王意濃，劉國政，謝觀超，馮 丹，李 賽，蔡 巖，張 鈺，王明榮，郝佳潔

(國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院，分子腫瘤學(xué)全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

食管癌位居全球癌癥死因第6位[1]；中國作為全球食管癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)最高的地區(qū)之一，每年食管癌新發(fā)病例數(shù)約占全球的53.7%。其中，食管鱗癌病例數(shù)占食管癌病例總數(shù)的90.4%[2]。腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是食管鱗癌相關(guān)死亡的主要原因，我國食管鱗癌早期診斷率低，總體預(yù)后比較差[3]。因此，尋找食管鱗癌新的診斷標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn)，對食管鱗癌患者的治療以及預(yù)后十分重要。

膜聯(lián)蛋白家族(annexins，ANXs)在動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞中廣泛表達(dá)，目前已鑒定出超過160 個(gè)成員。ANXA2作為該家族蛋白中最主要的成員之一，已被證明在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，并與腫瘤的分期及預(yù)后相關(guān)[4]。本課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)，ANXA2 在食管鱗癌細(xì)胞系中高表達(dá)，使用siRNA瞬時(shí)敲降A(chǔ)NXA2后顯著減弱食管鱗癌細(xì)胞的侵襲遷移和肺轉(zhuǎn)移能力；機(jī)制研究表明，ANXA2 可以通過上調(diào)MYC 蛋白表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的侵襲遷移[5]。

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)包含規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)和具有切割DNA雙鏈作用的CRISPR相關(guān)蛋白9(CRISPR-associated protein 9，Cas9)組成，是由RNA 指導(dǎo)Cas9 核酸酶編輯靶向基因的技術(shù)[6]。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)由向?qū)NA(guide RNA，gRNA)和Cas9 蛋白形成復(fù)合體，gRNA 與目標(biāo)基因的靶序列通過堿基互補(bǔ)配對原則進(jìn)行配對，Cas9蛋白在目標(biāo)DNA序列的特異性識別位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)切割，從而導(dǎo)致雙鏈斷裂[7]。CRISPR 編輯技術(shù)已在臨床前和臨床研究中使用，用于有害突變基因的敲除和錯(cuò)誤編碼序列的修復(fù)[8-9]，使用該技術(shù)還可對腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的基因進(jìn)行敲除[9]，為腫瘤治療的基礎(chǔ)研究和臨床轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。與傳統(tǒng)的RNA干擾技術(shù)相比，該系統(tǒng)可產(chǎn)生穩(wěn)定的基因敲除，并且脫靶效應(yīng)也明顯減少[10]。

本研究使用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)，借助慢病毒載體敲低食管鱗癌KYSE30 和KYSE150 細(xì)胞中的ANXA2基因，并初步探索了敲低ANXA2后食管鱗癌細(xì)胞表型的變化，為深入研究ANXA2 的生物學(xué)功能及其高表達(dá)促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞侵襲遷移的作用機(jī)制提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

食管鱗癌細(xì)胞KYSE30 和KYSE150 均由日本東京大學(xué)Shimada 教授惠贈(zèng)，分別使用含有10%胎牛血清(Newzerum)的RPMI-1640 培養(yǎng)基(北京細(xì)工生物公司)，置于CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scientific 公司)中培養(yǎng)。人胚腎細(xì)胞HEK293FT(美國Invitrogen 公司)使用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基(北京細(xì)工生物公司)，添加1% L-型谷氨酰胺、1%非必需氨基酸以及1% G418(美國Gibco 公司)，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建

1.2.1 gRNA 靶點(diǎn)及寡核苷酸鏈序列在Addgene網(wǎng)站中查詢及下載文獻(xiàn)[11-12]中報(bào)道的ANXA2基因及對照CRISPR gRNA(https://www.addgene.org/pooled-library/zhang-human-gecko-v2/)，在正義鏈模板的5'端添加CACCG，反義鏈模板的5'端添加AAAC，與BsmBI 酶切后形成的黏性末端互補(bǔ)。選取了ANXA2 gRNA 共6對寡核苷酸，序列見表1。

表1 對照及ANXA2 gRNA寡核苷酸單鏈名稱及序列

1.2.2 gRNA 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建將合成的gRNA 正義鏈和反義鏈粉末(北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司)稀釋至100 μmol/L。退火體系：10×T4 DNA Ligase Buffer(NEB) 1 μL，正義鏈1 μL，反義鏈1 μL，T4 PNK(NEB) 0.5 μL， ddH2O 6.5 μL。 退 火 條 件：37 ℃、30 s；95 ℃、5 min；5 ℃/min 梯度降溫至25 ℃，-20 ℃保存。然后用BsmBI 酶切載體：10×NEB Buffer 5 μL、pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFPPuro&Zeocin 載體(簡稱pLenti-U6-gRNA-Cas9 載體；上海碧云天生物技術(shù)有限公司) 3 μg、BsmBI-v2(NEB)1 μL、加ddH2O 至50 μL。酶切條件：55 ℃、14 min；80 ℃、20 min。接著使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天根生化科技有限公司)回收酶切片段。

