何廣思，魏 潔，張 健

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬滁州醫(yī)院/滁州市第一人民醫(yī)院腫瘤科，安徽 滁州 239001)

胃癌(gastic cancer，GC)是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率居消化道惡性腫瘤之首[1]。大多數(shù)胃癌患者在確診時(shí)已處于疾病晚期，治療效果極差。目前臨床中常用于胃癌診斷的腫瘤標(biāo)記物有糖類抗原199(carbohydrate antigen 199，CA199)、CA724、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)等，但由于它們的特異度和靈敏度較低，導(dǎo)致其臨床價(jià)值不高[2-4]。因此，尋找具有高靈敏度和高特異性的腫瘤標(biāo)志物對(duì)胃癌的診斷及治療有重要的意義。

miRNA是一種非編碼單鏈RNA，通過與靶基因的非編碼區(qū)結(jié)合來控制轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)。相關(guān)研究[5]表明，由于不同腫瘤患者循環(huán)血中miRNAs 的表達(dá)存在差異，而且這種差異具有組織特異性和穩(wěn)定性，因此呈現(xiàn)差異表達(dá)的miRNAs 有望成為新的生物標(biāo)記物。但目前血清miRNA-183在胃癌中的診斷價(jià)值尚不明確。本研究采用逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR(reverse transcription quantitative real ting-PCR，RT-qPCR)檢測(cè)胃癌患者血清中miRNA-183 水平，探討miRNA-183 聯(lián)合CA199 檢測(cè)在胃癌的診斷和預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月—2021年12月在安徽醫(yī)科大學(xué)附屬滁州醫(yī)院經(jīng)由胃鏡診斷的52 例胃癌患者納入胃癌組，其中42例接受根治性手術(shù)，并經(jīng)手術(shù)病理再次明確診斷。胃癌患者年齡36～79 歲，中位年齡為64 歲；男性29人，女性23人；腫瘤組織學(xué)分級(jí)為中-高分化20 例，低-未 分 化32 例；TNM 分 期I～I(xiàn)I 期17 例，III～I(xiàn)V 期35 例；無淋巴轉(zhuǎn)移8 例(N0)，有淋巴轉(zhuǎn)移44例(N1～N3)；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移9例(M1)。選取同期本院胃鏡診斷為胃部良性病變患者40例納入對(duì)照組，其中萎縮性胃炎8 例，慢性淺表性胃炎21 例，胃息肉3 例，胃潰瘍8 例。對(duì)照組人群年齡40～72 歲，中位年齡61 歲；男22 人，女18 人。納入條件：所有胃癌患者均經(jīng)病理學(xué)診斷，根據(jù)美國(guó)腫瘤聯(lián)盟(AJCC)TNM(第7版)進(jìn)行分期。所有病人在取血標(biāo)本之前均未接受手術(shù)、放療、化療等其他治療。排除合并有其他惡性腫瘤、肝腎功能異常等情況。本研究經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)附屬滁州醫(yī)院的倫理學(xué)委員會(huì)審核通過(編號(hào)2021xkj205)，并經(jīng)過全體受試者的知情同意和簽字。

1.2 主要試劑與儀器

TRIzol LS 試劑和PCR 引物購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司，引物序列為：miRNA-183 上游，5'-CGGCAGTT CACAGTGGCTAA-3'，下游，5'-CAGAGCAGGGTCC GAGGTA-3'；內(nèi)參U6 上游，5'-GTCGGGTCCAGAG CAGGG-3'，下游，5'-CACGTTCGCTCTGGACCCG-3'。RR047A 型反轉(zhuǎn)錄試劑盒和9753A 型miRNA 提取試劑盒均購(gòu)自日本TaKaRa公司；CA199檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海透景生命科技股份有限公司。7900型PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó)ABI 公司，Architect ci8200SR 自動(dòng)免疫分析儀購(gòu)自美國(guó)雅培公司。

