiàn)，miR-146a 通過(guò)上調(diào)TLR4/NF-κB 信號(hào)通路，促進(jìn)炎性細(xì)胞增殖，提高TNF-α等炎癥因子水平，引起胰腺組織的炎癥損傷。謝平安等[17]發(fā)現(xiàn)，miR-146a通過(guò)抑制Treg細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致Th17/Treg細(xì)胞比例失衡，引發(fā)促炎-抗炎機(jī)制紊亂，從而加重炎癥反應(yīng)。這與我們的研究結(jié)果一致。除了與TNF-α、Treg 細(xì)胞相互作用，miR-146a也存在其他促炎機(jī)制。周燕[18]的研究表明，miR-146a 能夠增加細(xì)胞間黏附分子-1 的表達(dá)，導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征患者炎癥加重，預(yù)后不良。王宏偉等[19]發(fā)現(xiàn)，miR-146a通過(guò)上調(diào)TNF-α水平，激活炎癥通路，促進(jìn)了銅綠假單胞菌等革蘭陰性菌感染，導(dǎo)致呼吸機(jī)相關(guān)肺炎加重。然而，也有少數(shù)研究認(rèn)為miR-146a 可能抑制炎癥。樊豐夷等[20]的研究表明，miR-146a水平上升可降低抑制急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織NALP3 的激活，從而抑制炎癥，與我們的結(jié)果存在爭(zhēng)議，原因可能是由于采用的agomiR-146a 和antagomiR-146a 未做激活和抑制效率驗(yàn)證，使得miRNA水平可能存在過(guò)表達(dá)或抑制不充分的情況；另一種可能是由于痛風(fēng)和NSCLC疾病間分子機(jī)制的差異導(dǎo)致。

本研究通過(guò)相關(guān)分析表明了miR-146a與多種炎癥和免疫指標(biāo)的相關(guān)性強(qiáng)度，采用多因素logistic回歸分析得出miR-146a 對(duì)NSCLC 患者的預(yù)后判斷價(jià)值，通過(guò)ROC 曲線得到miR-146a 的預(yù)測(cè)效能。本研究的局限在于僅研究了患者是否死亡這一個(gè)預(yù)后因素，在以后的研究中，可以考慮對(duì)患者進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪，采用生存分析研究miR-146a的遠(yuǎn)期預(yù)后價(jià)值。

綜上所述，miR-146a 在NSCLC 中的相對(duì)表達(dá)水平與TNF-α濃度呈正相關(guān)，與Treg 細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān)，是NSCLC患者死亡的危險(xiǎn)因素，對(duì)NSCLC預(yù)后有很好的預(yù)測(cè)價(jià)值。