下一步進(jìn)行酶切載體與雙鏈gRNA 連接：酶切載體50 ng，2×Quick Ligase Buffer(NEB) 5 μL，雙鏈gRNA 1 μL，加ddH2O 至10 μL，最后加入1 μL Quick Ligase，25 ℃、15 min。最后進(jìn)行連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化及鑒定：將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Stbl3感受態(tài)細(xì)胞(北京全式金生物技術(shù)股份有限公司)，均勻涂布至含100 μg/mL 氨芐青霉素的固體LB 培養(yǎng)基，37 ℃過夜培養(yǎng)，每個(gè)靶點(diǎn)挑取3 個(gè)單菌落，加入含100 μg/mL 氨芐青霉素的液體LB 培養(yǎng)基，200 r/min，37 ℃震蕩培養(yǎng)過夜。菌液經(jīng)PCR、瓊脂糖凝膠電泳及Sanger 測序驗(yàn)證(測序引物5'-CAAGGCTGTTAGAGAGATAA-3'，由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司完成)。測序完成后，使用質(zhì)粒提取試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)提取質(zhì)粒。

1.3 慢病毒制備

將HEK293FT細(xì)胞接種至6 cm平皿中，待細(xì)胞密度長至50%～70%。將CRISPR質(zhì)粒6 μg、慢病毒包裝輔 助 載 體psPAX2 和pMD2G 各3 μg 混 合，按 照J(rèn)etPRIME 轉(zhuǎn) 染 試 劑 說 明 書(PolyPlus 公 司) 轉(zhuǎn) 染HEK293FT 細(xì)胞，48 h 后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，0.22 μm 過濾器過濾除菌，使用病毒滴度檢測卡(北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司)檢測病毒滴度，保存于-80 ℃冰箱備用。

1.4 慢病毒感染細(xì)胞

分別將KYSE30 和KYSE150 細(xì)胞接種至96 孔板，待細(xì)胞密度長至30%～50%，根據(jù)病毒滴度加入含70%病毒培養(yǎng)上清的培養(yǎng)基。慢病毒、25×感染增強(qiáng)試劑P(上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司)進(jìn)行感染，感染20 h 后更換為RPMI-1640 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后，使用含2 μg/mL嘌呤霉素(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)的RPMI-1640培養(yǎng)基篩選3～4 d。

1.5 Western blot實(shí)驗(yàn)

分別收集KYSE30 和KYSE150 細(xì)胞加入胰蛋白酶(美國Thermo Fisher Scientific 公司)進(jìn)行消化，1 000 r/min離心5 min，棄上清獲得細(xì)胞沉淀，使用RIPA裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)提取細(xì)胞蛋白，使用BCA 蛋白定量試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)進(jìn)行定量，取15 μg蛋白樣品，加入5×上樣緩沖液(上海碧云天公司)，98 ℃金屬浴變性10 min。聚丙烯酰胺凝膠電泳90 min，使用濕轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)儀將蛋白從分離膠轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗后4 ℃孵育過夜，一抗包含：ANXA2 抗 體(Abcam 公 司，ab189473)、MYC 抗 體(Abcam 公 司，ab32072)、GAPDH 抗 體(Cell Signaling Technology 公司，2118)；使用洗滌緩沖液TBST 洗膜4次，每次6 min，加入山羊抗兔二抗(北京中杉金橋，ZB-2301)，室溫孵育1 h，使用洗滌緩沖液TBST洗膜4 次，每次6 min，使用ECL 化學(xué)發(fā)光液(美國Thermo Fisher Scientific公司)進(jìn)行顯影、曝光。

1.6 總RNA提取和實(shí)時(shí)定量PCR檢測

使用RNA 提取試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)提取KYSE30細(xì)胞總RNA，將得到的RNA作為模板，使用HiFi Script cDNA 合成試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用TB Green?Premix ExTaqTM試劑盒(日本TaKaRa 公司)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR(reverse transcription quantitative real-time PCR，RT-qPCR)實(shí)驗(yàn)，mRNA相對表達(dá)量以2-ΔΔCT表示，具體操作步驟參照試劑說明書進(jìn)行。ANXA2 及內(nèi)參GAPDH 引物分別為：ANXA2，上游5'-GAGCGGGATGCTTTGAACATT-3'，下游5'-TAGGCGAAGGCAATATCCTGT-3'；GAPDH，上游5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，下游5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。

1.7 細(xì)胞遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)