1.3 方 法

1.3.1 收集血清樣本采集受試者外周靜脈血5 mL于無RNA 試管中，以3 000 r/min 的速度離心10 min，然后靜置凝固0.5～1 h。將1.5 mL 上清液儲(chǔ)存在-80 ℃?zhèn)溆?。所有樣品必須在采集?個(gè)月內(nèi)使用。

1.3.2 RT-qPCR 檢測(cè)miRNA-183 的表達(dá)利用RT-qPCR 進(jìn)行miRNA-183 的表達(dá)檢測(cè)。采用miRNA提取試劑盒提取血清miRNA，通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的miRNA 反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，利用qPCR 擴(kuò)增進(jìn)行miRNA-183的表達(dá)檢測(cè)。反應(yīng)體系共20 μL，其中包括TaqMan Micro RNA Assay 1.00 μL，cDNA 1.33 μL，TaqMan 2×Universal PCR Master Mix 10 μL，ddH2O 7 μL。擴(kuò)增條件：93 ℃預(yù)變性10 min，93 ℃變性32 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸34 s，45 個(gè)循環(huán)。應(yīng)用熒光定量PCR儀自帶軟件分析結(jié)果，采用2-ΔΔCT法對(duì)miRNA-183相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行計(jì)算。

1.3.3 CA199 檢測(cè)采用Architect ci8200SR 自動(dòng)免疫分析儀及CA199檢測(cè)試劑盒通過化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)CA199。根據(jù)儀器的操作指南，可以導(dǎo)出和分析所需的CA199濃度數(shù)據(jù)。

1.4 隨訪及生存分析

通過門診電子病歷結(jié)合電話進(jìn)行隨訪，每3 個(gè)月隨訪1 次，截至2022 年12 月31 日?？偵嫫?overall survival，OS)定義為從手術(shù)之日到患者死亡或隨訪截止日期的時(shí)間。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，滿足正態(tài)分布，方差齊性的計(jì)量資料采用±s表示，兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)，多組比較采用方差分析，非正態(tài)分布的計(jì)量資料比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率或例數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用受試者工作特征(receiver operating characteristic curve，ROC)曲線，對(duì)miRNA-183、CA199 的診斷效能ROC曲線下面積(area under the curve，AUC)進(jìn)行分析。采用Kaplan-Meier 法進(jìn)行生存曲線分析，以對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)(log-rank test)計(jì)算生存曲線間的差異。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miRNA-183 在胃癌患者及健康人群血清中的表達(dá)水平

RT-qPCR 結(jié)果顯示，對(duì)照組血清中miRNA-183的相對(duì)表達(dá)量為3.61±1.89，胃癌組為4.59±1.63，胃癌組的miRNA-183表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)。

2.2 miRNA-183與CA199的表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

根據(jù)患者性別、年齡、原發(fā)灶部位、組織學(xué)類型、T 分期、TNM 分期和淋巴結(jié)是否發(fā)生轉(zhuǎn)移等進(jìn)行分組統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示，組織病理分型為低-未分化、T3～T4 期以及TNM 分期為III～I(xiàn)V 期患者血清中miRNA-183 的表達(dá)水平分別顯著高于中-高分化類型、T1～T2 和TNM 分期為I～I(xiàn)I 期的患者，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.01)。而不同年齡、性別、原發(fā)灶部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者血清中miRNA-183表達(dá)水平的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＞0.05)。組織病理分型為低-未分化、TNM 分期為III～I(xiàn)V 期患者CA199 水平分別顯著高于中-高分化、TNM 分期為I～I(xiàn)I 期的患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.01)。而不同年齡、性別、原發(fā)灶部位、T 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者血清中CA199 表達(dá)水平的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＞0.05)，見表1。

表1 miRNA-183與CA199表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

2.3 miRNA-183 聯(lián)合CA199 診斷胃癌的ROC 曲線分析

在約登指數(shù)最大值時(shí)miRNA-183 相對(duì)表達(dá)量為4.11，其診斷胃癌的敏感度及特異度分別為67.31%和80%，AUC 為0.771，95%置信區(qū)間為(0.672，0.853)，P＜0.05；在約登指數(shù)最大值時(shí)CA199 的相對(duì)表達(dá)量為46.17 U/mL，其診斷胃癌的敏感度及特異度分別為53.8%和87.5%，AUC 為0.724，95%置信區(qū)間為(0.621，0.812)，P＜0.05。聯(lián)合檢測(cè)血清miRNA-183與CA199診斷胃癌對(duì)應(yīng)的敏感度及特異度分別為76.92%和87.5%，AUC 為0.882，95%置信區(qū)間為(0.798，0.940)，P＜0.05。miRNA-183 聯(lián)合CA199 診斷胃癌的AUC大于miRNA-183、CA199獨(dú)立診斷。見圖1。

圖1 血清miRNA-183、CA199診斷胃癌的ROC曲線

2.4 生存分析

根據(jù)胃癌患者血清中miRNA-183 的最佳臨界值4.11，52例胃癌患者被分為miRNA-183高表達(dá)組和低表達(dá)組。Kaplan-Meier 分析顯示，miRNA-183 高表達(dá)組患者的OS 為(34.504±2.897)個(gè)月，低表達(dá)組患者的OS為(47.408±3.057)個(gè)月，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。根據(jù)胃癌患者血清中CA199 水平的最佳臨界值，選取miRNA-183和CA199均高表達(dá)的胃癌患者為雙高表達(dá)組，其余患者為非雙高表達(dá)組，Kaplan-Meier 分析顯示，雙高表達(dá)組患者的OS 為(31.344±3.377)個(gè)月，非雙高表達(dá)組患者的OS 為(45.725±2.876) 個(gè)月，雙高表達(dá)組患者的OS 明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖2。

圖2 血清中miRNA-183和CA199表達(dá)水平與胃癌患者總生存率的關(guān)系

3 討 論

近年來，鑒于miRNAs的獨(dú)特性，miRNAs作為惡性腫瘤生物標(biāo)志物的研究不斷深入。研究[6-8]表明，腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中miRNAs 發(fā)揮著重要作用，有成為腫瘤篩查的生物學(xué)標(biāo)記物及靶向治療靶點(diǎn)的可能，尤其是與傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)記物聯(lián)合檢測(cè)已成為腫瘤診斷、療效及預(yù)后預(yù)測(cè)的重要手段之一。miRNA-183家族是一組重要的調(diào)控基因，在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中扮演著關(guān)鍵的角色。miRNA-183 家族由miRNA-183、miRNA-96 和miRNA-182 組成，它們的基因位于人類7 號(hào)染色體。研究發(fā)現(xiàn)：在宮頸癌、腎透明細(xì)胞癌等多種腫瘤中miRNA-183的表達(dá)水平被發(fā)現(xiàn)有不同程度的降低[9-10]。這一發(fā)現(xiàn)引發(fā)了對(duì)miRNA-183 在腫瘤抑制中潛在作用的關(guān)注。然而，近來的研究也發(fā)現(xiàn)，在某些腫瘤類型中，如舌癌、間皮瘤等，miRNA-183卻顯示出促癌效應(yīng)[11-12]。這種矛盾的結(jié)果表明，miRNA-183 在不同腫瘤中可能具有不同的作用機(jī)制，這一差異主要取決于其所調(diào)控的下游基因的不同。miRNA-183 通過與特定的下游基因相互作用，可以對(duì)細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)過程進(jìn)行調(diào)控。Lin等[13]研究表明miRNA-183作腫瘤相關(guān)的miRNA參與調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲。王婭南等[14]研究結(jié)果提示胃癌患者腫瘤組織和胃癌細(xì)胞株中miRNA-183-5P 水平顯著降低，說明了miRNA-183在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌患者血清miRNA-183水平顯著高于胃部良性疾病患者。進(jìn)一步分析miRNA-183表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系，結(jié)果顯示：低-未分化組織學(xué)類型、T3～T4 期以及TNM 分期為III～I(xiàn)V期患者癌組織中miRNA-183的表達(dá)水平分別顯著高于中-高分化類型、T1～T2和TNM分期為I～I(xiàn)I期的患者(P＜0.01)。由此推測(cè)，miRNA-183 可能成為胃癌病情評(píng)估和診斷的重要分子標(biāo)志物。同時(shí)，本研究中血清miRNA-183 水平與患者性別、年齡、腫瘤部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無明顯相關(guān)，因此，血清miRNA-183水平在反映原發(fā)性腫瘤病灶、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及其他疾病特征方面受到限制。原因可能與研究樣本量小有關(guān)。目前，有研究表明，miR-183-5p通過干預(yù)基因表達(dá)促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，與癌癥患者的預(yù)后相關(guān)。例如，Li等[15]的研究表明，miR-183-5p在胃癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，其表達(dá)水平與TNM 分期、腫瘤大小、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，這與本研究結(jié)果相似。miR-183-5p在甲狀腺癌中的高表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和抗凋亡[16]；此外，Yan 等[l7]的研究認(rèn)為miR-183-5p在肝癌細(xì)胞和組織中高表達(dá)，并與一些臨床病理指標(biāo)相關(guān)。但是，目前關(guān)于miRNA-183促進(jìn)胃癌發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制仍在探索之中，仍需要進(jìn)一步的研究來驗(yàn)證。