1.7.1 遷移實(shí)驗(yàn)從24 孔板取出Transwell 小室(美國Corning 公司)，向孔內(nèi)加入700 μL 含20%血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，向小室內(nèi)加入200 μL不含血清的培養(yǎng)基，室溫放置10 min后棄去液體。細(xì)胞消化離心后使用PBS 清洗細(xì)胞，重懸并計(jì)數(shù)。向小室內(nèi)分別加入KYSE30和KYSE150細(xì)胞5×104個(gè)(體積200 μL)，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12～24 h。取出上室，用無菌棉球擦拭上室，使用PBS清洗兩次，晾干后加入固定液(甲醇和丙酮體積比1∶1)固定20 min，棄去固定液，加入甲醇稀釋的0.5%結(jié)晶紫染色30 min，流水清洗。晾干，滴加樹脂后用蓋玻片封片，鏡下拍照，計(jì)數(shù)。

1.7.2 侵襲實(shí)驗(yàn)將基質(zhì)膠(美國Corning公司)用無血清無抗生素RPMI-1640 培養(yǎng)基按照1∶33 的比例稀釋，取50 μL 加至Transwell 小室中，室溫靜置1 h，其余操作同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。

1.8 細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)

收集KYSE30 細(xì)胞消化后計(jì)數(shù)，將1 000 個(gè)細(xì)胞均勻接種于6 孔板中，使用RPMI-1640 培養(yǎng)基于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周后，棄掉培養(yǎng)基，使用甲醇固定30 min，結(jié)晶紫染色10 min，拍照并計(jì)數(shù)集落數(shù)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以上所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3 次，采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。兩組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ANXA2基因敲低gRNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Puro&Zeocin質(zhì)粒具有2 個(gè)BsmBI 內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)，位點(diǎn)之間為相距1 885 bp的填充序列(圖1A)。將ANXA2的6對經(jīng)退火處理的gRNA 寡核苷酸雙鏈與酶切后的載體連接，轉(zhuǎn)化Stbl3感受態(tài)細(xì)菌，篩選出陽性克隆。對照及各靶點(diǎn)單克隆菌液Sanger 測序結(jié)果顯示，對照及6 個(gè)靶點(diǎn)序列均正確插入pLenti-U6-gRNA-Cas9 載體，插入序列的位置、方向及序列與理論一致(圖1B)，表明對照及ANXA2基因敲低gRNA表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 對照及ANXA2基因敲低gRNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

2.2 穩(wěn)定敲低細(xì)胞中ANXA2的表達(dá)顯著降低

鑒于ANXA2 在食管鱗癌KYSE30 中表達(dá)水平較高，我們使用該細(xì)胞進(jìn)行病毒感染及嘌呤霉素篩選，以獲得敲低ANXA2 的KYSE30 細(xì)胞。利用Western blot 檢測了細(xì)胞中ANXA2 蛋白表達(dá)情況，結(jié)果見圖2，顯示具有g(shù)RNA 靶點(diǎn)4～6 的細(xì)胞中ANXA2 的蛋白水平較對照顯著降低，而在具有g(shù)RNA 靶點(diǎn)1～3 的細(xì)胞中未見明顯改變。Western blot 結(jié)果還顯示，具有ANXA2 敲低gRNA 靶 點(diǎn)5 和6 的KYSE30 細(xì) 胞中MYC蛋白的表達(dá)顯著降低，與此前使用siRNA 敲降[5]的結(jié)果一致，而靶點(diǎn)1～4 gRNA中MYC蛋白水平未見明顯變化。具有g(shù)RNA 靶點(diǎn)5 和6 的穩(wěn)定敲低細(xì)胞中ANXA2的mRNA水平顯著降低。以上結(jié)果表明，穩(wěn)定敲低ANXA2基因的KYSE30細(xì)胞系構(gòu)建成功，且gRNA靶點(diǎn)5 和6 的細(xì)胞中ANXA2 和MYC 均顯著下調(diào)。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均使用這兩個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行。

圖2 ANXA2敲低gRNA靶點(diǎn)的篩選

2.3 敲低ANXA2 顯著降低食管鱗癌細(xì)胞的遷移侵襲和集落形成能力

我們進(jìn)一步增加構(gòu)建了食管鱗癌細(xì)胞KYSE150的ANXA2 穩(wěn)定敲低細(xì)胞(圖3 和圖4)，并檢測了敲低ANXA2 對 食 管 鱗 癌KYSE30 和KYSE150 細(xì) 胞 的ANXA2 蛋白和mRNA 表達(dá)水平以及對細(xì)胞表型的影響。結(jié)果顯示，與對照組相比，敲低ANXA2 后，食管鱗癌KYSE30 和KYSE150 細(xì)胞的ANXA2 蛋白和mRNA 表達(dá)水平均顯著降低(P＜0.05 或P＜0.01)，而且兩種細(xì)胞的遷移、侵襲能力均顯著下降(均為P＜0.01，圖5)，KYSE30 細(xì)胞的集落形成能力顯著減弱(P＜0.01，圖6)，提示食管癌細(xì)胞的惡性表型受到了明顯抑制。