已知多種糖類抗原以及CEA均為診斷胃癌的生物標(biāo)記物，但它們的敏感性和特異性不高。本研究中單獨(dú)應(yīng)用CA199 診斷胃癌的敏感度和特異度分別為53.8%和87.5%，與蔡曉娟等[18-19]研究結(jié)果相近。在臨床診斷中ROC 曲線下面積＞0.9 表示診斷價(jià)值高，0.7～0.9 表示診斷價(jià)值較好，0.5～0.7 表示診斷價(jià)值較低[20]。本研究CA199 診斷胃癌的AUC 為0.724，診斷價(jià)值并不高，單獨(dú)檢測(cè)CA199 不足以預(yù)測(cè)胃癌。因此，CA199 指標(biāo)聯(lián)合其他分子標(biāo)記物的檢測(cè)已成為目前提升胃癌診斷準(zhǔn)確性的新型研究方向。本研究另一結(jié)果表明miRNA-183 診斷胃癌敏感度和特異度為67.31%和80%，AUC 為0.771。雖然miRNA-183 單獨(dú)診斷胃癌的特異度和敏感度并不令人滿意，但是當(dāng)miRNA-183 與CA199 聯(lián)合檢測(cè)后診斷胃癌的敏感度及特異度提升至76.92%和87.5%，AUC為0.882。因此，在胃癌診斷中將miRNA-183與CA199聯(lián)合應(yīng)用可能有助于胃癌的臨床篩查和輔助診斷。

另外，本研究的生存分析結(jié)果顯示，miRNA-183高表達(dá)組患者生存時(shí)間明顯短于miRNA-183 低表達(dá)組，而且miRNA-183與CA199均高表達(dá)的患者預(yù)后更差，提示兩者的高表達(dá)代表胃癌的進(jìn)展程度和預(yù)后的惡化，預(yù)示著miRNA-183和CA199可以作為聯(lián)合生物標(biāo)志物，用于胃癌患者的預(yù)后預(yù)測(cè)。

綜上所述，由于胃癌患者血清中miRNA-183的表達(dá)水平明顯高于胃部良性病變患者，與CA199聯(lián)合檢測(cè)可提高診斷效率。此外，胃癌血清中miRNA-183的表達(dá)水平與腫瘤的T分期、TNM 分期、組織學(xué)分級(jí)以及患者的預(yù)后相關(guān)，因此miRNA-183 對(duì)于胃癌診斷、病情評(píng)估、預(yù)后有著較高的臨床價(jià)值，但這一結(jié)果還需要大樣本研究的證實(shí)。