圖3 Western blot檢測ANXA2敲低細(xì)胞中ANXA2蛋白表達(dá)情況

圖4 qPCR檢測ANXA2敲低細(xì)胞中ANXA2 mRNA表達(dá)情況

圖5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測ANXA2敲低對細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

圖6 KYSE30細(xì)胞集落形成圖

3 討 論

ANXA2蛋白在人體細(xì)胞內(nèi)廣泛存在，具有多種生物學(xué)功能。ANXA2 異常表達(dá)參與惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥等多種過程，其在調(diào)控惡性腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵信號通路中發(fā)揮重要作用[4]。越來越多的研究表明，ANXA2可能成為新的預(yù)后判斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[13]。近年來，基于ANXA2的小分子抑制劑、靶向療法和免疫療法陸續(xù)被報(bào)道[14-16]，其在臨床治療中的應(yīng)用價(jià)值尚待進(jìn)一步深入探索。

研究表明，ANXA2高表達(dá)可以作為食管鱗癌的不良預(yù)后標(biāo)志物[5]，其表達(dá)升高與食管鱗癌細(xì)胞的惡性表型相關(guān)，可以通過多種信號通路促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的侵襲運(yùn)動(dòng)[5，17]。這提示ANXA2的異常變化在腫瘤臨床中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

CRISPR/Cas9 是一種高效、簡單、廉價(jià)的實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)基因編輯方法。該技術(shù)使基因功能和蛋白質(zhì)功能研究變得更加便捷，基于CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)的疾病治療方法也取得了飛速進(jìn)展[18]。近些年，研究者們從Cas9蛋白、向?qū)NA、轉(zhuǎn)染方法等方面進(jìn)行了改進(jìn)，并降低了脫靶效應(yīng)[19]。以往關(guān)于ANXA2基因在腫瘤中的作用研究絕大多數(shù)是使用RNA 干擾技術(shù)(包括siRNA 和shRNA)進(jìn)行的。關(guān)于ANXA2 敲除的研究目前尚少，有學(xué)者使用同源重組技術(shù)在人結(jié)直腸癌細(xì)胞中敲除ANXA2 后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的生長和運(yùn)動(dòng)均減緩[20]；利用CRISPR/Cas9 技術(shù)敲除中國倉鼠卵巢細(xì)胞中的ANXA2，可以減少重組治療蛋白生產(chǎn)過程中宿主細(xì)胞蛋白的污染[21]。然而，目前尚無使用CRISPR/Cas9 技術(shù)敲除食管鱗癌細(xì)胞中ANXA2基因的研究報(bào)道。因此，針對ANXA2 的基因編輯和潛在治療應(yīng)用有待探索。

本研究使用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)快速高效地構(gòu)建了ANXA2 穩(wěn)定敲低的慢病毒包裝載體，并感染細(xì)胞獲得ANXA2基因穩(wěn)定敲低的食管鱗癌細(xì)胞。我們篩選了6 個(gè)基因敲低靶點(diǎn)，利用Western blot 和RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)檢測基因敲低后細(xì)胞內(nèi)ANXA2 的蛋白和mRNA 水平的變化，最終確定兩個(gè)敲除效果較好的靶點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ANXA2 敲除細(xì)胞中癌基因MYC蛋白表達(dá)降低，且細(xì)胞的遷移、侵襲以及集落形成能力均明顯減弱。以上結(jié)果與本課題組之前報(bào)道的使用siRNA 瞬時(shí)敲降處理對細(xì)胞表型和下游分子表達(dá)的影響均一致[5]。我們還觀察到，在ANXA2表達(dá)降低最顯著的細(xì)胞中，仍能檢測到少量ANXA2 的表達(dá)。推測可能的原因?yàn)椋涸诓《靖腥炯?xì)胞的過程中，并非所有細(xì)胞的感染效率均一致，且整合于基因組的效率也可能不同，從而導(dǎo)致不同細(xì)胞中ANXA2 表達(dá)量的差異。后續(xù)研究將進(jìn)一步對上述細(xì)胞分離單克隆，以獲得敲低效果更好的細(xì)胞，同時(shí)還將構(gòu)建敲低ANXA2的其他食管鱗癌細(xì)胞模型。

綜上所述，本研究使用CRISPR/Cas9 構(gòu)建了穩(wěn)定敲低ANXA2基因的食管鱗癌KYSE30 和KYSE150 細(xì)胞，顯著抑制了細(xì)胞的惡性表型，為進(jìn)一步闡明ANXA2 促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞惡性的作用機(jī)制以及基于ANXA2通路新靶點(diǎn)的研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。